Name: characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy at JoVE.com

Yazarlar destek ve yapıcı eleştiri için Harvey Cushing Nöro Onkoloji Laboratuvarı üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NINDS tarafından desteklenmiştir K12NS80223 ve K08NS101091 P. P.

1. Glioblastoma'da Fonksiyonel İlişkili MiRNA'ların Karakterizasyonu
<ol><li>Glioblastoma vs beyinde geniş diferansiyel miRNA ekspresyonunun analizi
	<ol>
<li>İlk olarak, tümörde en önemli deregulated miRNA'ları belirleyin. Bu, en az üç farklı yöntem kullanılarak elde edilebilir:<ol>
<li>Mine Kanser Genom Atlası, https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga bulunan, veri sıralama için11.</li>
			<li>Taze bir operatif numune...

<ol>
	<li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer's+Disease:+A+Meta-Analysis+Approach.">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767 (2018).</li><li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs:+tiny+regulators+with+great+potential.">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li><li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways.">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li><li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124,+&#8722;128,+and+&#8722;137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network.">miR-124, &#8722;128, and &#8722;137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li><li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma.">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).</li><li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs.">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li><li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray.">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li><li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells.">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li><li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency.">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).</li><li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes.">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA.org+resource:+targets+and+expression.">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li><li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRD(B)+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations.">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li><li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-miRPath+v3.0:+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support.">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li><li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2017.">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li><li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+from+miRNA+sequences+to+function.">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vienna+RNA+Package+2.0.">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).</li><li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly:+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology.">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).</li><li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma.">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li><li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions.">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex.">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li><li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs.">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li><li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron.">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li><li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector.">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).</li><li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection.">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li></ol>

Bu protokol, miRNA'ların izole olarak çalışmak yerine, biyolojik olarak gruplar halinde çalışarak ilgili olduğu ve bu grupların transkripsiyon olarak belirli hücresel bağlamlar tarafından belirlendiği fikrine dayanmaktadır26. Bu yaklaşımı çevirisel açıdan haklı göstermek için, hücrelerde/dokularda bu çoklu miRNA deseninin rekreasyonuna olanak tanıyan bir takip protokolü getirilmiştir. Bu miRNA'ların nispeten basit biyogenezinden yararlanarak mümkündür, böylece kara...

miRNA'lar birçok hastalığa geniş bir gen terapisi yaklaşımının geliştirilmesi için eşsiz bir fırsat sunuyoruz1,2,3, kanser dahil4,5. Bu küçük boyutu6dahil olmak üzere bu biyolojik moleküllerin çeşitli benzersiz özellikleri dayanmaktadır, basit biyogenez7, ve ilişki içinde işlev doğal eğilim8. Birçok hastalık genellikle karmaşık biyolojik fonksiyonların düzenlenmesi üzerinde yakınsama belirli miRNA ekspresyon desenleri ile karakterizedir9. Bu yöntemin amacı ilk olarak belirli hücresel fonksiyonlar için sinerjik olarak ilgili miRNA gruplarını tanımlamak için bir strateji tanımlamaktır. Sonuç olarak, bu tür miRNA kombinasyonlarının downstream çalışmalarda ve uygulamalarda yeniden kurulması için bir strateji sağlar.
Bu yöntem, birden fazla miRNA'nın aynı anda fonksiyonel analizini sağlar, çok sayıda mRNA'yı eşzamanlı olarak hedeflemelerinden yararlanarak hastalıkların karmaşık manzaralarını özetlemektedir. Bu yaklaşım son zamanlarda üç miRNA'lardan oluşan bir grubu tanımlamak için kullanılmıştır ki 1) aynı anda beyin kanserinde göz denir ve 2) sinirsel farklılaşma sırasında güçlü bir ko-ekspresyon paterni göstermek yanı sıra radyasyon veya bir genotoksik strese yanıt olarak DNA alkilleyici ajan. Üç miRNA'dan oluşan bu modülün, aşağıda açıklanan kümeleme yöntemi ile kombinatoryal yeniden ekspresyonu, kanser hücrelerinin biyolojisi ile derin bir girişimle sonuçlanır ve klinik öncesi çalışmalar için gen terapisi stratejisi olarak kolayca kullanılabilir10. Bu protokol miRNA araştırmave çeviri uygulamaları dahil olanlar için özel ilgi olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% low melting temperature agarose&#160;</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;M sterile filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLH033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well plates&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic mice (FoxN1 nu/nu)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper, 16cm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium 137 irradiator&#160;</td>
			<td>JL Sheperd and Associates</td>
			<td>Core Facility (Harvard Medical School)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439142-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1051750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (GBM62)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human primary glioma stem-like cells (MGG4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD511B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R, cat. no.5404000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4112APG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3117-0380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Progenitor cells (NPC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women&#8217;s Hospital, Boston, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>14314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6571-960EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-Dishes 94/16&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Direct-zol</td>
			<td>R2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Image-Guided Micro Irradiator&#160;</td>
			<td>Xstrahal Life Sciences, UK</td>
			<td>Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4376357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SterilGARD biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T98-G</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temozolomide</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek optimum cutting temperature&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9636948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U251-MG</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87-MG&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collecti</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViraPower Lentivector Expression system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K4970-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of functionally associated mirnas in glioblastoma and their engineering into artificial clusters for gene therapy

MikroRNA'ların (miRNA'ların) sağlık ve hastalıktaki biyolojik önemi, tek bir miRNA'nın eylemi yerine aynı anda deregüle edilmiş birçok miRNA'nın belirli kombinasyonlarına dayanır. Bu özel miRNA modüllerinin karakterizasyonu, tedavide kullanımlarını en üst düzeye çıkarmada temel bir adımdır. Bu son derece alakalıdır, çünkü kombinatoryal öznitelikleri pratik olarak kullanılabilir. Burada açıklanan glioblastoma onkojenik kromatin represörlerin kontrolü ile ilgili belirli bir miRNA imza tanımlamak için bir yöntemdir. Yaklaşım ilk olarak tümörlerde normal dokuya göre deregulated olan genel bir miRNA grubunu tanımlar. Analiz, diferansiyel kültür koşullarına göre daha da rafine edilerek, belirli hücresel durumlar sırasında aynı anda ifade edilen miRNA'ların bir alt grubunun altını çizer. Son olarak, bu filtreleri karşılayan miRNA'lar, doğal olarak var olan miRNA kümelerinin genlerinin bir iskelesine dayanan ve daha sonra bu miRNA modüllerinin alıcı hücrelere aşırı ekspresyonu için kullanılan yapay bir polikistronik transgende birleştirilir.

Bu yöntem, beyin tümörlerinde sürekli olarak aşağı teregüle edilen ve özellikle nöronal farklılaşma sırasında(Şekil 1)birlikte ifade edilen ve daha sonra tümör sağkalım yanıtında yer alan üç miRNA'dan oluşan bir modülün karakterizasyonuna olanak sağladı. tedavi (Şekil 2). Bu karmaşık bir onkojenik kromatin baskıcı yolu düzenleyerek gerçekleştirilir. Bu ko-ifade deseni bu üç miRNA arasında g?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy at JoVE.com

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

Burada tanımlanan biyolojik sinerjik miRNA'ların modüllerini ve bunların kısa transgenlere dönüştürülmesiiçin bir protokoldür, bu da gen terapisi uygulamaları için eşzamanlı aşırı ekspresyon sağlar.

Glioblastoma'da İşlevsel İlişkili MiRNA'ların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Bu protokol ökaryotik hücrelerde birçok mikro RNA eşzamanlı modülasyonu sağlar ve moleküler klonlama adımları en aza indirgeyen çok basit ve esnek bir yönteme dayanmaktadır. Bu teknik in vitro mikro RNA fonksiyonel etkileşimlerin çalışması için etkileri vardır, ama daha da önemlisi tedavide mikro RNA daha etkili bir kullanım için bir platform sağlar. Biz esas olarak geliştirdik ve beyin kanseri bağlamında kullanılan, ancak gen ekspresyonunun birden fazla değişiklik söz konusu olan herhangi bir hastalık için geçerlidir.Yapay trans genlerimizi meme ve tiroid kanseri çizgileri gibi bu tekniğin tekrarlanabilirliğini gösteren diğer modellerde test ettik. Biyoinformatik ve mikro RNA biyolojisi temel bilgi bu protokol için yararlıdır, ancak vazgeçilmez değildir. Biyoinformatik yaklaşımı, ilgili mikro RNA kombinasyonlarını ve TRK-11'i tanımlamak için önemlidir, ancak mikro RNA işlemeye aşinalık ölçülebilir bir şekilde bu farklı mikro RNA'ların belirli hücrelere stabil hale geldiklerinde başarılı bir şekilde işlenebilen yapay DNA kümeleri halinde nasıl biraraya getirilebildiğini anlamak için önemlidir.Çanak kaplama için, ilk mililitre başına 100 mikrogram konsantrasyonda suda poli-D-lizin eritin. 25 santimetre kare yüzeybaşına bir mililitre çözelti miktarında çözeltiyi tabağa dökün. Tüm çanak kapsama emin olmak için çanak girdap.Altı saat sonra poli-D-lizin çözeltisini aspire edin ve PBS ile iki kez durulayın. Orta hücre orta, astrositik farklılaşma orta veya nöronal farklılaşma orta ya da orta beş mililitre başına 100, 000 hücre miktarında plaka insan nöral kök hücreleri. Hücre kaplamasonra, bir hafta boyunca 37 derece santigrat ve yüzde beş karbondioksit bir kuvöz de çanak yerleştirin ve el yazmasına göre mikro RNA ifade analizi gerçekleştirmek için devam edin.Kültür IÇIN GBM-34 glioblastoma kök benzeri hücreler, bir kez on beşinci hücreler ve nörobazal orta beş mililitre ile 25 santimetre kare düşük eki şişe başlar. Şişeyi 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte bir kuvöze yerleştirin. Kaplamadan 48 saat sonra, her yedi günde bir DNA alkilleyici ajan temozolomid konsantrasyonlarını iki katına ekleyin.Beş gün boyunca beş mililitre orta takviye beş mikromolar TMZ eklenmesi ile başlayın. Beş gün sonra, orta kaldırmak ve temozolomide olmadan taze orta ile kalan hücrelerin kurtarmak için izin vermek için değiştirin. 48 saat sonra, başka bir beş gün için 10 mikromolar temozolomide ve kuluçka ekleyin.En az 100 mikromolar konsantrasyonu ulaşılana ve hücreler ilaca dirençli hale gelene kadar katlama temozolomid tedavisini tekrarlayın. Direnç indüksiyonundan sonra, 1 mililitre Lysis reaktifi kullanarak yalan hücreleri. Toplam RNA ayıklayın ve el yazmasına göre spesifik mikro RNA'ların ekspresyonunu analiz edin.Daha önce tanımlanan her mikro RNA'nın öngörülen targetome'sini elde etmek için mikro RNA hedefleme tahmin araçlarını kullanın. TargetScan'ın ön sayfasından, önceden doldurulmuş açılır menüden ilgi çeken mikro RNA'yı seçin. Gönder düğmesini tıklatın.İndirme tablosu bağlantısını kullanarak ortaya çıkan hedef listesini elektronik tablo olarak indirin. Yanlış pozitif tahmin olasılığını azaltmak için, yalnızca korunan siteler sütunu ve akış aşağı analizi içindeki hedefleri içerir. Ek mikro RNA tahmin programları daha fazla sıkılık elde ve sadece tüm algoritmalar için ortak hedefleri içerir.Sonra, ToppGene 20'yi aç. Her mikro RNA'da ortak olan yolların zenginleşmesini değerlendirmek için, eğitim gen kümeleri penceresinde elde edilen hedeflerin listesini yapıştırın. Giriş türü olarak HGNC Sembolü'ne tıklayın.Gönder ve başlat'ı tıklatın. Program genlerin girilen listesi için en önemli GO kategorilerini gösteren bir çıktı tablosu sağlar. Sonunda ortak bir yol veya hücresel sürecin düzenlenmesi için her mikro RNA katkısını kurmak için, Biyoinformatik ve Evrimsel Genomik web sitesinde sağlanan venn-diyagram fonksiyonu açın.Elde edilen her targetome'yi belirli hücresel süreçte yer alan genlerin tam listesine karşı kontrol edin. İlgi çeken her mikro RNA'lar için hedef haberci RNA'ları ilgili pencerelerdeyse, listeyi kopyala-yapıştır'ı yükleyin. Her listeyi benzersiz bir tanımlayıcıyla adlandırın.Gönder'i tıklatın. Program her sektörde genlerin numaraları ile bir venn-diyagram görsel bir çıkış yanı sıra her alt küme ve kesişim kombinasyonları için haberci RNA tam bir listesini sağlar. Seçilen mikro RNA'ları fonksiyonel trans gende gruplandırmak için miR-17-92 küme lokusu temel alınarak transgenik bir iskele elde edin.Topluluklu genom tarayıcısından nükleotit dizisini edinin. Lokusun altı kodlanmış mikro RNA saç tokasını ve çekirdek dizisinin hem akıntıya hem de aşağı akışına kadar en az 200 nükleotit yan dizisini kapsayan yaklaşık 800 baz çifti çekirdek dizisini seçin. Sırayı herhangi bir sözcük düzenleme programına yapıştırın.MiR tabanında nisasında alarak altı doğal saç piminin her birinin dizisini tanımlayın. Bu dizilerin her birini daha önce tanımlanmış çekirdek dizisinin açıklığı içinde işaretleyin. Her saç tokası arasındaki tüm diziler spacer dizilerini temsil eder.Daha sonra, miR tabanından trans genifade edilmesi amaçlanan mikro RNA'ların saç tokası dizilerini elde edin. Mikro işlemci bölünmesi nin olduğu yerlerdeki spesifik nükleotitleri dikkatlice not edin. Yeni saç tokaları için bir kabul olarak hizmet edecek her saç tokası hem beş ve thee biter üç ila beş nükleotitler hariç çekirdek dizisinden yerli saç tokası dizileri silin.Daha önce silinmiş saç tokaları yerine istenilen mikro RNA'ların saç tokası dizilerini yapıştırın. Trans geninin her iki yan bölgesine de istenilen kısıtlama dizilerini ekleyerek alt klonlamayı tercih edilen teslim vektörlerine ekleyin. Seçilen kısıtlama dizilerinin dizinin içinde bulunmadığını doğrulayın.Trans genin iki boyutlu yapısını doğrulamak için, tam transgenik sırayı RNA yapı tahmin yazılımı programı RNA Webfold'a kopyalayın. Standart program ayarlarını seçin ve devam et'i tıklatın. Özellikle mikro işlemci dekolte sit alanına en az 11 nükleotit proksimal olan çift telli kök yapılarının varlığında iyi tanımlanmış saç tokalarının varlığı için grafik çıktısını analiz edin.Ayrıca, saç tokası dizileri içinde dallanma noktalarının yokluğu na bakın. Bu noktada trans gen gen sentezi ile üretilmeye ve istenilen iletim vektörlerine klonlenmeye hazırdır. Bu yöntem, nöronal farklılaşma sırasında özellikle ifade edilen beyin tümörlerinde sürekli olarak düzenlenmiş olan üç mikro RNA'dan oluşan bir modülün karakterizasyonuna olanak sağlamıştır.Genotoksik stres sırasında mikro RNA modüllerinin ko-ekspresyon desenleri doğrulandı ve bu üç mikro RNA arasında güçlü bir sinerjik aktivite önerdi. Tasarlanan trans gen aynı anda glioblastoma hücrelerinde üç mikro RNA ekspresyonunu özetleyebilir, hem in vitro hem de in vivo, tümör biyolojisinde önemli bir girişim ve çevirisel uygulanabilirlik vaat edilir. Ayrıca, transgenik küme de bir meme kanseri modelinde fonksiyonel oldu.Bu protokolün en önemli gereksinimleri trans gendeki işlemci dekoltesinin orijinal boyutunu korumaktır. Ve şimerik mikro RNA saç tokalarının kök döngü yapısının korunduğundan emin olun. Bu yöntemle, birden fazla biyolojik olarak aktif mikro RNA genini çok kısa DNA dizilerine yoğunlaştırabiliriz ve bu da gen terapisi için herhangi bir doğum vektörlerine tam anlamıyla vitrrol takılabilir.Bu yöntem, farklı mikro RNA'lar arasındaki fonksiyonel etkileşimi incelemek ve aksi takdirde birden fazla ilaç kombinasyonu gerektirecek karmaşık multifaktöriyel hücresel yolları müdahale etmek için idealdir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...