Name: visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

ويشكر أصحاب البلاغ السيدة سوتو والدكتور يو والدكتور أوكتو على التوجيه وكذلك على التعليقات على النص. هذا العمل معتمد من قبل NS060677.

أجريت التجارب الحيوانية في هذه الدراسة وفقا للمعهد الوطني للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ووافقت عليها لجنة البحوث الحيوانية المستشار في جامعة كاليفورنيا، لوس انجليس. استخدمت الفئران البالغة (6-8 أسابيع) من الجنس المختلط في جميع التجارب.
1. إعداد الحلول
<ol><li...

<ol>
	<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits.">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).</li><li>Ben Haim, L., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+astrocytes+in+neural+circuit+regulation.">Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).</li><li>Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+Shapeshifter:+Mechanisms+Allowing+Astrocytes+to+Respond+to+the+Changing+Nervous+System+During+Development,+Injury+and+Disease.">Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Circuit-Specialized+Astrocytes:+Transcriptomic,+Proteomic,+Morphological,+and+Functional+Evidence.">Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Sun, D., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+astrocytes+in+the+injured+CNS.">Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS.</a> Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).</li><li>Naskar, S., Chattarji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Elicits+Contrasting+Effects+on+the+Structure+and+Number+of+Astrocytes+in+the+Amygdala+versus+Hippocampus.">Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus.</a> eNeuro. 6 (1), (2019).</li><li>Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+spatial+arrangement+of+astrocytes+in+the+optic+nerve+head+of+the+mouse.">The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).</li><li>Grosche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+simple+approach+to+determine+astrocyte+territories+in+mouse+neocortex+and+hippocampus.">Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).</li><li>Kaynig, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automatic+reconstruction+of+neuronal+processes+from+electron+microscopy+images.">Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images.</a> Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Wilhelmsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+concept+of+reactive+astrocytes+as+cells+that+remain+within+their+unique+domains+upon+reaction+to+injury.">Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).</li><li>Williams, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-9+regulates+synapse-specific+differentiation+in+the+developing+hippocampus.">Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus.</a> Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Astrocyte+Water+Channel+Aquaporin-4+in+the+Mouse+Brain.">Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain.</a> ASN Neuro. 7 (5), (2015).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).</li><li>Luna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+structural+reactivity+and+plasticity+in+models+of+retinal+detachment.">Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).</li><li>Octeau, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optical+Neuron-Astrocyte+Proximity+Assay+at+Synaptic+Distance+Scales.">An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales.</a> Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).</li><li>Sosunov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+isocortical+and+hippocampal+astrocytes+in+the+human+brain.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).</li><li>Park, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Specificity+and+Coverage+of+hGFAP-CreERT2+[Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc]+Mouse+Line+in+Various+Brain+Regions.">Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions.</a> Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).</li><li>Koeppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Consequences+of+Synapse+Remodeling+Following+Astrocyte-Specific+Regulation+of+Ephrin-B1+in+the+Adult+Hippocampus.">Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).</li><li>Jefferis, G. S., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+and+combinatorial+neuron+labelling.">Sparse and combinatorial neuron labelling.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).</li><li>Lanjakornsiripan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+morphological+and+molecular+differences+in+neocortical+astrocytes+and+their+dependence+on+neuronal+layers.">Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).</li></ol>

الطريقة المبينة في هذه الورقة تصف طريقة لتصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس داخل الخلايا من صبغ LY في شرائح الدماغ ثابتة قليلا. هناك العديد من العوامل الحاسمة التي تم تسليط الضوء عليها في هذا البروتوكول التي تسهم في نجاح LY الأيونتوبهوريسوإعادحي المورفولوجية للخلايا...

الخلايا النجمية هي الخلايا الغليفية الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS). أنها تلعب أدوارا في التوازن أيون, تنظيم تدفق الدم, تشكيل متشابك، فضلا عن القضاء, والناقل العصبي التناول1. وينعكس مجموعة واسعة من وظائف الخلايا النجمية في بنيتها المورفولوجية المعقدة2،3. تحتوي الخلايا النجمية على العديد من الفروع الأولية والثانوية التي تنقسم إلى الآلاف من الفروع الدقيقة والمنشورات التي تتفاعل مباشرة مع نقاط الاشتباك العصبي، dendrites، المحاور، الأوعية الدموية، وغيرها من الخلايا الدبقية. يختلف مورفولوجيا الخلايا النجمية عبر مناطق الدماغ المختلفة، والتي قد تلمح إلى قدرتها على أداء وظائفها بشكل تفاضلي في الدوائر العصبية4. وعلاوة على ذلك، من المعروف أن الخلايا النجمية لتغيير مورفولوجيا أثناء التنمية، وخلال الظروف الفسيولوجية، وفي حالات المرض متعددة3،5،6.
هناك حاجة إلى طريقة متسقة، قابلة للاستنساخ لحل بدقة تعقيد مورفولوجيا الخلايا النجمية. تقليديا، وقد استخدمت الكيمياء المناعية لتصور الخلايا النجمية مع استخدام علامات البروتين الغنية بالخلايا النجمية أو astrocyte محددة. ومع ذلك، تكشف هذه الطرق عن نمط التعبير البروتين بدلاً من بنية الخلايا النجمية. علامات شائعة الاستخدام، مثل البروتين الحمضي الفيبريلي الغليفي (GFAP) وS100 بروتين الكالسيوم ملزمة β (S100β)، لا تعبر في حجم الخلية بأكمله، وبالتالي لا تحل مورفولوجيا كاملة7. يمكن للنهج الوراثية للتعبير عن البروتينات الفلورية في كل مكان في الخلايا النجمية (الحقن الفيروسية أو خطوط مراسل الماوس المعدلة وراثيا) تحديد الفروع الدقيقة والأراضي عموما. ومع ذلك، فمن الصعب التمييز بين الخلايا النجمية الفردية، والتحليلات قد تكون متحيزة من قبل السكان astrocyte المستهدفة من قبل المروج محددة8. وقد استخدم المقطع التسلسلي مجهري الإلكترون للكشف عن صورة مفصلة للتفاعلات من عمليات الخلايا النجمية مع نقاط الاشتباك العصبي. بسبب الآلاف من عمليات الخلايا النجمية الاتصال نقاط الاشتباك العصبي، فإنه من غير الممكن حاليا لإعادة بناء خلية كاملة مع هذه التقنية9، على الرغم من أن هذا من المتوقع أن تتغير مع استخدام نهج التعلم الآلي لتحليل البيانات.
في هذا التقرير، نركز على إجراء لتوصيف الخلايا النجمية للماوس باستخدام أيونتوبهوريس داخل الخلايا مع صبغة لوسيفر الصفراء (LY)، وذلك باستخدام أشعة الطبقة CA1 كمثال. ويستند الأسلوب على العمل السابق الرائد من قبل اريك Bushong ومارك Ellisman10،11. يتم تحديد الخلايا النجمية من شرائح الدماغ ثابتة بخفة من خلال شكل هاسيما مميزة ومليئة LY. ثم يتم تصوير الخلايا مع الفحص المجهري البؤري. نبين كيف يمكن استخدام الأيونوفوريسيس LY لإعادة بناء الخلايا النجمية الفردية وإجراء تحليلات مورفولوجية مفصلة لعملياتها وأراضيها. أيضا، يمكن تطبيق هذه الطريقة جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية لتحديد العلاقات المكانية والتفاعلات بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية، والخلايا الدبقية الأخرى، والأوعية الدموية في الدماغ. ونحن نعتبر LY iontophoresis لتكون أداة مناسبة جدا لتحليل مورفولوجيا في مناطق الدماغ المختلفة ونماذج الماوس من الظروف الصحية أو المرض7،12،13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:995px;" width="994">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">SF 100-20</td>
			<td style="width:240px;">An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:192px;">Pall</td>
			<td style="width:196px;">4692</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ag/AgCl ground pellet</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP2</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti Aquaporin-4 antibody</td>
			<td style="width:192px;">Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-87679</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti GFAP antibody</td>
			<td style="width:192px;">Abcam</td>
			<td style="width:196px;">ab4674</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass pipettes with filament</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6NTac mice</td>
			<td>Taconic Stock</td>
			<td style="width:196px;">B6</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td style="width:192px;">Olympus</td>
			<td style="width:196px;">FV1000MPE</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode puller- Model P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td style="width:196px;">P-97</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:196px;">0100-01</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td>
			<td style="width:192px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>400-10</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris software (Version 7.6.5)</td>
			<td style="width:192px;">Bitplane Inc.</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:192px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)</td>
			<td style="width:192px;">Clipper</td>
			<td>1050035</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:196px;">24X60-1</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">12-544-2</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:192px;">Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (40x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:196px;">LUMPLFLN 40XW</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (60x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanAPO 60X</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS tablets, 100 mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td>VWRVE404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pipette micromanipulator- Model ROE-200</td>
			<td style="width:192px;">Sutter</td>
			<td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulator- Model Omnical 2010</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">Omnical 2010</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">T8787</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome- Model #3000</td>
			<td style="width:192px;">Pelco</td>
			<td style="width:196px;">100-S</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis

الخلايا النجمية هي مكونات أساسية للدوائر العصبية. أنها البلاط الجهاز العصبي المركزي بأكمله (CNS) وتشارك في مجموعة متنوعة من الوظائف, التي تشمل إزالة الناقل العصبي, تنظيم أيون, تعديل متشابك, دعم التمثيل الغذائي للخلايا العصبية, وتنظيم تدفق الدم. الخلايا النجمية هي خلايا معقدة تحتوي على سوما، والعديد من الفروع الرئيسية، والعديد من العمليات الدقيقة التي تتصل بالعناصر الخلوية المتنوعة داخل neuropil. من أجل تقييم مورفولوجيا الخلايا النجمية ، من الضروري أن يكون لديك طريقة موثوقة واستنساخ لتصور بنيتها. نحن الإبلاغ عن بروتوكول موثوق به لأداء الأيونتوبهوريس داخل الخلايا من الخلايا النجمية باستخدام الفلورسنت لوسيفر الأصفر (LY) صبغ في أنسجة الدماغ ثابتة طفيفة من الفئران الكبار. هذه الطريقة لديها العديد من الميزات التي هي مفيدة لوصف مورفولوجيا الخلايا النجمية. وهو يسمح بإعادة بناء الخلايا النجمية الفردية ثلاثية الأبعاد، وهو أمر مفيد لإجراء تحليلات مورفولوجية على جوانب مختلفة من هيكلها. الكيمياء المناعية جنبا إلى جنب مع الأيونتوبهوريسيسي LY يمكن أيضا أن تستخدم لفهم تفاعل الخلايا النجمية مع مكونات مختلفة من الجهاز العصبي وتقييم التعبير عن البروتينات داخل الخلايا النجمية المسمى. ويمكن تنفيذ هذا البروتوكول في مجموعة متنوعة من نماذج الماوس من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي لفحص دقيق مورفولوجيا الخلايا النجمية مع الفحص المجهري الخفيف. يوفر داء الأيونتوبهوريس لي نهجا تجريبيا لتقييم بنية الخلايا النجمية، وخاصة في سياق الإصابة أو المرض حيث يقترح أن تخضع هذه الخلايا لتغيرات مورفولوجية كبيرة.

البيانات الواردة في هذه الدراسة هي من 7-12 خلية من 4 فئران في كل تجربة. ويُبلَّغ عن متوسط البيانات في أفرقة الأرقام حسب الاقتضاء.
لتقييم مورفولوجيا الخلايا النجمية، قمنا بإجراء تيونات الخلايا باستخدام صبغLY لملء الخلايا النجمية في الطبقة CA1 رادياتوم، والتي يتم تلخيصها في <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

الخلايا النجمية هي خلايا معقدة من الناحية الشكلية، وتتمثل في عملياتها المتعددة وأراضيها الكثيفة. لتحليل مورفولوجيا تفصيلا، ونحن نقدم بروتوكول موثوق بها لأداء الأيونتوبهوريس الأصفر داخل الخلايا في الأنسجة الثابتة طفيفة.

تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس الأصفر لوسيفر

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

يمكن استخدام هذه الطريقة لتسهيل التصور من العمليات الفلكية غرامة جدا لتقييم التفاعلات العصبية الفلكية في المشبك أثناء المرض والدول ثابتة. يمكن تطبيق هذه التقنية أيضا في أي نموذج الماوس أو مجموعة الخلايا أو منطقة الدماغ. لإعداد قطب حاد مع مقاومة مناسبة، سحب قطب واحد للبرميل زجاج البورسليكات مع خيوط على سحب ميكرويبيت.تخزين الأقطاب الكهربائية المسحوبة في حاوية مغلقة لمنع الغبار من دخول النصائح والحفاظ على الأقطاب مرتفعة من أسفل المربع لمنع النصائح من كسر. لملء قطب كهربائي مع محلول صبغ أصفر لوسيفر، وضع القطب في موقف عمودي مع الحافة التي تواجه الهبوط، والماصات واحد إلى اثنين من ميكرولترات من محلول أصفر لوسيفر في الجزء الخلفي من القطب. انتظر من خمس إلى عشر دقائق حتى ينتقل المحلّل إلى الطرف عبر عمل الشعيرات الدموية قبل تأمين القطب المليء برفق في حامل قطب كهربائي متصل بجهاز مناور مع السلك الفضي لمالك القطب الكهربائي المتلامس مع الأصفر المُلِك داخل القطب.لاختبار طرد الصبغة، ضع بلطف شريحة الدماغ ثابتة طفيفة في طبق أسفل الزجاج مليئة 0.1 PBS الضرس في درجة حرارة الغرفة وعقد شريحة في مكان مع القيثارة البلاتين مع سلاسل النايلون. قم بتوصيل القطب الكهربائي بمصدر جهد كهربائي ووضع القطب الأرضي في الحمام الذي يحتوي على شريحة الدماغ. نقل الهدف من المجهر confocal إلى منطقة الدماغ من الفائدة وخفض القطب في الحل باستخدام عدسة غمر الماء 10X، ونقل القطب إلى مركز مجال الرؤية.تحت الإضاءة في الميدان الساطع، قم بفحص القطب الكهربائي بعناية باستخدام عدسة غمر الماء 40X لضمان أن القطب يبدو واضحًا وبدون حطام أو فقاعات. قم بالتبديل إلى التصوير المجهري بالليزر confocal باستخدام ليزر 488 نانومتر. بدوره على محفز في 12 فولت لاختبار طرد صبغة.وينبغي أن تكون سحابة صبغة الفلورسنت الكبيرة مرئية حول طرف القطب. ثم، تحت حقل مشرق انخفاض ببطء القطب نحو شريحة، ووقف فقط فوق السطح. لملء استروسيتي من الفائدة مع أيونتوبهورسيس، استخدم التداخل التفاضلي الأشعة تحت الحمراء النقيض لتحديد astrocytes مع سوماتا بيضاوية ممدود الشكل حوالي 10 ميكرومتر في القطر، 40 إلى 50 ميكرومتر تحت سطح الشريحة.هذا هو شعاع الطبقة من قرن آمون مباشرة تحت طبقة الخلية الهرمية. ونحن نتحرك من خلال الأنسجة، يمكننا أن نرى الأوعية الدموية، والخلايا العصبية، الخلايا الفلكية، وأنواع الخلايا الأخرى. بمجرد اختيار استروسيتيت، قم بتحريك الخلية إلى مركز مجال الرؤية وخف ببطء طرف القطب الكهربائي إلى الشريحة، وانتقل عبر الأنسجة حتى يصبح القطب على نفس هيئة الخلية.مرة واحدة في الجسم الخلية من astrocyte مرئيا بوضوح والمبينة، ببطء وبلطف تقدم القطب إلى الأمام، وتحريك القطب حتى تلميح impales سوما من الخلية. نقل التركيز من الهدف ببطء صعودا وهبوطا إلى ملاحظة إذا كان القطب الكهربائي داخل سوما. بمجرد أن يكون طرف القطب داخل الخلية، قم بتشغيل المحفّز عند 0.5 إلى فولت واحد لإخراج التيار باستمرار إلى الخلية.باستخدام المجهر confocal، ومشاهدة فيلم الخلية، وزيادة التكبير الرقمي لتصور تفاصيل الخلية والتأكد من أن غيض من القطب مرئية داخل الخلية عند الضرورة. انتظر حوالي 15 دقيقة حتى تظهر الفروع والعمليات الدقيقة معرفة قبل إيقاف الجهد الكهربائي وسحب طرف القطب الكهربائي بلطف من الخلية. لصورة الخلية المعبأة، انتظر 15 إلى 20 دقيقة حتى تعود الخلية إلى شكلها الأصلي قبل ضبط الإعداد على المجهر confocal للتأكد من أن الفروع والعمليات الدقيقة تظهر محددة تحت الهدف 40X.قم بإعداد مكدس Z بحجم خطوة 0.3 ميكرومتر، وتحريك الهدف أثناء التصوير حتى لا تكون هناك إشارة من الخلية وتعيين تلك الخطوة على أنها الأعلى. ثم نقل الهدف إلى أسفل، مع التركيز من خلال الخلية حتى لا يكون هناك إشارة وتعيين تلك الخطوة كما في أسفل. بعد اكتمال التصوير، تحقق من القطب الكهربائي للبحث عن طرد الصبغة.إذا ظهرت سحابة صبغ كبيرة، يمكن استخدام القطب للشريحة التالية. خلاف ذلك، استبدال القطب. من خلال توليد إسقاط كثافة القصوى ، يمكن ملاحظة عرض مفصل لبنية الفلكية في مجالها.وهناك أربعة X حجم التكبير في الفلكية يكشف عن إسقاط كثافة القصوى من فرع رئيسي واحد، والعديد من الفروع الثانوية، وتوزيع الفروع المحيطة والنشرات. هنا، يتم عرض الصورة الأصلية لـ CA1 astrocyte. يتم إعادة بناء جسم الخلية والفروع الرئيسية والعمليات وحجم الأراضي المحاطة بـ astrocyte في هذه الصور اللاحقة.بعد إنشاء عمليات إعادة الإعمار، تم تحديد كميات من سوما، الخلية بأكملها، والأراضي. وعدد الفروع الرئيسية تم عدّه. كما يتم التعبير عن البروتين الخلوي الهيكلي أن التسميات خيوط الفلكية المتوسطة في soma الخلية، والفروع الرئيسية، وبعض فروع استروسيات الثانوية، ولكن ليس في الفروع والعمليات الدقيقة.في هذا التحليل التمثيلي، لم يتم العثور على اختلافات كبيرة في عدد الفروع الأولية التي تحمل اسم البروتين حمضي الرجفاني الدغلي وتلك التي تصور بواسطة الأصفر لوسيفر. وعلاوة على ذلك، كانت منطقة الخلية وحجم استروسايت المسمى بالبروتين حمضي الرجيلي الدليليس أصغر بكثير من المنطقة والحجم المرئي مع الأصفر لوسيفر، مما يدل على أن البروتين حمضي الرجلين الدبقية هو علامة موثوق بها لوضع العلامات على الفروع الرئيسية ولكن ليست مفيدة لتحديد المنطقة الكلية أو حجم الخلية. كمية الصبغة التي تم إطلاقها من طرف القطب يعتمد على مقاومة القطب الذي يجب أن يكون عاليًا بما يكفي للسماح بتدفق ثابت من الصبغة ليتم إخراجه.يمكن للدراسات المستقبلية دراسة المكونات المختلفة للبنية الفلكية عن طريق المجهر الخفيف فائق الدقة أو التحليل المناعي لبروتينات محددة داخل بنية الأستروسيات.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

تصور الآثار المترتبة على تجربة إيجابية في وقت مبكر، اللمس تحفيز، على مورفولوجيا شجيري ومتشابك الربط مع جولجي كوكس تلطيخ

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

وغير المباشرة العصبية نجمية Coculture الفحص: هناك<em&gt; في المختبر</em&gt; مجموعة المتابعة للتحقيق مفصل من التفاعلات العصبية، الدبقية

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

رصد مفاعليه Astrocyte والانتشار في المختبر تحت ظروف أشبه بالسكتة

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

تحليل الجذعية الصرف في الأعمدة والطبقات

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

في الوقت الحقيقي الرحلان الشاردي مع تيتراميثيلامونيوم لكمية حجم الكسر و تورتوسيتي من الدماغ خارج الخلية الفضاء

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

تحديد التعبير عن سطح الخلية ومعدل إندوسيتيك من البروتينات في الثقافات أستروسيت الابتدائية باستخدام بيوتينيلاتيون

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

الرقم الهيدروجيني رواية حية في المختبر -تصوير بوساطة "الإنزيم Astrocyte البلعمه استخدام" مؤشر مترافق سينابتوسوميس

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

التحديد الكمي مورفولوجية Microglia من Photomicrographs Immunohistochemistry استعداد النسيج باستخدام إيماجيج

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...