Name: characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy at JoVE.com

Los autores desean agradecer a los miembros del Laboratorio de Neurooncología Harvey Cushing por su apoyo y crítica constructiva. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NINDS K12NS80223 y K08NS101091 a P. P.

1. Caracterización de los miRNAs asociados funcionalmente en el Glioblastoma
<ol><li>Análisis de la expresión diferencial amplia de miRNA en glioblastoma vs.
	<ol>
<li>En primer lugar, determinar los MIRNAs más significativamente desregulados en el tumor. Esto se puede lograr utilizando al menos tres métodos diferentes:<ol>
<li>Mina el Atlas del Genoma del Cáncer, encontrado en https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, para la secuenciación de datos<sup...

<ol>
	<li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer's+Disease:+A+Meta-Analysis+Approach.">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767 (2018).</li><li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs:+tiny+regulators+with+great+potential.">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li><li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways.">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li><li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124,+&#8722;128,+and+&#8722;137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network.">miR-124, &#8722;128, and &#8722;137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li><li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma.">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).</li><li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs.">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li><li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray.">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li><li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells.">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li><li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency.">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).</li><li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes.">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA.org+resource:+targets+and+expression.">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li><li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRD(B)+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations.">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li><li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-miRPath+v3.0:+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support.">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li><li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2017.">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li><li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+from+miRNA+sequences+to+function.">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vienna+RNA+Package+2.0.">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).</li><li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly:+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology.">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).</li><li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma.">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li><li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions.">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex.">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li><li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs.">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li><li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron.">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li><li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector.">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).</li><li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection.">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li></ol>

Este protocolo se basa en la noción de que en lugar de funcionar de forma aislada, los miRNAs son biológicamente relevantes al trabajar en grupos, y estos grupos están determinados transcripcionalmente por contextos celulares específicos26. Para justificar este enfoque desde una perspectiva traslacional, se introduce un protocolo de seguimiento que permite la recreación de este patrón multi-miRNA en células/tejidos. Esto es posible aprovechando la biogénesis relativamente simple de los miR...

los miRNAs ofrecen una oportunidad inigualable para el desarrollo de un enfoque amplio de terapia génica para muchas enfermedades1,2,3, incluyendo el cáncer4,5. Esto se basa en varias características únicas de estas moléculas biológicas, incluyendo su pequeño tamaño6, biogénesis simple7,y tendencia natural a funcionar en la asociación8. Muchas enfermedades se caracterizan por patrones específicos de expresión de miRNA, que a menudo convergen en la regulación de funciones biológicas complejas9. El propósito de este método es primero definir una estrategia para identificar grupos de miRNAs que son sinérgicamente relevantes para funciones celulares específicas. En consecuencia, proporciona una estrategia para el restablecimiento de tales combinaciones de miRNA en estudios y aplicaciones posteriores.
Este método permite el análisis funcional de múltiples miRNAs a la vez, aprovechando su segmentación simultánea de un gran número de ARNm, recapitulando así los complejos paisajes de las enfermedades. Este enfoque se ha empleado recientemente para definir un grupo de tres miRNAs que 1) están simultáneamente regulados en cáncer cerebral y 2) muestran un fuerte patrón de coexpresión durante la diferenciación neuronal, así como en respuesta al estrés genotóxico por radiación o un Agente alquilante de ADN. La re-expresión combinatoria de este módulo de tres miRNAs por el método de agrupación que se describe a continuación da lugar a una profunda interferencia con la biología de las células cancerosas y se puede utilizar fácilmente como estrategia de terapia génica para estudios preclínicos10. Este protocolo puede ser de particular interés para los involucrados en la investigación de miRNA y sus aplicaciones traslacionales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% low melting temperature agarose&#160;</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;M sterile filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLH033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plates&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic mice (FoxN1 nu/nu)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper, 16cm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium 137 irradiator&#160;</td>
			<td>JL Sheperd and Associates</td>
			<td>Core Facility (Harvard Medical School)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439142-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1051750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (GBM62)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (MGG4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD511B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R, cat. no.5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4112APG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3117-0380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Progenitor cells (NPC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>14314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6571-960EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-Dishes 94/16&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Direct-zol</td>
			<td>R2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Image-Guided Micro Irradiator&#160;</td>
			<td>Xstrahal Life Sciences, UK</td>
			<td>Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4376357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SterilGARD biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T98-G</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimum cutting temperature&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9636948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U251-MG</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViraPower Lentivector Expression system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K4970-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy

La relevancia biológica de los microARN (miRNAs) en salud y enfermedad se basa significativamente en combinaciones específicas de muchos miRNAs desregulados simultáneamente en lugar de la acción de un solo miRNA. La caracterización de estos módulos miRNAs específicos es un paso fundamental para maximizar su uso en la terapia. Esto es extremadamente relevante porque sus atributos combinatoriales pueden ser prácticamente explotados. Aquí se describe un método para definir una firma específica de miRNA relevante para el control de los represores de cromatina oncogénica en el glioblastoma. El enfoque define primero un grupo general de miRNAs que se desreglamentan en los tumores en comparación con el tejido normal. El análisis se perfecciona aún más mediante condiciones de cultivo diferencial, subrayando un subgrupo de miRNAs que se expresan simultáneamente durante estados celulares específicos. Por último, los miRNAs que satisfacen estos filtros se combinan en un transgenes policistrónicos artificiales, que se basa en un andamio de genes de agrupaciones de miRNA naturalmente existentes, luego se utilizan para la sobreexpresión de estos módulos de miRNA en las células receptoras.

Este método permitió la caracterización de un módulo de tres miRNAs que están constantemente regulados en tumores cerebrales, que se expresan específicamente durante la diferenciación neuronal(Figura 1) e implican en la respuesta de supervivencia tumoral después de terapia(Figura 2). Esto se logra mediante la regulación de una vía represiva de cromatina oncogénica compleja. Este patrón de co-expresión sugiere una fue...

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Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

Aquí se describe un protocolo para caracterizar módulos de miRNAs biológicamente sinérgicos y su ensamblaje en transgenes cortos, lo que permite la sobreexpresión simultánea para aplicaciones de terapia génica.

Caracterización de los miRNAs asociados funcionalmente en el glioblastoma y su ingeniería en clústeres artificiales para la terapia génica

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Este protocolo permite la modulación simultánea de muchos micro ARN en células eucariotas y se basa en un método muy simple y flexible que minimiza los pasos de clonación molecular. Esta técnica tiene implicaciones para el estudio de las interacciones funcionales del micro ARN in vitro, pero lo más importante es que proporciona una plataforma para un uso más eficaz de los micro RNA en la terapia. Lo hemos desarrollado y utilizado principalmente en el contexto del cáncer cerebral, pero se aplica a cualquier enfermedad en la que intervienen múltiples alteraciones de la expresión génica.Hemos probado nuestros genes trans artificiales en otros modelos como las líneas de cáncer de mama y tiroides que muestran la reproducibilidad de esta técnica. El conocimiento básico de la bioinformática y la biología del micro ARN es útil para este protocolo, pero no es indispensable. Un enfoque bioinformático es importante para definir las combinaciones de micro ARN relevantes y el TRK-11, mientras que la familiaridad con el procesamiento del micro ARN es importante para entender cómo estos diferentes micro ARN se pueden ensamblar en grupos de ADN artificial que se pueden procesar con éxito una vez estables a las células específicas.Para cubrir el plato, primero disolver la poli-D-lisina en agua a una concentración de 100 microgramos por mililitro. Vierta la solución en el plato a la cantidad de un mililitro de solución por cada 25 centímetros cuadrados de superficie. Gire el plato para asegurarse de la cobertura de todo el plato.Después de seis horas aspirar la solución de poli-D-lisina y enjuagar dos veces con PBS. Placa de células madre neurales humanas en la cantidad de 100.000 células por cada cinco mililitros del medio, ya sea en medio de células madre, medio de diferenciación astrocítica o medio de diferenciación neuronal. Después del enchapado celular, coloque el plato en una incubadora a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante una semana y proceda a realizar análisis de expresión de ARN micro de acuerdo con el manuscrito.Para cultivar células similares al tallo del glioblastoma GBM-34, comience con una por diez a las quintas células y cinco mililitros de medio neurobasal en un matraz de unión baja de 25 centímetros cuadrados. Coloque el matraz en una incubadora a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono. 48 horas después del enchapado, añadir concentraciones dobles de ADN alquilante agente temozolomida cada siete días.Comience con la adición de cinco MICROmolar TMZ complementados en cinco mililitros medio durante cinco días. Después de cinco días, retire el medio y sustitúyalo por medio fresco sin temozolomida para permitir que las células sobrevivientes se recuperen. Después de 48 horas, añadir 10 temozolomida micromolar e incubar durante otros cinco días.Repita el tratamiento con temozolomida doble hasta que se alcance la concentración de al menos 100 micromolares y las células se vuelvan resistentes al fármaco. Después de la inducción de la resistencia, células de mentira utilizando 1 mililitro de reactivo de lisis. Extraiga el ARN total y analice la expresión de los microNAs específicos según el manuscrito.Para obtener el targetome previsto de cada micro ARN previamente definido, utilice herramientas de predicción de micro ARN. En la primera página de TargetScan, seleccione el micro ARN de interés en el menú desplegable rellenado previamente. Haga clic en el botón Enviar.Descargue la lista resultante de destinos como una hoja de cálculo mediante el enlace de la tabla de descarga. Para reducir las posibilidades de predicciones falsas positivas, incluya solo los destinos dentro de la columna de sitios conservados y el análisis posterior. Los programas adicionales de predicción de micro ARN obtienen mayor rigurosidad y solo incluyen destinos que son comunes a todos los algoritmos.A continuación, abra La suite ToppGene 20. Para evaluar el enriquecimiento de las vías que son comunes a cada micro ARN, pegue la lista de objetivos obtenidos en la ventana de conjuntos de genes de entrenamiento. Haga clic en Símbolo HGNC como tipo de entrada.Haga clic en Enviar e iniciar. El programa proporciona una tabla de salida que muestra las categorías GO más significativas para la lista introducida de genes. Para establecer finalmente la contribución de cada micro ARN a la regulación de una vía común o proceso celular, abra la función venn-diagram proporcionada en el sitio web de Bioinformática y Genómica Evolutiva.Compruebe cada targetome obtenido con la lista completa de genes involucrados en el proceso celular específico. Si los ARN de mensajería de destino para cada micro ARN de interés se encuentran en las ventanas respectivas, cargue la lista de copiar y pegar. Asigne un nombre a cada lista con un identificador único.Haga clic en Enviar. El programa proporciona una salida visual de un diagrama de venn con números de genes en cada sector, así como una lista completa de ARN de mensajería para cada subconjunto y combinaciones de intersección. Para agrupar los micro ARN seleccionados en un gen trans funcional, obtenga un andamio transgénico basado en el locus de racimo miR-17-92.Obtenga la secuencia de nucleótidos del navegador del genoma en conjunto. Seleccione la secuencia de núcleo de aproximadamente 800 pares base que abarca las seis horquillas de micro ARN codificadas del locus y al menos 200 secuencias de flanqueo de nucleótidos tanto aguas arriba como aguas abajo de la secuencia de núcleo. Pegue la secuencia en cualquier programa de edición de palabras.Define la secuencia de cada uno de los seis pasadores de pelo nativos recuperandolos en la base miR. Marque cada una de estas secuencias dentro del intervalo de secuencia de núcleo previamente identificada. Cualquier secuencia entre cada horquilla representa secuencias espaciadores.A continuación, obtener las secuencias de horquillas de micro ARN destinados a ser sobreesclarados en el gen trans de la base miR. Tenga en cuenta cuidadosamente los nucleótidos específicos que se encuentran en los sitios de escisión del microprocesador. Elimine las secuencias de horquillas nativas de la secuencia de núcleo con la excepción de tres a cinco nucleótidos en las puntas cinco y las de cada horquilla que servirán como un aceptador para las nuevas horquillas.Pegue las secuencias de horquillas de los micro ARN deseados para reemplazar las horquillas previamente eliminadas. Añada las secuencias de restricción deseadas en ambas regiones flanqueantes del gen trans para facilitar la sub-clonación en los vectores de entrega de su elección. Verifique que las secuencias de restricción elegidas no estén presentes dentro de la secuencia misma.Para verificar la estructura bidimensional del gen trans, copie la secuencia transgénica completa en el programa de software de predicción de estructura de ARN RNA WEBfold. Seleccione la configuración estándar del programa y haga clic en continuar. Analizar la salida gráfica, particularmente para la presencia de horquillas bien definidas en presencia de estructuras de vástago de doble hebra que son al menos 11 nucleótidos proximales al sitio de escisión del microprocesador.Además, busque la ausencia de puntos de bifurcación dentro de las secuencias de horquillas. En este punto, el gen trans está listo para ser producido por la síntesis genética y clonado en los vectores de entrega deseados. Este método permitió la caracterización de un módulo de tres micro ARN que están constantemente regulados en tumores cerebrales, que se expresan específicamente durante la diferenciación neuronal.Se confirmaron los patrones de coexpresión de los módulos de micro ARN durante el estrés genotóxico y se sugirió una fuerte actividad sinérgica entre estos tres microR. El gen trans diseñado podría recapitular simultáneamente la expresión de los tres microR en las células del glioblastoma, tanto in vitro como in vivo, con interferencia significativa en la biología tumoral y una aplicabilidad traslacional prometedora. Además, el cúmulo transgénico también era funcional en un modelo de cáncer de mama.Los requisitos cruciales de este protocolo son mantener el tamaño original de la escisión del procesador en el gen trans. Y asegúrese de que se conserva la estructura del lazo del tallo de las horquillas de micro ARN quimérico. Con este método, podemos concentrar múltiples genes de micro ARN biológicamente activos en secuencias de ADN muy cortas que literalmente se pueden instalar in vitro en cualquier vector de administración para uso de terapia génica.Este método es ideal para estudiar la interacción funcional entre diferentes micro RNAs e interferir con complejas vías celulares multifactoriales que de otro modo requerirán múltiples combinaciones de fármacos.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Investigación

Genética

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Preparación y modificación genética de primates no humanos tallo hematopoyéticas y células progenitoras

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