Name: characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00
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저자는 지원과 건설적인 비판에 대한 하비 쿠싱 신경 종양학 연구소의 구성원에게 감사하고 자합니다. 이 작품은 NINDS 보조금 K12NS80223 및 P. P에 K08NS101091에 의해 지원되었다.

1. 교모세포종에서 기능적으로 연관된 miRNAs의 특성화
<ol><li>교모세포종 대 뇌의 광범위한 차동 miRNA 발현 분석
	<ol>
<li>첫째, 종양에서 가장 현저하게 조절된 miRNAs를 결정합니다. 이것은 적어도 세 가지 다른 방법을 사용하여 달성 될 수있다 :<ol>
<li>시퀀싱 데이터11에대한 https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga 발견 된 암 게놈 아틀라스를 채?...

<ol>
	<li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer's+Disease:+A+Meta-Analysis+Approach.">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767 (2018).</li><li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs:+tiny+regulators+with+great+potential.">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li><li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways.">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li><li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124,+&#8722;128,+and+&#8722;137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network.">miR-124, &#8722;128, and &#8722;137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li><li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma.">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).</li><li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs.">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li><li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray.">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li><li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells.">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li><li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency.">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).</li><li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes.">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA.org+resource:+targets+and+expression.">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li><li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRD(B)+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations.">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li><li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-miRPath+v3.0:+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support.">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li><li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2017.">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li><li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+from+miRNA+sequences+to+function.">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vienna+RNA+Package+2.0.">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).</li><li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly:+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology.">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).</li><li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma.">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li><li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions.">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex.">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li><li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs.">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li><li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron.">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li><li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector.">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).</li><li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection.">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li></ol>

이 프로토콜은 단독으로 기능하는 것이 아니라 miRNA가 그룹에서 작업함으로써 생물학적으로 관련이 있다는 개념에 기초하며, 이들 그룹은 특정 세포 문맥26에의해 전사적으로 결정된다. 번역 관점에서이 접근을 정당화하기 위해 세포 / 조직에서이 다중 miRNA 패턴을 재현 할 수있는 후속 프로토콜이 도입됩니다. 이는 miRNA의 비교적 단순한 생체 발생을 이용하여 가능하며, 이에 의?...

miRNAs는 암4,5를포함하여 많은 질병에 대한 광범위한 유전자 치료 접근법의 개발을위한 타의 추종을 불허하는 기회를 제공합니다1,2,3. 이는 이들의 작은 크기6,간단한 생물발생7,및 협회에서 기능하는 자연적인 경향을 포함하여 이들 생물학적 분자의 몇 가지 독특한 특징을 기반으로한다 8. 많은 질병은 종종 복잡한 생물학적 기능의 조절에 수렴하는 특정 miRNA 발현 패턴을 특징으로한다9. 이 방법의 목적은 먼저 특정 세포 기능에 대해 시너지 효과를 내는 miRNAs 그룹을 식별하는 전략을 정의하는 것입니다. 따라서, 다운스트림 연구 및 응용 분야에서 이러한 miRNA 조합의 재확립을 위한 전략을 제공한다.
이 방법은 여러 miRNAs의 기능 적 분석을 한 번에 허용하여 많은 수의 mRNA를 동시에 타겟팅하여 질병의 복잡한 풍경을 재구성합니다. 이 접근법은 최근에 1) 뇌암에서 동시에 하향 조절되는 3개의 miRNAs 의 그룹을 정의하기 위하여 채택되고 2) 방사선 또는 에 의한 유전자 독성 스트레스에 반응할 뿐만 아니라 신경 분화 도중 강한 동시 발현 패턴을 나타낸다 DNA 알킬화제. 아래에 기술된 클러스터링 방법에 의한 3개의 miRNAs의 조합 재발현은 암세포의 생물학과 심오한 간섭을 초래하며 전임상 연구를 위한 유전자 치료 전략으로서 용이하게 사용될 수 있다10. 이 프로토콜은 miRNA 연구 및 그 번역 응용에 관여하는 사람들에게 특히 관심이 있을 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% low melting temperature agarose&#160;</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;M sterile filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLH033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plates&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic mice (FoxN1 nu/nu)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper, 16cm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium 137 irradiator&#160;</td>
			<td>JL Sheperd and Associates</td>
			<td>Core Facility (Harvard Medical School)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439142-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1051750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (GBM62)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (MGG4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD511B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R, cat. no.5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4112APG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3117-0380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Progenitor cells (NPC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>14314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6571-960EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-Dishes 94/16&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Direct-zol</td>
			<td>R2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Image-Guided Micro Irradiator&#160;</td>
			<td>Xstrahal Life Sciences, UK</td>
			<td>Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4376357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SterilGARD biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T98-G</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimum cutting temperature&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9636948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U251-MG</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViraPower Lentivector Expression system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K4970-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy

건강과 질병에 있는 microRNAs (miRNAs)의 생물학적 관련성은 단 하나 miRNA의 작용 보다는 오히려 많은 동시에 통제된 miRNAs의 특정 조합에 현저하게 의존합니다. 이러한 특정 miRNAs 모듈의 특성화는 치료에서의 사용을 극대화하는 근본적인 단계입니다. 이는 조합 특성이 실질적으로 악용될 수 있기 때문에 매우 관련이 있습니다. 여기서 기재된 것은 교모세포종에서 의질성 염색질 압압기의 조절과 관련된 특정 miRNA 시그니처를 정의하는 방법이다. 접근은 첫째로 정상 조직에 비교된 종양에서 통제되는 miRNAs의 일반적인 단을 정의합니다. 분석은 특정 세포 상태 도중 동시 표현되는 miRNAs의 하위 단을 강조하는 차등 배양 조건에 의해 더 구체화됩니다. 마지막으로, 이 필터를 만족시키는 miRNAs는 자연적으로 존재하는 miRNA 군집 유전자의 발판에 근거를 둔 인공 polycistronic transgenes로 결합되고, 수신 세포로 이 miRNA 모듈의 과발현을 위해 이용됩니다.

이 방법은 신경 분화 동안 특별히 공동 발현되는 뇌종양에서 일관되게 하향 조절되는 3개의 miRNAs 모듈의 특성화를허용(도 1)후 종양 생존 반응에 관여 치료(그림 2). 이것은 복잡한 온코제닉 크로마틴 억압경로를 조절함으로써 달성됩니다. 이러한 공동 발현 패턴은 이들 3개의 miRNAs 중에서 강력한 상승활성을시사...

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Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

여기서 설명된 것은 생물학적으로 상승적인 miRNAs및 그들의 조립체를 짧은 트랜스게네인으로 특성화하기 위한 프로토콜이며, 이는 유전자 치료 애플리케이션을 위한 동시 과발현을 허용한다.

교모세포종에서 기능적으로 연관된 miRNAs의 특성화 및 유전자 치료를 위한 인공 클러스터로의 엔지니어링

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

이 프로토콜은 진핵 세포에서 많은 마이크로 RNA의 동시 변조를 허용하고 분자 복제 단계를 최소화하는 매우 간단하고 유연한 방법을 기반으로합니다. 이 기술은 시험관내 마이크로 RNA 기능성 상호 작용의 연구를 위한 연루가 있습니다, 그러나 더 중요한 것은 치료에 있는 마이크로 RNA의 더 효과적인 사용을 위한 플랫폼을 제공합니다. 우리는 주로 뇌암의 맥락에서 개발하고 사용했지만 유전자 발현의 여러 변경이 관련된 모든 질병에 적용됩니다.우리는 이 기술의 재현성을 보여주는 유방 과 갑상선 선과 같은 그밖 모형에 있는 우리의 인공 적인 트랜스 유전자를 시험했습니다. 생물 정보학 및 마이크로 RNA 생물학의 기본 지식은이 프로토콜에 도움이 되지만 필수 불가결하지는 않습니다. 생물정보학 접근법은 관련 마이크로 RNA 조합과 TRK-11을 정의하는 것이 중요하며, 마이크로 RNA 처리에 대한 친숙함은 이러한 상이한 마이크로 RNA가 특정 세포에 한 번 안정적으로 성공적으로 처리될 수 있는 인공 DNA 클러스터로 조립될 수 있는 방법을 이해하는 것이 중요하다.접시를 코팅하려면 먼저 밀리리터 당 100 마이크로 그램의 농도로 물에 폴리 D-lysine을 녹입니다. 25 평방 센티미터 표면 당 용액의 1 밀리리터의 양으로 접시에 용액을 붓습니다. 전체 요리의 커버리지를 확인하기 위해 접시를 소용돌이.6시간 후에 폴리-D-리신 용액을 흡인시키고 PBS로 두 번 헹구세요. 플레이트 인간 신경 줄기 세포의 양에 100, 000 배지의 5 밀리리터 당 세포, 줄기 세포 매체, 성상 세포 분화 배지 또는 신경 분화 배지. 세포 도금 후, 1주일 동안 인큐베이터에 접시를 37도, 이산화탄소 5%로 배치하고 원고에 따라 마이크로 RNA 발현 분석을 진행한다.GBM-34 교모세포종 줄기와 같은 세포를 배양하기 위해, 25 평방 센티미터 낮은 부착 플라스크에서 다섯 번째 세포에 10 번 신경 병배지의 5 밀리리터로 시작합니다. 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에 인큐베이터에 넣습니다. 도금 후 48시간, 7일마다 DNA 알키라팅 제테모졸로미드의 두 배 농도를 추가한다.5 일 동안 5 밀리 리터 배지에서 보충 5 마이크로 몰러 TMZ의 추가로 시작. 5 일 후, 배지를 제거하고 살아남은 세포가 회복 할 수 있도록 테모졸로미드없이 신선한 배지로 교체하십시오. 48시간 후, 10개의 마이크로몰라 테모졸로미드를 추가하고 5일 동안 배양합니다.적어도 100 마이크로몰러의 농도가 도달하고 세포가 약물에 저항하게 될 때까지 두 배테모졸로미드 처리를 반복합니다. 저항의 유도 후, 리시스 시약의 1 밀리리터를 사용하여 세포를 거짓말. 총 RNA를 추출하고 원고에 따라 특정 마이크로 RNA의 발현을 분석한다.이전에 정의된 각 마이크로 RNA의 예측 대상을 얻으려면 마이크로 RNA 표적 예측 도구를 사용하십시오. TargetScan의 첫 페이지에서 미리 채워진 드롭 다운 메뉴에서 관심있는 마이크로 RNA를 선택합니다. 제출 버튼을 클릭합니다.다운로드 테이블 링크를 사용하여 결과 대상 목록을 스프레드시트로 다운로드합니다. 거짓 긍정 예측의 가능성을 줄이려면 보존된 사이트 열 및 다운스트림 분석 내에 대상만 포함합니다. 추가 마이크로 RNA 예측 프로그램은 추가 문자열을 얻고 모든 알고리즘에 공통되는 표적만 포함합니다.그런 다음 ToppGene 제품군 20을 엽니다. 각 마이크로 RNA에 일반적인 통로의 농축을 위해 평가하기 위하여는, 훈련 유전자 세트 창에서 얻은 표적의 목록을 붙여 넣습니다. HGNC 기호를 항목 유형으로 클릭합니다.제출을 클릭하고 시작합니다. 이 프로그램은 입력된 유전자 목록에 대해 가장 중요한 GO 범주를 보여주는 출력 테이블을 제공합니다. 마지막으로 일반적인 통로 또는 세포 과정의 규칙에 각 마이크로 RNA의 기여를 확립하기 위하여는, 생물정보학 및 진화 유전체학 웹사이트에 제공된 벤 다이어그램 기능을 엽니다.특정 세포 과정에 관여하는 유전자의 전체 목록에 대해 각 획득 대상을 확인하십시오. 관심 있는 각 마이크로 RNA에 대한 대상 메신저 RNA가 각 창에 있는 경우, 복사 붙여넣기 목록을 업로드합니다. 각 목록의 이름을 고유 식별자로 지정합니다.제출을 클릭합니다. 이 프로그램은 각 섹터의 유전자 수와 각 하위 집합 및 교차 조합에 대한 메신저 RNA의 전체 목록을 가진 벤 다이어그램의 시각적 출력을 제공합니다. 선택된 마이크로 RNA를 기능성 트랜스 유전자로 그룹화하려면 miR-17-92 클러스터 궤적에 기초하여 형질전환 비계를 얻습니다.앙상블게놈 브라우저로부터 뉴클레오티드 서열을 획득한다. 메큐의 6개의 인코딩된 마이크로 RNA 헤어핀과 코어 서열의 상류 및 하류 둘 다 200개의 뉴클레오티드 측면 서열을 모두 포함하는 약 800개의 염기 쌍 코어 서열을 선택한다. 시퀀스를 단어 편집 프로그램에 붙여 넣습니다.miR 베이스에서 6개의 네이티브 헤어 핀 각각의 시퀀스를 정의합니다. 이전에 확인된 코어 시퀀스의 범위 내에서 이러한 시퀀스의 각 순서를 표시합니다. 각 헤어핀 사이의 모든 시퀀스는 스페이서 시퀀스를 나타냅니다.다음으로, miR 염기로부터 트랜스 유전자에서 과도하게 발현될 것을 의도한 마이크로 RNA의 헤어핀 서열을 얻을 수 있다. 마이크로 프로세서 분열 부위에 있는 특정 뉴클레오티드에 주의하십시오. 새로운 헤어핀에 대한 수용자로 작용할 각 헤어핀의 5개 및 끝 모두에서 3~5개의 뉴클레오티드를 제외하고 코어 서열에서 네이티브 헤어핀 서열을 삭제한다.이전에 삭제된 헤어핀을 대체하기 위해 원하는 마이크로 RNA의 헤어핀 시퀀스를 붙여 넣습니다. 선택의 전달 벡터로 서브 복제를 용이하게하기 위해 트랜스 유전자의 양쪽 측면 영역에 원하는 제한 서열을 추가합니다. 선택한 제한 시퀀스가 시퀀스 자체에 존재하지 않는지 확인합니다.트랜스 유전자의 2차원 구조를 확인하기 위해, 전체 형질전환 서열을 RNA 구조 예측 소프트웨어 프로그램 RNA Webfold로 복사한다. 표준 프로그램 설정을 선택하고 진행을 클릭합니다. 그래픽 출력을 분석하여, 특히 마이크로 프로세서 분열 부위에 근접한 11개의 뉴클레오티드 이상의 이중 가닥 줄기 구조가 있는 잘 정의된 헤어핀의 존재를 분석한다.또한, 헤어핀 시퀀스 내에서 분기점이 없는지 찾아본다. 이 시점에서, 트랜스 유전자는 유전자 합성에 의해 생성되고 원하는 전달 벡터로 복제될 준비가 되어 있다. 이 방법은 신경 분화 중에 구체적으로 공동 발현되는 뇌종양에서 일관되게 조절되는 3개의 마이크로 RNA의 모듈의 특성화를 허용했습니다.유전자 독성 스트레스 중 마이크로 RNA 모듈의 공동 발현 패턴을 확인하고 이들 3개의 마이크로 RNA 중강력한 시너지 활성을 제안하였다. 디자인된 트랜스 유전자는 동시에 아교모세포종 세포에 있는 3개의 마이크로 RNA의 발현을, 시험관 내 및 생체 내, 종양 생물학에 있는 중요한 간섭 및 유망한 번역 적용성을 가진 회수할 수 있었습니다. 또한, 형질전환 클러스터는 유방암 모델에서도 기능성이었다.이 프로토콜의 중요한 요구 사항은 트랜스 유전자에서 프로세서 분열의 원래 크기를 유지하는 것입니다. 그리고 키메라 마이크로 RNA 헤어핀의 줄기 루프 구조가 보존되어 있는지 확인하십시오. 이 방법을 통해, 우리는 말 그대로 유전자 치료 사용을 위한 임의의 전달 벡터에 체질될 수 있는 아주 짧은 DNA 서열에 다중 생물학적활성 마이크로 RNA 유전자를 집중할 수 있습니다.이 방법은 다른 마이크로 RNA 간의 기능적 상호 작용을 연구하고 그렇지 않으면 여러 약물 조합을 필요로 복잡한 다자간 세포 경로를 방해하는 것이 이상적입니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

연구

유전학

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 단백질의 유전자 편집에 대 한 채널 메기, Ictalurus punctatus, 배아로 microinjection

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...