Name: visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

Forfatterne takker fru Soto, Dr. Yu, og Dr. Octeau for vejledning samt kommentarer til teksten. Dette arbejde understøttes af NS060677.

Dyreforsøgene i denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med National Institute of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af kanslerens dyre forskningsudvalg ved University of California, Los Angeles. Voksne mus (6 − 8 uger gamle) af blandet køn blev anvendt i alle forsøg.
1. klargøring af opløsningen
<ol><li>
Kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) opløsning
	<ol>
<li>Forbered frisk ACSF opløsning (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl...

<ol>
	<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits.">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).</li><li>Ben Haim, L., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+astrocytes+in+neural+circuit+regulation.">Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).</li><li>Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+Shapeshifter:+Mechanisms+Allowing+Astrocytes+to+Respond+to+the+Changing+Nervous+System+During+Development,+Injury+and+Disease.">Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Circuit-Specialized+Astrocytes:+Transcriptomic,+Proteomic,+Morphological,+and+Functional+Evidence.">Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Sun, D., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+astrocytes+in+the+injured+CNS.">Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS.</a> Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).</li><li>Naskar, S., Chattarji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Elicits+Contrasting+Effects+on+the+Structure+and+Number+of+Astrocytes+in+the+Amygdala+versus+Hippocampus.">Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus.</a> eNeuro. 6 (1), (2019).</li><li>Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+spatial+arrangement+of+astrocytes+in+the+optic+nerve+head+of+the+mouse.">The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).</li><li>Grosche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+simple+approach+to+determine+astrocyte+territories+in+mouse+neocortex+and+hippocampus.">Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).</li><li>Kaynig, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automatic+reconstruction+of+neuronal+processes+from+electron+microscopy+images.">Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images.</a> Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Wilhelmsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+concept+of+reactive+astrocytes+as+cells+that+remain+within+their+unique+domains+upon+reaction+to+injury.">Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).</li><li>Williams, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-9+regulates+synapse-specific+differentiation+in+the+developing+hippocampus.">Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus.</a> Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Astrocyte+Water+Channel+Aquaporin-4+in+the+Mouse+Brain.">Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain.</a> ASN Neuro. 7 (5), (2015).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).</li><li>Luna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+structural+reactivity+and+plasticity+in+models+of+retinal+detachment.">Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).</li><li>Octeau, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optical+Neuron-Astrocyte+Proximity+Assay+at+Synaptic+Distance+Scales.">An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales.</a> Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).</li><li>Sosunov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+isocortical+and+hippocampal+astrocytes+in+the+human+brain.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).</li><li>Park, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Specificity+and+Coverage+of+hGFAP-CreERT2+[Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc]+Mouse+Line+in+Various+Brain+Regions.">Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions.</a> Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).</li><li>Koeppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Consequences+of+Synapse+Remodeling+Following+Astrocyte-Specific+Regulation+of+Ephrin-B1+in+the+Adult+Hippocampus.">Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).</li><li>Jefferis, G. S., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+and+combinatorial+neuron+labelling.">Sparse and combinatorial neuron labelling.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).</li><li>Lanjakornsiripan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+morphological+and+molecular+differences+in+neocortical+astrocytes+and+their+dependence+on+neuronal+layers.">Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).</li></ol>

Den metode, der er skitseret i dette papir beskriver en måde at visualisere astrocyt morfologi ved hjælp af intracellulær iontophorese af LY farvestof i let fast hjernen skiver. Der er flere kritiske faktorer fremhævet i denne protokol, der bidrager til vellykket ly iontoforese og morfologiske rekonstruktion af cellerne. En faktor er kvaliteten og reproducerbarhed af billederne, som er bestemt i høj grad af alder af musen og resultatet af perfusion. I denne undersøgelse brugte vi C57/BL6N mus 6 − 8 uger gamle. En...

Astrocytter er de mest rigelige gliale celler i centralnervesystemet (CNS). De spiller roller i ion homøostase, blodgennemstrømning regulering, synapse dannelse samt elimination, og neurotransmitter optagelse1. Den brede vifte af astrocyt funktioner afspejles i deres komplekse morfologiske struktur2,3. Astrocytter indeholder flere primære og sekundære grene, som opdeles i tusindvis af finere branchlets og foldere, der direkte interagerer med synapser, dendritter, axoner, blodkar og andre gliale celler. Astrocyte morfologi varierer på tværs af forskellige hjerneområder, som kan antyde deres evne til at udføre deres funktioner differentielt i neuronal kredsløb4. Desuden, astrocytter er kendt for at ændre deres morfologi under udvikling, under fysiologiske forhold, og i flere sygdomstilstande3,5,6.
En konsistent, reproducerbar metode er nødvendig for præcist at løse kompleksiteten af astrocyt morfologi. Traditionelt har immun histokemi været brugt til at visualisere astrocytter med brug af astrocyt specifikke eller astrocyt beriget protein markører. Men disse metoder afslører mønsteret af protein udtryk i stedet for strukturen af astrocyt. De almindeligt anvendte markører, såsom gliaceller fibrillært syreholdigt protein (GFAP) og S100 calcium bindende protein β (S100β), udtrykker ikke i hele cellens volumen og løser derfor ikke fuldstændig morfologi7. Genetiske tilgange til at udtrykke fluorescerende proteiner allestedsnærværende i astrocytter (virale injektioner eller transgene muse reporter linjer) kan identificere de finere grene og samlede territorium. Men det er svært at skelne individuelle astrocytter, og analyser kan være partisk af astrocyt populationen målrettet af den specifikke promotor8. Seriel sektion elektronmikroskopi er blevet brugt til at afsløre et detaljeret billede af samspillet mellem astrocyt processer med synapser. På grund af de tusindvis af astrocyt processer, der kontakter synapser, er det i øjeblikket ikke muligt at rekonstruere en hel celle med denne teknik9, selv om dette forventes at ændre sig med brugen af Machine Learning tilgange til dataanalyse.
I denne rapport fokuserer vi på en procedure til at karakterisere mus astrocytter ved hjælp af intracellulær iontophorese med Lucifer Yellow (LY) farvestof, ved hjælp af Carnot stratum radiatum som et eksempel. Metoden er baseret på banebrydende tidligere arbejde af Eric Bushong og Mark Ellisman10,11. Astrocytter fra let fast hjerne skiver er identificeret ved deres karakteristiske Soma form og fyldt med LY. Cellerne er derefter afbildet med confokal mikroskopi. Vi demonstrerer, hvordan LY iontophorese kan bruges til at rekonstruere individuelle astrocytter og udføre detaljerede morfologiske analyser af deres processer og territorium. Denne metode kan også anvendes sammen med immun histokemi til at identificere rumlige relationer og interaktioner mellem astrocytter og neuroner, andre gliale celler og hjernens vaskulatur. Vi betragter ly iontoforese at være et meget velegnet værktøj til at analysere morfologi i forskellige hjerneområder og musemodeller af sunde eller sygdomstilstande7,12,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:995px;" width="994">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">SF 100-20</td>
			<td style="width:240px;">An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:192px;">Pall</td>
			<td style="width:196px;">4692</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ag/AgCl ground pellet</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP2</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti Aquaporin-4 antibody</td>
			<td style="width:192px;">Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-87679</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti GFAP antibody</td>
			<td style="width:192px;">Abcam</td>
			<td style="width:196px;">ab4674</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass pipettes with filament</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6NTac mice</td>
			<td>Taconic Stock</td>
			<td style="width:196px;">B6</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td style="width:192px;">Olympus</td>
			<td style="width:196px;">FV1000MPE</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode puller- Model P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td style="width:196px;">P-97</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:196px;">0100-01</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td>
			<td style="width:192px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>400-10</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris software (Version 7.6.5)</td>
			<td style="width:192px;">Bitplane Inc.</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:192px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)</td>
			<td style="width:192px;">Clipper</td>
			<td>1050035</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:196px;">24X60-1</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">12-544-2</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:192px;">Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (40x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:196px;">LUMPLFLN 40XW</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (60x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanAPO 60X</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS tablets, 100 mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td>VWRVE404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pipette micromanipulator- Model ROE-200</td>
			<td style="width:192px;">Sutter</td>
			<td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulator- Model Omnical 2010</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">Omnical 2010</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">T8787</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome- Model #3000</td>
			<td style="width:192px;">Pelco</td>
			<td style="width:196px;">100-S</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis

Astrocytter er essentielle komponenter i neurale kredsløb. De flise hele centralnervesystemet (CNS) og er involveret i en række forskellige funktioner, som omfatter neurotransmitter clearance, ionregulering, synaptisk modulation, metaboliske støtte til neuroner, og blodgennemstrømning regulering. Astrocytter er komplekse celler, der har en Soma, flere store filialer, og talrige fine processer, der kontakter forskellige cellulære elementer i neuropil. For at vurdere morfologien af astrocytter, er det nødvendigt at have en pålidelig og reproducerbar metode til at visualisere deres struktur. Vi rapporterer en pålidelig protokol til at udføre intracellulær iontophorese af astrocytter ved hjælp af fluorescerende Lucifer gul (LY) farvestof i let fast hjernevæv fra voksne mus. Denne metode har flere funktioner, der er nyttige til at karakterisere astrocyt morfologi. Det giver mulighed for tredimensionel rekonstruktion af individuelle astrocytter, hvilket er nyttigt at udføre morfologiske analyser på forskellige aspekter af deres struktur. Immun histokemi sammen med ly iontoforese kan også udnyttes til at forstå samspillet mellem astrocytter med forskellige komponenter i nervesystemet og til at evaluere ekspression af proteiner inden for de mærkede astrocytter. Denne protokol kan implementeres i en række musemodeller af CNS lidelser til nøje at undersøge astrocyt morfologi med lys mikroskopi. LY iontoforese giver en eksperimentel tilgang til at evaluere astrocyt struktur, især i forbindelse med skade eller sygdom, hvor disse celler er foreslået at gennemgå betydelige morfologiske ændringer.

De data, der rapporteres i dette studie, er fra 7 − 12 celler fra 4 mus i hvert eksperiment. Gennemsnitlige data rapporteres i figur panelerne, hvor det er relevant.
For at vurdere astrocyt morfologi udførte vi intracellulær iontophorese ved hjælp af LY Dye til at fylde astrocytter i kkstratum radiatum, som er opsummeret i figur 1. Figur 2 skildrer en repræsentativ astrocyt og dens udførlige morfologiske struktur. Cellen blev afbildet efter...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytter er morfologisk komplekse celler, eksemplificeret ved deres mange processer og Bushy territorier. For at analysere deres udførlige morfologi præsenterer vi en pålidelig protokol til at udføre intracellulær Lucifer gul iontophorese i let fast væv.

Visualisering af Astrocyt morfologi ved hjælp af Lucifer Yellow iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Denne metode kan bruges til at lette visualiseringen af meget fine astrocyt processer til evaluering af astrocyt neuronal interaktioner på synapsen under sygdom og stabile tilstande. Denne teknik kan også anvendes i enhver musemodel, cellepopulation eller hjerneregion. For at forberede en skarp elektrode med en passende modstand, trække en borosilikat glas enkelt tønde elektrode med en glødetråd på en mikropipette puller.Opbevar de trak elektroder i en lukket beholder for at forhindre støv i at trænge ind i spidserne og holde elektroderne forhøjet fra bunden af kassen for at forhindre spidserne i at bryde. For at fylde en elektrode med lucifer gul farveopløsning, placere en elektrode i lodret position med spidsen nedad, og pipette en til to mikroliter lucifer gul opløsning i bagsiden af elektroden. Vent fem til 10 minutter på, at opløsningen bevæger sig til spidsen via kapillær handling, før den fyldte elektrode forsigtigt fastgøres i en elektrodeholder, der er forbundet med en manipulator med elektrodeholderens sølvtråd i kontakt med lucifergulen inde i elektroden.Til farvestoffet udslyngning test, forsigtigt placere en let fastgjort hjerne skive i et glas bund fad fyldt med 0,1 molar PBS ved stuetemperatur og holde skiven på plads med en platin harpe med nylon strenge. Tilslut elektroden til en spændingskilde og læg jordelektroden i badet, der indeholder hjerneskiven. Flyt målet om et konfokalt mikroskop til hjernen region af interesse og sænke elektroden i løsningen ved hjælp af 10X vand nedsænkning linse, flytte elektroden til midten af synsfeltet.Under belysning med skarpt felt skal elektroden undersøges omhyggeligt med 40X vandnedsænkningslinsen for at sikre, at elektroden fremstår klar og uden snavs eller bobler. Skift til konfokal laserscanningmikroskopi med en 488-nanometerlaser. Tænd for stimulatoren ved 12 volt for at teste farvestoffets udslyngning.En stor fluorescerende farvestof sky bør være synlig omkring spidsen af elektroden. Derefter, under lyse-felt langsomt sænke elektroden mod skiven, stopper lige over overfladen. For at fylde en astrocyt af interesse med iontophoresis, skal du bruge den infrarøde differentialinterferens kontrast til at identificere astrocytter med aflange ovale somata omkring 10 mikrometer i diameter, 40 til 50 mikrometer under skivens overflade.Dette er hippocampus' stratumradiatum lige under pyramidecellelaget. Når vi bevæger os gennem vævet, kan vi se blodkar, neuroner, astrocytter og andre celletyper. Når en astrocyt er valgt, skal du flytte cellen til midten af synsfeltet og langsomt sænke elektrodespidsen ned i skiven og navigere gennem vævet, indtil elektroden er på samme slette som cellehuset.Når astrocytets cellekrop er klart synlig og skitseret, skal elektroden langsomt og forsigtigt frem og bevæge elektroden, indtil spidsen spidder somaen i cellen. Flyt fokus på målet langsomt op og ned for at bemærke, om elektroden er inde i soma. Når elektrodespidsen er inde i cellen, tændes stimulatoren ved 0,5 til en volt for løbende at skubbe strømmen ud i cellen.Brug det konfokale mikroskop, se cellefilmen, øge den digitale zoom for at visualisere detaljerne i cellen og for at sikre, at spidsen af elektroden er synlig inde i cellen efter behov. Vent i ca. 15 minutter, indtil de finere grene og processer vises defineret, før du slukker for spændingen og forsigtigt trækker elektrodespidsen ud af cellen. Hvis du vil afbilde den fyldte celle, skal du vente 15 til 20 minutter på, at cellen vender tilbage til sin oprindelige form, før du justerer indstillingen på det konfokale mikroskop for at sikre, at de finere grene og processer vises defineret under 40X-målet.Opret en Z-stak med en trinstørrelse på 0,3 mikrometer, der flytter målet, mens du afbildler, indtil der ikke er noget signal fra cellen, og angiv trinnet som toppen. Flyt derefter målet ned, med fokus gennem cellen, indtil der ikke er noget signal, og indstil dette trin som bund. Når billeddannelsen er færdig, skal elektroden kontrolleres for udslyngning af farvestoffet.Hvis der vises en stor farvesky, kan elektroden bruges til den næste skive. Ellers skal elektroden udskiftes. Ved at generere en maksimal intensitet projektion, en detaljeret visning af strukturen af en astrocyt i sit domæne kan observeres.En fire X størrelsesorden zoome ind i astrocyt afslører en maksimal intensitet projektion af en større gren, flere sekundære grene, og fordelingen af de omkringliggende branchlets og foldere. Her vises det originale billede af en CA1 astrocyt. Cellekroppen, større grene, processer og områdevolumen omgivet af astrocytet rekonstrueres i disse efterfølgende billeder.Efter rekonstruktionerne blev skabt, blev mængderne af soma, hele celle og territorium kvantificeret. Og antallet af store grene blev talt. Som cytoskeletal protein, der etiketter mellemliggende astrocyt filamenter er udtrykt i cellen soma, store grene, og nogle sekundære astrocyt grene, men ikke i de finere grene og processer.I denne repræsentative analyse blev der ikke fundet signifikante forskelle i antallet af primære grene mærket af glia fibrrillært surt protein, og dem, der visualiseres ved lucifergul. Endvidere var cellearealet og volumenet af astrocytet mærket af glia fibrillary acidic protein betydeligt mindre end det område og volumen visualiseret med lucifer gul, hvilket viser, at glia fibrillary acidic protein er en pålidelig markør for mærkning af større grene, men er ikke nyttig til bestemmelse af det samlede areal eller volumen af cellen. Mængden af farvestof, der frigives fra elektrodespidsen, afhænger af elektrodemodstanden, som skal være høj nok til, at en lind strøm af farvestof kan skubbes ud.Fremtidige undersøgelser kan undersøge de forskellige komponenter i astrocytstrukturen ved hjælp af superopløsningslymikroskopi eller ved immunhistokemisk analyse af ekspressionen af specifikke proteiner i astrocytstrukturen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Visualisere Virkninger af en positiv tidlige oplevelse, taktil stimulation, om Dendritiske morfologi og Synaptic Connectivity med Golgi-Cox Farvning

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Hurtig Mikro-iontophoresis af glutamat og GABA: et nyttigt redskab til Undersøge Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Den Indirekte Neuron-astrocyt cokultur assay: En<em&gt; In vitro</em&gt; Opsætning for detaljeret undersøgelse af Neuron-glia Interaktioner

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Overvågning Astrocyte reaktivitet og spredning in Vitro iskæmisk-lignende betingelser

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse Dendritiske Morfologi i Kolonner og Lag

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Real-time iontophorese med tetramethylammonium til kvantificering af volumen fraktion og tortuosity af hjernens ekstracellulære rum

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Bestemmelse af celleoverfladeekspression og endocytisk proteinhastighed i primære astrocytkulturer ved anvendelse af biotinylering

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

En roman In Vitro Live-imaging analyse af Astrocyte-medieret fagocytose bruger pH indikator-konjugeret Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Kvantificere mikroglia morfologi fra mikrofotografier af Immunhistokemi forberedt væv ved hjælp af ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...