Name: characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לחברי המעבדה הארווי קושינג נוירו אונקולוגיה לתמיכה וביקורת בונה. עבודה זו נתמכת על ידי NINDS מענקים K12NS80223 ו K08NS101091 ל P. P.

1. אפיון מירכי הקשורים פונקציונלית בגלינובלסטומה
<ol><li>ניתוח של ביטוי נרחב miRNA הדיפרנציאלי במוח גלנובלסטומה
	<ol>
<li>ראשית, בדוק את מירנאס החוצה. באופן משמעותי ביותר בגידול ניתן להשיג זאת באמצעות לפחות שלוש שיטות שונות:<ol>
<li>שלי הגנום אטלס הסרטן, נמצא ב https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/researc...

<ol>
	<li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer's+Disease:+A+Meta-Analysis+Approach.">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767 (2018).</li><li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs:+tiny+regulators+with+great+potential.">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li><li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways.">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li><li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124,+&#8722;128,+and+&#8722;137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network.">miR-124, &#8722;128, and &#8722;137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li><li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma.">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).</li><li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs.">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li><li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray.">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li><li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells.">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li><li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency.">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).</li><li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes.">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA.org+resource:+targets+and+expression.">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li><li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRD(B)+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations.">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li><li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-miRPath+v3.0:+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support.">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li><li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2017.">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li><li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+from+miRNA+sequences+to+function.">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vienna+RNA+Package+2.0.">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).</li><li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly:+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology.">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).</li><li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma.">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li><li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions.">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex.">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li><li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs.">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li><li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron.">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li><li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector.">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).</li><li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection.">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li></ol>

פרוטוקול זה מבוסס על הרעיון כי במקום לתפקד בבידוד, miRNAs הם רלוונטיים ביולוגית על ידי עבודה בקבוצות, וקבוצות אלה נקבעים באמצעות ההקשרים הסלולריים הספציפיים26. כדי להצדיק גישה זו מנקודת מבט טרנסלתית, פרוטוקול המשך טיפול המאפשר בילוי של דפוס זה multi-miRNA בתאים/רקמות הוא הציג. זה אפשר?...

mirnas מציעים הזדמנות ללא תחרות לפיתוח של גישה טיפולית רחבה למחלות רבות1,2,3, כולל סרטן4,5. זה מבוסס על מספר תכונות ייחודיות של מולקולות ביולוגיות אלה, כולל גודל קטן שלהם6, biogenesis פשוט7, ונטייה טבעית לתפקד באסוציאציה8. מחלות רבות מתאפיינות בביטויים ספציפיים של ביטוי miRNA, אשר לעתים קרובות להתכנס על התקנה של פונקציות ביולוגיות מורכבות9. מטרת שיטה זו היא הראשונה להגדיר אסטרטגיה כדי לזהות קבוצות של miRNAs הקשורים בסינרגיה לפונקציות סלולריות ספציפיות. כתוצאה מכך, הוא מספק אסטרטגיה להקמת מחדש של שילובים כאלה של miRNA במחקרים ויישומים במורד הזרם.
שיטה זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של miRNAs מרובים בבת אחת, מינוף על המיקוד הסימולטני שלהם של מספר רב של mRNAs, ובכך ללכוד את הנופים המורכבים של מחלות. גישה זו הועסק לאחרונה כדי להגדיר קבוצה של שלושה miRNAs כי 1) הם בו מוסתות בו בסרטן המוח 2) להראות דפוס חזק ביטוי שיתוף במהלך בידול עצבי, כמו גם בתגובה ללחץ גנוטוקסיידי קרינה או . סוכן די. אנ. איי קומבינטורית re-ביטוי של מודול זה של שלושה miRNAs על ידי שיטת האשכול המתואר להלן תוצאות הפרעה עמוקה עם הביולוגיה של תאים סרטניים ניתן להשתמש בקלות כאסטרטגיה ריפוי גנטי למחקרים פרה-קליניים10. פרוטוקול זה עשוי להיות מעניין במיוחד לאלה המעורבים במחקר miRNA ויישומים הטרנסלבותית שלה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% low melting temperature agarose&#160;</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;M sterile filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLH033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plates&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic mice (FoxN1 nu/nu)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper, 16cm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium 137 irradiator&#160;</td>
			<td>JL Sheperd and Associates</td>
			<td>Core Facility (Harvard Medical School)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439142-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1051750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (GBM62)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (MGG4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD511B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R, cat. no.5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4112APG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3117-0380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Progenitor cells (NPC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>14314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6571-960EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-Dishes 94/16&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Direct-zol</td>
			<td>R2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Image-Guided Micro Irradiator&#160;</td>
			<td>Xstrahal Life Sciences, UK</td>
			<td>Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4376357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SterilGARD biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T98-G</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimum cutting temperature&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9636948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U251-MG</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViraPower Lentivector Expression system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K4970-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy

הרלוונטיות הביולוגית של microRNAs (miRNAs) בבריאות ובמחלות מסתמך באופן משמעותי על שילובים ספציפיים של מירנאס רבים בו בו במקום הפעולה של Mirnas יחיד. האפיון של אלה מודולים miRNAs ספציפיים הוא צעד בסיסי למקסם את השימוש בהם בטיפול. זה רלוונטי מאוד כי התכונות הקומבינטורית שלהם יכול להיות מנוצל כמעט. המתואר כאן היא שיטה להגדיר חתימה ספציפית miRNA רלוונטי השליטה של כרומטין repressors הכרומטוגניים ב glioblastoma. הגישה הראשונה מגדירה קבוצה כללית של miRNAs כי הם הפונים בגידולים בהשוואה לרקמות נורמלי. הניתוח מעודן עוד יותר על-ידי תנאי תרבות דיפרנציאלים, והבקיע קבוצת משנה של miRNAs אשר מבוטאים בו במהלך מדינות סלולר ספציפיות. בסופו של דבר, miRNAs כי לספק מסננים אלה משולבים לתוך הטרנסגנים מלאכותיים polycistronic, אשר מבוסס על פיגום של הגנים הקיימים מירונה אשכולות, לאחר מכן משמש ביטוי יתר של אלה מודולים Mirnas לתוך מקבל תאים.

שיטה זו אפשרה אפיון של מודול של שלושה miRNAs כי הם בעקביות מוסדר בגידולים במוח, אשר מבוטא במיוחד במהלך בידול עצבי (איור 1) ומעורב בתגובת הישרדות הגידול לאחר (איור 2). הדבר מתבצע על-ידי ויסות מסלול דכאואני כרומטין מורכב. תבנית הביטוי המשותף הציעה...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy at JoVE.com

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

המתואר כאן הוא פרוטוקול לאפיון מודולים של miRNAs ביולוגית מירסטים וההרכבה שלהם לתוך טרנסגנים קצרים, אשר מאפשר ביטוי יתר בו של טיפול גנטי יישומים.

אפיון של miRNAs הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

פרוטוקול זה מאפשר אפנון בו זמנית של מיקרו RNAs רבים בתאים אוקריוטיים ומבוסס על שיטה פשוטה וגמישה מאוד הממזערת את שלבי השיבוט המולקולרי. טכניקה זו יש השלכות על המחקר של אינטראקציות פונקציונליות מיקרו RNA במבחנה, אבל יותר חשוב זה מספק פלטפורמה לשימוש יעיל יותר של מיקרו RNAs בטיפול. פיתחנו והשתמשנו בו בעיקר בהקשר של סרטן המוח, אבל זה חל על כל המחלות שבהן מעורבים שינויים מרובים של ביטוי גנים.בדקנו את הגנים הטרנסיים המלאכותיים שלנו במודלים אחרים כגון קווי סרטן השד ובלוטת התריס המראים את הרבייה של טכניקה זו. ידע בסיסי בביואינפורמטיקה וביולוגיה מיקרו-רנ"א מועיל לפרוטוקול זה, אך אינו הכרחי. גישה ביואינפורמטית חשובה כדי להגדיר שילובי מיקרו RNA רלוונטיים ואת TRK-11, בעוד היכרות עם עיבוד מיקרו RNA מדיד חשוב להבין כיצד אלה מיקרו RNAs שונים ניתן להרכיב לתוך אשכולות DNA מלאכותיים שניתן לעבד בהצלחה פעם אחת יציב לתאים הספציפיים.כדי לצפות את המנה, ראשית להמיס פולי-D-ליסין במים בריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר. יוצקים את הפתרון לתוך המנה בכמות של מיליליטר אחד של פתרון לכל 25 ס"מ רבועים פני השטח. מערבלים את המנה כדי לוודא כיסוי של המנה כולה.לאחר שש שעות שאפו את תותב הפולי-די-ליזין ושטוף פעמיים עם PBS. תאי גזע עצביים אנושיים בכמות של 100, 000 תאים לכל חמישה מיליליטר של המדיום, או בתאי גזע בינוניים, מדיום בידול אסטרוציטי או מדיום בידול עצבי. לאחר ציפוי התא, מניחים את המנה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך שבוע ולהמשיך לבצע ניתוח ביטוי מיקרו RNA על פי כתב היד.לתרבות GBM-34 תאים דמויי גזע גליובלסטומה, להתחיל עם אחד 10 לתאים החמישי וחמישה מיליליטר של מדיום נוירובסאלי בבקבוקון חיבור נמוך 25 ס"מ מרובע. מניחים את הבקבוק באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. 48 שעות לאחר ציפוי, להוסיף הכפלת ריכוזים של DNA alkylating סוכן temozolomide כל שבעה ימים.התחל עם תוספת של חמישה micromolar TMZ בתוספת בינוני חמישה מיליליטר במשך חמישה ימים. לאחר חמישה ימים, להסיר את המדיום ולהחליף עם מדיום טרי ללא temozolomide כדי לאפשר לתאים ששרדו להתאושש. לאחר 48 שעות, מוסיפים 10 טמוזלומיד מיקרומולאריים ודגירה במשך חמישה ימים נוספים.חזור על הטיפול temozolomide הכפלה עד ריכוז של לפחות 100 micromolar הוא הגיע ותאים להיות עמידים לתרופה. לאחר אינדוקציה של התנגדות, לשקר תאים באמצעות 1 מיליליטר של ליסיס reagent. לחלץ RNA הכולל ולנתח את הביטוי של RNAs מיקרו ספציפי על פי כתב היד.כדי להשיג את היעד החזוי של כל מיקרו RNA שהוגדר בעבר, השתמש בכלי חיזוי מיקוד מיקרו RNA. מהעמוד הראשון של TargetScan, בחר את המיקרו רנ"א המעניין מהתפריט הנפתח המאוכלס מראש. לחץ על לחצן שלח.הורד את רשימת היעדים המתקבלת כגיליון אלקטרוני באמצעות הקישור לטבלת ההורדות. כדי להקטין את הסיכויים לתחזיות חיוביות שגויות, כלול רק יעדים בתוך העמודה אתרים שמורים וניתוח במורד הזרם. תוכניות חיזוי מיקרו-רנ"א נוספות מקבלות מחמירות נוספות וכוללות רק יעדים המשותפים לכל האלגוריתמים.לאחר מכן, פתח את סוויטת ToppGene 20. כדי להעריך להעשרת מסלולים המשותפים לכל מיקרו רנ"א, הדבק את רשימת המטרות המתקבלות בחלון ערכות הגנים המתאמן. לחץ על סמל HGNC כסוג הערך.לחץ על שלח והתחל. התוכנית מספקת טבלת פלט המציגה את קטגוריות GO המשמעותיות ביותר עבור רשימת הגנים שהוזנה. כדי לבסס סוף סוף את התרומה של כל מיקרו רנ"א לוויסות של מסלול משותף או תהליך תאי, פתח את פונקציית דיאגרמת ה- venn המסופקת באתר הביואינפורמטיקה והגנומיקה האבולוציונית.בדוק כל יעד שהושג מול הרשימה המלאה של הגנים המעורבים בתהליך התאי הספציפי. אם RNAs שליח היעד עבור כל RNAs מיקרו של עניין נמצאים בחלונות המתאימים, להעלות של העתק-להדביק את הרשימה. תן שם לכל רשימה עם מזהה ייחודי.לחץ על שלח. התוכנית מספקת פלט חזותי של דיאגרמת חיתוך קבוצות עם מספר גנים בכל מגזר, כמו גם רשימה מלאה של RNAs שליח עבור כל קבוצת משנה ושילובי הצטלבות. כדי לקבץ את המיקרו-RNAs שנבחרו לגן טרנס פונקציונלי, השג פיגום מהופנט המבוסס על לוקוס האשכול miR-17-92.השג את רצף הנוקלאוטיד מדפדפן הגנום ההרכב. בחר את רצף הליבה של 800 זוג הבסיסים המקיף את כל ששת סיכות השיער המיקרו-רנ"א המקודדות של הלוקוס ולפחות 200 רצפי אגף נוקלאוטידים הן במעלה הזרם והן במורד הזרם של רצף הליבה. הדבק את הרצף בכל תוכנית לעריכת מילים.הגדר את הרצף של כל אחד מששת סיכות השיער המקוריות על-ידי אחזורן בבסיס miR. סמן כל אחד מהרצפים האלה בטווח של רצף ליבה שזוהה בעבר. כל הרצפים בין כל סיכת ראש מייצגים רצפי רווחים.לאחר מכן, להשיג את רצפי סיכת ראש של מיקרו RNAs שנועדו להיות מעל לידי ביטוי בגן טרנס מבסיס miR. שימו לב היטב לנוקלאוטידים הספציפיים שבאתרים של מחשוף מעבד מיקרו. מחק את רצפי סיכות הראש המקוריים מרצף הליבה למעט שלושה עד חמישה נוקלאוטידים הן בחמשת הקצוות והן בקצוות של כל סיכת ראש אשר ישמשו כמקבל עבור סיכות הראש החדשות.הדבק את רצפי סיכות הראש של המיקרו RNAs הרצויים כדי להחליף את סיכות הראש שנמחקו בעבר. הוסף רצפי הגבלה רצויים בשני אזורי האגף של הגן הטרנסי כדי להקל על שיבוט משנה לווקטורים של מסירה לפי בחירה. ודא כי רצפי ההגבלה שנבחרו אינם קיימים בתוך הרצף עצמו.כדי לאמת את המבנה הדו מימדי של הגן הטרנס, העתק את הרצף המהונדס המלא לתוך RNA מבנה מבנה תוכנה RNA Webfold. בחר הגדרות תוכנית רגילות ולחץ על המשך. לנתח את הפלט הגרפי, במיוחד עבור נוכחות של סיכות שיער מוגדרות היטב בנוכחות מבני גזע תקועים כפולים כי הם לפחות 11 נוקלאוטידים proximal לאתר מחשוף מעבד מיקרו.כמו כן, חפשו את היעדר נקודות הסתעפות בתוך רצפי סיכות הראש. בשלב זה, הגן הטרנסי מוכן להיות מיוצר על ידי סינתזת גנים ומשכפל לווקטורים הרצויים. שיטה זו אפשרה אפיון של מודול של שלושה מיקרו RNAs כי הם באופן עקבי למטה מוסדר בגידולים במוח, אשר באים לידי ביטוי במיוחד במהלך בידול עצבי.דפוסי ביטוי שותף של מודולי מיקרו רנ"א במהלך הלחץ הגנוטוקסי אושרו והציעו פעילות סינרגטית חזקה בין שלושת המיקרו RNAs האלה. הגן הטרנסי המעוצב יכול בו זמנית לסכם את הביטוי של שלושת המיקרו RNAs בתאי גליובלסטומה, הן במבחנה והן במבחנה, עם הפרעה משמעותית בביולוגיה של הגידול והבטחת יכולת תרגום. בנוסף, האשכול הטרנסגני היה גם פונקציונלי במודל סרטן השד.הדרישות הקריטיות של פרוטוקול זה הן שמירה על הגודל המקורי של מחשוף המעבד בגן הטרנס. וודאו שמבנה לולאת הגזע של סיכות ראש מיקרו רנ"א כימריות נשמר. בשיטה זו, אנו יכולים לרכז מספר רב של גנים מיקרו RNA פעיל ביולוגית לתוך רצפי DNA קצרים מאוד אשר יכול ממש להיות מותאם באופן מוחץ לתוך כל וקטורים משלוח לשימוש ריפוי גנטי.שיטה זו היא אידיאלית כדי ללמוד את האינטראקציה הפונקציונלית בין מיקרו RNAs שונים להפריע מסלולים סלולריים multifactorial מורכבים אשר אחרת ידרוש שילובי תרופות מרובים.

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

הפרעות של במחזור miRNAs ב תסמונת מעי רגיז זוהו באמצעות פלטפורמת ביטוי גני תפוקה הגבוהה Multiplexed

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

התאמת גנים של גזע Hematopoietic פרימוס Nonhuman, ובתאים והכנה

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...