Name: characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare i membri del Laboratorio di Oncologia Neuro Harvey Cushing per il sostegno e la critica costruttiva. Questo lavoro è stato supportato da NINDS concede K12NS80223 e K08NS101091 a P. P.

1. Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente in Glioblastoma
<ol><li>Analisi dell'espressione di miRNA differenziale ampia nel glioblastoma rispetto al cervello
	<ol>
<li>In primo luogo, determinare i miRNA più significativamente deregolamentati nel tumore. Ciò può essere ottenuto utilizzando almeno tre diversi metodi:<ol>
<li>Estrarre l'Atlante del Genoma del Cancro, trovato a https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, per i dati di sequenziament...

<ol>
	<li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer's+Disease:+A+Meta-Analysis+Approach.">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767 (2018).</li><li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs:+tiny+regulators+with+great+potential.">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li><li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways.">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li><li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124,+&#8722;128,+and+&#8722;137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network.">miR-124, &#8722;128, and &#8722;137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li><li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma.">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).</li><li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs.">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li><li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray.">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li><li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells.">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li><li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency.">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).</li><li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes.">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA.org+resource:+targets+and+expression.">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li><li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRD(B)+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations.">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li><li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-miRPath+v3.0:+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support.">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li><li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2017.">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li><li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+from+miRNA+sequences+to+function.">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vienna+RNA+Package+2.0.">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).</li><li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly:+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology.">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).</li><li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma.">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li><li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions.">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex.">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li><li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs.">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li><li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron.">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li><li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector.">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).</li><li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection.">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li></ol>

Questo protocollo si basa sulla nozione che, invece di funzionare in isolamento, i miRNA sono biologicamente rilevanti lavorando in gruppi, e questi gruppi sono stabiliti trascrizionalmente da contesti cellulari specifici26. Per giustificare questo approccio da una prospettiva traslazionale, viene introdotto un protocollo di follow-up che consente la ricreazione di questo modello multi-miRNA nelle cellule/tessuti. Ciò è possibile sfruttando la biogenesi relativamente semplice dei miRNA, per cui ...

I miRNA offrono un'opportunità ineguagliabile per lo sviluppo di un ampio approccio di terapia genica a molte malattie1,2,3, compreso il cancro4,5. Questo si basa su diverse caratteristiche uniche di queste molecole biologiche, tra cui la loro piccola dimensione6, semplice biogenesi7, e la tendenza naturale a funzionare in associazione8. Molte malattie sono caratterizzate da specifici modelli di espressione del miRNA, che spesso convergono sulla regolazione di funzioni biologiche complesse9. Lo scopo di questo metodo è innanzitutto quello di definire una strategia per identificare gruppi di miRNA che sono sinergicamente rilevanti per funzioni cellulari specifiche. Di conseguenza, fornisce una strategia per il ripristino di tali combinazioni di miRNA in studi e applicazioni a valle.
Questo metodo consente l'analisi funzionale di più miRNA contemporaneamente, sfruttando il loro targeting simultaneo di un gran numero di mRNA, ricapitolando così i complessi paesaggi delle malattie. Questo approccio è stato recentemente impiegato per definire un gruppo di tre miRNA che 1) sono contemporaneamente downregolati nel cancro al cervello e 2) mostrano un forte modello di co-espressione durante la differenziazione neurale, nonché in risposta allo stress genotossico da radiazioni o un Agente alchiante del DNA. La riequivocazione combinatoria di questo modulo di tre miRNA con il metodo di clustering descritto di seguito si traduce in una profonda interferenza con la biologia delle cellule tumorali e può essere facilmente utilizzata come strategia di terapia genica per studi preclinici10. Questo protocollo può essere di particolare interesse per coloro che sono coinvolti nella ricerca sui miRNA e sulle sue applicazioni traslazionali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% low melting temperature agarose&#160;</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;M sterile filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLH033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plates&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic mice (FoxN1 nu/nu)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper, 16cm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium 137 irradiator&#160;</td>
			<td>JL Sheperd and Associates</td>
			<td>Core Facility (Harvard Medical School)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439142-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1051750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (GBM62)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (MGG4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD511B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R, cat. no.5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4112APG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3117-0380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Progenitor cells (NPC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>14314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6571-960EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-Dishes 94/16&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Direct-zol</td>
			<td>R2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Image-Guided Micro Irradiator&#160;</td>
			<td>Xstrahal Life Sciences, UK</td>
			<td>Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4376357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SterilGARD biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T98-G</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimum cutting temperature&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9636948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U251-MG</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViraPower Lentivector Expression system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K4970-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy

La rilevanza biologica dei microRNA (miRNA) nella salute e nella malattia si basa in modo significativo su combinazioni specifiche di molti miRNA contemporaneamente deregolamentati piuttosto che sull'azione di un singolo miRNA. La caratterizzazione di questi moduli specifici di miRNA è un passo fondamentale per massimizzare il loro uso in terapia. Questo è estremamente rilevante perché i loro attributi combinatori possono essere praticamente sfruttati. Descritto qui è un metodo per definire una firma miRNA specifica rilevante per il controllo dei repressori di cromatina oncogenia nel glioblastoma. L'approccio definisce prima un gruppo generale di miRNA che sono deregolati nei tumori rispetto al tessuto normale. L'analisi viene ulteriormente perfezionata dalle condizioni di coltura differenziali, sottolineando un sottogruppo di miRNA che vengono co-espressi contemporaneamente durante specifici stati cellulari. Infine, i miRNA che soddisfano questi filtri sono combinati in un transgene policistronico artificiale, che si basa su uno scaffolding di geni di cluster miRNA naturalmente esistenti, quindi utilizzati per la sovraespressione di questi moduli miRNA nelle cellule riceventi.

Questo metodo ha permesso la caratterizzazione di un modulo di tre miRNA che sono costantemente downregolati nei tumori cerebrali, che sono co-espressi specificamente durante la differenziazione neuronale (Figura 1) e coinvolti nella risposta di sopravvivenza del tumore dopo terapia (Figura 2). Ciò si ottiene regolando un complesso percorso repressivo della cromatina oncogenica. Questo modello di co-espressione ha suggerito una ...

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Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

Descritto qui è un protocollo per caratterizzare i moduli di miRNA biologicamente sinergici e il loro assemblaggio in transgeni brevi, che consente la sovraespressione simultanea per applicazioni di terapia genica.

Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente nel Glioblastoma e della loro ingegneria in cluster artificiali per la terapia genica

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Questo protocollo consente la modulazione simultanea di molti microRNA nelle cellule eucariotiche e si basa su un metodo molto semplice e flessibile che riduce al minimo i passaggi di clonazione molecolare. Questa tecnica ha implicazioni per lo studio delle interazioni funzionali del micro RNA in vitro, ma soprattutto fornisce una piattaforma per un uso più efficace dei microRNA in terapia. Lo abbiamo sviluppato e utilizzato principalmente nel contesto del cancro al cervello, ma si applica a tutte le malattie in cui sono coinvolte molteplici alterazioni dell'espressione genica.Abbiamo testato i nostri geni trans artificiali in altri modelli come le linee di cancro al seno e alla tiroide che mostrano la riproducibilità di questa tecnica. Le conoscenze di base della bioinformatica e della biologia dei microRNA sono utili per questo protocollo, ma non indispensabili. Un approccio bioinformatico è importante per definire combinazioni di microRNA rilevanti e il TRK-11, mentre la familiarità con l'elaborazione del micro RNA misurabile è importante per capire come questi diversi microRNA possano essere assemblati in cluster di DNA artificiali che possono essere elaborati con successo una volta stabili alle cellule specifiche.Per rivestire il piatto, sciogliere prima la poli-D-lisina in acqua a una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro. Versare la soluzione nel piatto alla quantità di un millilitro di soluzione per 25 centimetri quadrati di superficie. Ruotare il piatto per assicurarsi di copertura di tutto il piatto.Dopo sei ore aspirare la soluzione di poli-D-lsina e risciacquare due volte con PBS. Placcare le cellule staminali neurali umane nella quantità di 100.000 cellule per cinque millilitri del mezzo, sia nel mezzo delle cellule staminali, nel mezzo di differenziazione astrocitica o nel mezzo di differenziazione neuronale. Dopo la placcatura cellulare, posizionare il piatto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per una settimana e procedere all'analisi dell'espressione del micro RNA secondo il manoscritto.Per coltura di cellule simili a staminali di glioblastoma GBM-34, iniziare con una per dieci alla quinta cellula e cinque millilitri di mezzo neurobasale in un pallone ad attacco basso 25 centimetri quadrati. Posizionare il pallone in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. 48 ore dopo la placcatura, aggiungere concentrazioni raddoppiate di agente alchilante di DNA temozolomide ogni sette giorni.Iniziare con l'aggiunta di cinque micromolari TMZ integrati in cinque millilitri medi per cinque giorni. Dopo cinque giorni, rimuovere il mezzo e sostituirlo con mezzo fresco senza temozolomide per consentire alle cellule sopravvissute di riprendersi. Dopo 48 ore, aggiungere 10 temozolomide micromolare e incubare per altri cinque giorni.Ripetere il trattamento del raddoppio temozolomide fino a raggiungere la concentrazione di almeno 100 micromolari e le cellule diventano resistenti al farmaco. Dopo l'induzione della resistenza, mentire le cellule usando 1 millilitro di reagente di lisi. Estrarre l'RNA totale e analizzare l'espressione dei microRNA specifici in base al manoscritto.Per ottenere il targetome previsto di ogni micro RNA precedentemente definito, utilizzare strumenti di previsione del targeting per micro RNA. Dalla prima pagina di TargetScan, selezionare il micro RNA di interesse dal menu a discesa prepopolato. Fare clic sul pulsante invia.Scaricare l'elenco di destinazioni risultante come foglio di calcolo utilizzando il collegamento alla tabella di download. Per ridurre le possibilità di previsioni false positive, includere solo le destinazioni all'interno della colonna siti conservati e dell'analisi downstream. Ulteriori programmi di previsione del micro RNA ottengono ulteriore rigore e includono solo destinazioni comuni a tutti gli algoritmi.Quindi, apri la suite ToppGene 20. Per valutare l'arricchimento di percorsi comuni a ciascun micro RNA, incollare l'elenco degli obiettivi ottenuti nella finestra dei set di geni di training. Fate clic su Simbolo HGNC (HGNC Symbol) come tipo di voce.Fare clic su Invia e inizia. Il programma fornisce una tabella di output che mostra le categorie GO più significative per l'elenco inserito dei geni. Per stabilire infine il contributo di ogni micro RNA alla regolazione di un percorso comune o di un processo cellulare, aprire la funzione venn-diagramma fornita nel sito web bioinformatica e genomica evolutiva.Controllare ogni targetome ottenuto rispetto all'elenco completo dei geni coinvolti nello specifico processo cellulare. Se gli RNA di messaggistica di destinazione per ogni microRNA di interesse si trovano nelle rispettive finestre, caricare copia-incolla l'elenco. Assegnare un nome a ogni elenco con un identificatore univoco.Fare clic su Invia. Il programma fornisce un output visivo di un diagramma venn con numeri di geni in ogni settore e un elenco completo di RNA messaggero per ogni sottoinsieme e combinazioni di intersezioni. Per raggruppare i micro RNA selezionati in un gene trans funzionale, ottenere un'impalcatura transgenica basata sul locus a grappolo miR-17-92.Ottenere la sequenza nucleotidica dal browser del genoma ensemble. Selezionare la sequenza di nucleo di circa 800 coppie di basi che comprende tutti e sei i forcine a micro RNA codificati del locus e almeno 200 sequenze di fianco nucleotidici sia a monte che a valle della sequenza del nucleo. Incollare la sequenza in qualsiasi programma di modifica delle parole.Definire la sequenza di ciascuno dei sei perni di capelli nativi recuperandoli in base miR. Contrassegnare ognuna di queste sequenze entro l'intervallo della sequenza di base precedentemente identificata. Tutte le sequenze tra ogni tornante rappresentano sequenze distanziale.Successivamente, ottenere le sequenze di forcine di microRNA destinate ad essere sovraes espresse nel gene trans dalla base miR. Si notano con attenzione i nucleotidi specifici che si trovano nei siti di scissione del microprocessore. Elimina le sequenze di forcine native dalla sequenza centrale ad eccezione di tre o cinque nucleotidi alle estremità a cinque e te di ogni tornante che fungerà da accettore per i nuovi tornanti.Incollare le sequenze di forcine dei microRNA desiderati per sostituire le forcine precedentemente eliminate. Aggiungere le sequenze di restrizione desiderate in entrambe le regioni di fianco del gene trans per facilitare la sottoclonazione in vettori di distribuzione di scelta. Verificare che le sequenze di restrizione scelte non siano presenti all'interno della sequenza stessa.Per verificare la struttura bidimensionale del gene trans, copiare l'intera sequenza transgenica nel programma software di previsione della struttura dell'RNA RNA Webfold. Selezionare le impostazioni standard del programma e fare clic su Procedi. Analizzare l'uscita grafica, in particolare per la presenza di forcine ben definite in presenza di strutture staminali a doppio filamento che sono almeno 11 nucleotidi prossimali al sito di scissione del microprocessore.Inoltre, cerca l'assenza di punti di ramificazione all'interno delle sequenze di forcine. A questo punto, il gene trans è pronto per essere prodotto dalla sintesi genica e clonato nei vettori di somministrazione desiderati. Questo metodo ha permesso la caratterizzazione di un modulo di tre micro RNA che sono costantemente regolati nei tumori cerebrali, che sono co-espressi specificamente durante la differenziazione neuronale.I modelli di co-espressione dei moduli di micro RNA durante lo stress genotossico sono stati confermati e hanno suggerito una forte attività sinergica tra questi tre microRNA. Il gene trans progettato potrebbe contemporaneamente riassumere l'espressione dei tre microRNA nelle cellule del glioblastoma, sia in vitro che in vivo, con interferenze significative nella biologia tumorale e promettente applicabilità traslazionale. Inoltre, l'ammasso transgenico era funzionale anche in un modello di cancro al seno.I requisiti cruciali di questo protocollo sono il mantenimento delle dimensioni originali della scissione del processore nel gene trans. E assicurarsi che la struttura ad anello del gambo dei forcine chimeriche micro RNA sia preservata. Con questo metodo, possiamo concentrare più geni di microRNA biologicamente attivi in sequenze di DNA molto brevi che possono letteralmente essere inserite in vitro in qualsiasi vettore di somministrazione per uso di terapia genica.Questo metodo è ideale per studiare l'interazione funzionale tra diversi microRNA e per interferire con percorsi cellulari multifattoriali complessi che altrimenti richiederanno più combinazioni di farmaci.

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Perturbazioni di circolazione miRNA nella sindrome dell&#39;intestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Ricerca

Genetica

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection di proteine CRISPR/Cas9 in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embrioni per Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produzione e purificazione di Baculovirus per applicazione di terapia genica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Preparazione e modificazione genetica di staminali ematopoietiche Nonhuman Primate e cellule progenitrici

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...