Name: characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00
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著者らは、ハーヴェイ・クッシング神経腫瘍学研究所のメンバーに対し、支援と建設的な批判に感謝したいと考えています。この作業は、NINDS助成金K12NS80223およびK08NS101091によってP.Pにサポートされました。

1. 神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付け
<ol><li>神経膠芽腫対脳における広い差分miRNA発現の解析
	<ol>
<li>まず、腫瘍内で最も著しく緩和されたmiRNAを決定する。これは、少なくとも 3 つの異なる方法を使用して実現できます。<ol>
<li>https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcgaで見つかったがんゲノムアトラスを採掘し、データ11をシー...

<ol>
	<li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer's+Disease:+A+Meta-Analysis+Approach.">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767 (2018).</li><li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs:+tiny+regulators+with+great+potential.">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li><li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways.">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li><li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124,+&#8722;128,+and+&#8722;137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network.">miR-124, &#8722;128, and &#8722;137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li><li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma.">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).</li><li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs.">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li><li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray.">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li><li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells.">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li><li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency.">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).</li><li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes.">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA.org+resource:+targets+and+expression.">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li><li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRD(B)+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations.">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li><li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-miRPath+v3.0:+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support.">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li><li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2017.">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li><li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+from+miRNA+sequences+to+function.">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vienna+RNA+Package+2.0.">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).</li><li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly:+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology.">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).</li><li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma.">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li><li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions.">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex.">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li><li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs.">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li><li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron.">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li><li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector.">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).</li><li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection.">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li></ol>

このプロトコルは、単独で機能するのではなく、miRNAがグループで働くことによって生物学的に関連するという概念に基づいており、これらのグループは、特定の細胞コンテキスト26によって転写的に決定される。翻訳の観点からこのアプローチを正当化するために、細胞/組織におけるこのマルチmiRNAパターンの再構成を可能にするフォローアッププロトコルが導入される。...

miRNAは、がん4、5を含む多くの疾患1、2、3に対する広範な遺伝子治療アプローチの開発のための比類のない機会を提供する。これは、これらの生体分子のいくつかのユニークな特徴に基づいており、その小さいサイズ6、単純な生体発生7、および関連8で機能する自然な傾向を含む。多くの疾患は、しばしば複雑な生物学的機能の調節に収束する特定のmiRNA発現パターンによって特徴付けされる9.この方法の目的は、最初に特定の細胞機能に相乗的に関連するmiRNAのグループを識別する戦略を定義することです。その結果、下流の研究および応用におけるこのようなmiRNA組み合わせの再確立のための戦略を提供する。
この方法により、複数のmiRNAの機能解析を一度に行い、多数のmRNAを同時に標的化し、疾患の複雑な景観を再現することができます。このアプローチは、最近、1)脳癌で同時に制御され、2)放射線による無毒性ストレスに応答する神経分化中に強い共発パターンを示す3つのmiRNAのグループを定義するために採用されている。DNAアルキル化剤以下に説明するクラスタリング法による3つのmiRNAのこのモジュールの組み合わせ再発現は、癌細胞の生物学に対する深い干渉をもたらすものであり、前臨床研究10の遺伝子治療戦略として容易に使用することができる。このプロトコルは、miRNA研究およびその翻訳アプリケーションに関与する人々に特に関心があるかもしれません。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% low melting temperature agarose&#160;</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;M sterile filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLH033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plates&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic mice (FoxN1 nu/nu)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper, 16cm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium 137 irradiator&#160;</td>
			<td>JL Sheperd and Associates</td>
			<td>Core Facility (Harvard Medical School)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439142-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1051750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (GBM62)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (MGG4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD511B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R, cat. no.5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4112APG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3117-0380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Progenitor cells (NPC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>14314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6571-960EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-Dishes 94/16&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Direct-zol</td>
			<td>R2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Image-Guided Micro Irradiator&#160;</td>
			<td>Xstrahal Life Sciences, UK</td>
			<td>Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4376357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SterilGARD biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T98-G</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimum cutting temperature&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9636948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U251-MG</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViraPower Lentivector Expression system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K4970-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy

健康および疾患におけるマイクロRNA(miRNA)の生物学的関連性は、単一のmiRNAの作用ではなく、多くの同時に規制緩和されたmiRNAの特定の組み合わせに大きく依存する。これらの特定のmiRNAモジュールの特徴付けは療法の使用を最大にする基本的なステップである。組み合わせ属性が実質的に悪用される可能性があるため、これは非常に重要です。ここで説明する、神経膠芽腫における発癌性クロマチン抑制剤の制御に関連する特定のmiRNAシグネチャを定義する方法である。このアプローチは、最初に正常組織と比較して腫瘍で調節解除されるmiRNAの一般的なグループを定義する。分析は、差動培養条件によってさらに洗練され、特定の細胞状態の間に同時に発現されるmiRNAのサブグループを強調する。最後に、これらのフィルタを満たすmiRNAは、自然に存在するmiRNAクラスター遺伝子の足場に基づく人工ポリシストロントランス遺伝子に結合され、これらのmiRNAモジュールを受け取る細胞に過剰発現するために使用されます。

この方法は、脳腫瘍において一貫してダウンレギュレーションされている3つのmiRNAのモジュールの特徴付けを可能にし、これは神経分化(図1)の間に特異的に発現され、その後の腫瘍生存応答に関与するセラピー(図2)。これは、複雑な発発性クロマチン抑圧経路を調節することによって達成される。この共発現パターンは、?...

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Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

ここで説明する、生物学的に相乗的なmiRNAとその組み立てモジュールを短いトランス遺伝子に特徴付けるプロトコルであり、遺伝子治療用途に対する同時過剰発現を可能にする。

神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付けと遺伝子治療のための人工クラスターへの工学

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

このプロトコルは、真核細胞における多くのマイクロRNAの同時変調を可能にし、分子クローニングステップを最小限に抑える非常にシンプルで柔軟な方法に基づいています。この技術は、インビトロでのマイクロRNA機能相互作用の研究に影響を与えますが、より重要なのは、治療におけるマイクロRNAのより効果的な使用のためのプラットフォームを提供することです。私たちは主に脳癌の文脈でそれを開発し、使用してきましたが、遺伝子発現の複数の変化が関与しているあらゆる疾患に適用されます。この技術の再現性を示す乳癌および甲状腺癌ラインなどの他のモデルで人工トランス遺伝子を試験しました。バイオインフォマティクスとマイクロRNA生物学の基礎知識は、このプロトコルには役立ちますが、不可欠ではありません。バイオインフォマティクスのアプローチは、関連するマイクロRNAの組み合わせとTRK-11を定義するために重要ですが、マイクロRNA処理に精通していることは、これらの異なるマイクロRNAを特定の細胞に安定した一度安定に処理できる人工DNAクラスターにどのように組み立てられるかを理解するために重要です。皿をコーティングするには、まずポリD-リジンを1ミリリットル当たり100マイクログラムの濃度で水中に溶解する。25平方センチメートルの表面あたり溶液の1ミリリットルの量で皿に溶液を注ぎます。皿全体のカバレッジを確認するために皿を渦巻きます。6時間後にポリD-リジン溶液を吸引し、PBSで2回リンスする。ヒト神経幹細胞を培地の5ミリリットル当たり100,000個の細胞の量で、幹細胞培地、星状分化培地または神経分化培地のいずれかでプレートする。細胞メッキ後、皿を摂氏37度、炭酸ガス5%で1週間インキュベーターに入れ、原稿に従ってマイクロRNA発現解析を行う。GBM-34神経膠芽腫幹細胞を培養するには、25平方センチメートルの低い付着フラスコで10〜5番目の細胞と5ミリリットルの神経基底培地から始める。フラスコを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに入れる。めっき後48時間後、7日ごとにDNAアルキル化剤テモゾロミドの濃度を倍増する。5日間の5ミリリットル培地で補充5ミクロモルTMZの追加で開始します。5日後、培地を取り除き、生き残った細胞が回復できるようにテモゾロミドを使わずに新鮮な培地に交換します。48時間後、10マイクロモル歯型テモゾロミドを加え、さらに5日間インキュベートする。少なくとも100マイクロモルの濃度に達し、細胞が薬物に耐性になるまで、倍増テモゾロミド処理を繰り返す。抵抗性の誘導後、1ミリリットルのライシス試薬を用いて細胞を嘘をつく。全RNAを抽出し、原稿に従って特定のマイクロRNAの発現を分析します。事前に定義された各マイクロRNAの予測標的化を得るために、マイクロRNA標的予測ツールを使用する。TargetScan のフロント ページから、あらかじめ入力されたドロップダウン メニューから目的のマイクロ RNA を選択します。[送信] ボタンをクリックします。ダウンロードテーブルリンクを使用して、結果のターゲットリストをスプレッドシートとしてダウンロードします。誤検出予測の可能性を減らすには、保存されたサイト列と下流分析内のターゲットのみを含めます。追加のマイクロRNA予測プログラムは、さらにストリンジェンシーを得て、すべてのアルゴリズムに共通する標的のみを含みます。その後、ToppGeneスイート20を開きます。各マイクロRNAに共通する経路の濃縮を評価するには、トレーニング遺伝子セットウィンドウで得られた標的のリストを貼り付けます。エントリタイプとしてHGNCシンボルをクリックします。[送信] をクリックして開始します。プログラムは、遺伝子の入力されたリストの最も重要なGOカテゴリを示す出力テーブルを提供します。最終的に共通の経路または細胞プロセスの調節に対する各マイクロRNAの寄与を確立するために、バイオインフォマティクスおよび進化ゲノミクスのウェブサイトで提供されるベンダイアグラム機能を開きます。[送信] をクリックします。プログラムは、各セクターの遺伝子の数と各サブセットと交差の組み合わせのためのメッセンジャーRNAの完全なリストとのベン図の視覚的な出力を提供します。選択したマイクロRNAを機能的なトランス遺伝子にグループ化するには、miR-17-92クラスター遺伝子に基づいてトランスジェニック足場を得る。アンサンブル化されたゲノムブラウザから塩基配列を取得します。軌跡の6つのコード化されたマイクロRNAヘアピンと、コア配列の上流および下流の両方の少なくとも200ヌクレオチドの横並び配列を包含する約800塩基対コア配列を選択する。任意の単語編集プログラムにシーケンスを貼り付けます。6 つのネイティブ ヘア ピンのそれぞれについて、miR ベースで取得して、それぞれのシーケンスを定義します。前に識別されたコア シーケンスの範囲内でこれらのシーケンスのそれぞれをマークします。各ヘアピン間のシーケンスは、スペーサー シーケンスを表します。次に、miR塩基からトランス遺伝子で過剰発現されるマイクロRNAのヘアピン配列を得る。マイクロプロセッサ切断部位にある特定のヌクレオチドに注意してください。新しいヘアピンのアクセプタとして機能する各ヘアピンの5つから5つの端の両方で3〜5ヌクレオチドを除いて、コア配列からネイティブのヘアピン配列を削除します。必要なマイクロ RNA のヘアピン シーケンスを貼り付けて、以前に削除したヘアピンを置き換えます。トランス遺伝子の両方の隣接領域に所望の制限配列を追加して、選択した送達ベクターへのサブクローニングを容易にする。選択した制限シーケンスがシーケンス自体に存在しないことを確認します。トランス遺伝子の2次元構造を検証するには、RNA構造予測ソフトウェアプログラムRNA Webfoldに完全なトランスジェニック配列をコピーします。標準プログラム設定を選択し、[続行] をクリックします。グラフィカル出力を分析し、特にマイクロプロセッサ切断部位に近い少なくとも11ヌクレオチドである二本鎖ステム構造の存在下で明確に定義されたヘアピンの存在について分析する。また、ヘアピン シーケンス内に分岐点がない場合も探します。この時点で、トランス遺伝子は遺伝子合成によって作製され、所望の送達ベクターにクローン化される準備が整っている。この方法は、脳腫瘍で一貫して調節されている3つのマイクロRNAのモジュールの特徴付けを可能にし、これは神経細胞分化中に特に共発現される。遺伝子毒性ストレス時のマイクロRNAモジュールの共発現パターンが確認され、これら3つのマイクロRNAの間で強い相乗活性が示唆された。設計されたトランス遺伝子は、生体外および生体内の神経膠芽腫細胞における3つのマイクロRNAの発現を同時に再現することができ、腫瘍生物学に有意な干渉を及び翻訳適用性を有望としている。さらに、トランスジェニッククラスターは乳癌モデルでも機能していた。このプロトコルの重要な要件は、トランス遺伝子におけるプロセッサ切断の元のサイズを維持することです。そして、キメラマイクロRNAヘアピンのステムループ構造が保存されていることを確認してください。この方法により、複数の生物学的に活性なマイクロRNA遺伝子を非常に短いDNA配列に濃縮することができ、文字通り遺伝子治療用の任意の送達ベクターに生体外に取り付けることができます。この方法は、異なるマイクロRNA間の機能的相互作用を研究し、それ以外の場合は複数の薬物の組み合わせを必要とする複雑な多因子細胞経路を妨害するのに理想的です。

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

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遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

生産およびバキュロ ウイルスの遺伝子治療応用のための浄化

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

準備とヒト以外の霊長造血幹・前駆細胞の遺伝子の改変

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...