Name: visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

De auteurs bedanken MS. Soto, Dr. Yu, en Dr. Octeau voor begeleiding, evenals opmerkingen over de tekst. Dit werk wordt ondersteund door NS060677.

De dier experimenten in deze studie werden uitgevoerd in overeenstemming met het National Institute of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de kanselier van de Dierenonderzoekscommissie van de Universiteit van Californië, Los Angeles. Bij alle experimenten werden volwassen muizen (6 − 8 weken oud) van gemengd geslacht gebruikt.
1. voorbereiding van de oplossing
<ol><li>
Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) oplossing</stro...

<ol>
	<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits.">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).</li><li>Ben Haim, L., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+astrocytes+in+neural+circuit+regulation.">Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).</li><li>Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+Shapeshifter:+Mechanisms+Allowing+Astrocytes+to+Respond+to+the+Changing+Nervous+System+During+Development,+Injury+and+Disease.">Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Circuit-Specialized+Astrocytes:+Transcriptomic,+Proteomic,+Morphological,+and+Functional+Evidence.">Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Sun, D., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+astrocytes+in+the+injured+CNS.">Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS.</a> Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).</li><li>Naskar, S., Chattarji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Elicits+Contrasting+Effects+on+the+Structure+and+Number+of+Astrocytes+in+the+Amygdala+versus+Hippocampus.">Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus.</a> eNeuro. 6 (1), (2019).</li><li>Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+spatial+arrangement+of+astrocytes+in+the+optic+nerve+head+of+the+mouse.">The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).</li><li>Grosche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+simple+approach+to+determine+astrocyte+territories+in+mouse+neocortex+and+hippocampus.">Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).</li><li>Kaynig, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automatic+reconstruction+of+neuronal+processes+from+electron+microscopy+images.">Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images.</a> Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Wilhelmsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+concept+of+reactive+astrocytes+as+cells+that+remain+within+their+unique+domains+upon+reaction+to+injury.">Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).</li><li>Williams, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-9+regulates+synapse-specific+differentiation+in+the+developing+hippocampus.">Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus.</a> Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Astrocyte+Water+Channel+Aquaporin-4+in+the+Mouse+Brain.">Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain.</a> ASN Neuro. 7 (5), (2015).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).</li><li>Luna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+structural+reactivity+and+plasticity+in+models+of+retinal+detachment.">Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).</li><li>Octeau, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optical+Neuron-Astrocyte+Proximity+Assay+at+Synaptic+Distance+Scales.">An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales.</a> Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).</li><li>Sosunov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+isocortical+and+hippocampal+astrocytes+in+the+human+brain.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).</li><li>Park, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Specificity+and+Coverage+of+hGFAP-CreERT2+[Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc]+Mouse+Line+in+Various+Brain+Regions.">Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions.</a> Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).</li><li>Koeppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Consequences+of+Synapse+Remodeling+Following+Astrocyte-Specific+Regulation+of+Ephrin-B1+in+the+Adult+Hippocampus.">Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).</li><li>Jefferis, G. S., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+and+combinatorial+neuron+labelling.">Sparse and combinatorial neuron labelling.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).</li><li>Lanjakornsiripan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+morphological+and+molecular+differences+in+neocortical+astrocytes+and+their+dependence+on+neuronal+layers.">Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).</li></ol>

De in dit artikel beschreven methode beschrijft een manier om de morfologie van astrocyten te visualiseren met behulp van intracellulaire iontforese van LY Dye in licht vaste hersen sneden. Er zijn verschillende kritische factoren die in dit protocol worden benadrukt en die bijdragen aan een succesvolle, zeer Iontoforese en morfologische reconstructie van de cellen. Een factor is de kwaliteit en reproduceerbaarheid van de beelden, die grotendeels wordt bepaald door de leeftijd van de muis en de uitkomst van de perfusie. ...

Astrocyten zijn de meest voorkomende gliacellen in het centrale zenuwstelsel (CNS). Ze spelen rollen in ion homeostase, bloedstroom regulatie, Synapse vorming evenals eliminatie, en neurotransmitter opname1. Het brede scala aan astrocyten functies wordt weerspiegeld in hun complexe morfologische structuur2,3. Astrocyten bevatten verschillende primaire en secundaire takken die verdelen in duizenden fijnere vertakkingen en folders die rechtstreeks interageren met synapsen, dendrites, axonen, bloedvaten en andere gliacellen. De morfologie van de astrocyten varieert in verschillende hersengebieden, wat kan hint naar hun vermogen om hun functies differentieel te vervullen in neuronale circuits4. Bovendien is bekend dat astrocyten hun morfologie veranderen tijdens de ontwikkeling, tijdens fysiologische omstandigheden, en in meerdere ziektetoestanden3,5,6.
Een consistente, reproduceerbare methode is nodig om de complexiteit van de morfologie van de astrocyten nauwkeurig op te lossen. Van oudsher wordt immunohistochemie gebruikt om astrocyten te visualiseren met het gebruik van specifieke astrocyten of verrijkte eiwit markers. Echter, deze methoden onthullen het patroon van eiwit expressie in plaats van de structuur van de astrocyten. De veelgebruikte markers, zoals gliacellen fibrillair zuur eiwit (GFAP) en S100 calcium bindende proteïne β (S100β), drukken niet in het gehele celvolume uit en lossen dus geen volledige morfologie7op. Genetische benaderingen om fluorescerende eiwitten te uiten die alomtegenwoordig zijn in astrocyten (virale injecties of transgene muis reporter lijnen) kunnen de fijnere takken en het gehele grondgebied identificeren. Het is echter moeilijk om individuele astrocyten te differentiëren en analyses kunnen bevooroordeeld zijn door de astrocyten populatie die de specifieke promotor8target. Seriële sectie elektronenmicroscopie is gebruikt om een gedetailleerd beeld te onthullen van de interacties van astrocyten processen met synapsen. Vanwege de duizenden astrocyten processen die contact opnemen met synapsen, is het momenteel niet mogelijk om een hele cel te reconstrueren met deze techniek9, hoewel dit naar verwachting verandert met het gebruik van machine learning-benaderingen voor gegevensanalyse.
In dit rapport richten we ons op een procedure voor het karakteriseren van muis astrocyten met behulp van intracellulaire Iontoforese met Lucifer geel (LY) Dye, met behulp van de CA1 stratum radiatum als voorbeeld. De methode is gebaseerd op baanbrekend werk van Eric Bushong en Mark Ellisman10,11. Astrocyten van licht vaste hersen sneden worden geïdentificeerd door hun kenmerkende Soma-vorm en gevuld met LY. De cellen worden vervolgens met een confocale microscopie afgebeeld. We laten zien hoe sterk Iontoforese kan worden gebruikt om individuele astrocyten te reconstrueren en gedetailleerde morfologische analyses van hun processen en territorium uit te voeren. Ook kan deze methode worden toegepast in combinatie met immunohistochemie om ruimtelijke relaties en interacties tussen astrocyten en neuronen, andere gliacellen en hersen vasculatuur te identificeren. We beschouwen ly iontopforesis als een zeer geschikt hulpmiddel om de morfologie in verschillende hersengebieden en Muismodellen van gezonde of ziekte aandoeningen7,12,13te analyseren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:995px;" width="994">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">SF 100-20</td>
			<td style="width:240px;">An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:192px;">Pall</td>
			<td style="width:196px;">4692</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ag/AgCl ground pellet</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP2</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti Aquaporin-4 antibody</td>
			<td style="width:192px;">Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-87679</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti GFAP antibody</td>
			<td style="width:192px;">Abcam</td>
			<td style="width:196px;">ab4674</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass pipettes with filament</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6NTac mice</td>
			<td>Taconic Stock</td>
			<td style="width:196px;">B6</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td style="width:192px;">Olympus</td>
			<td style="width:196px;">FV1000MPE</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode puller- Model P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td style="width:196px;">P-97</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:196px;">0100-01</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td>
			<td style="width:192px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>400-10</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris software (Version 7.6.5)</td>
			<td style="width:192px;">Bitplane Inc.</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:192px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)</td>
			<td style="width:192px;">Clipper</td>
			<td>1050035</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:196px;">24X60-1</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">12-544-2</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:192px;">Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (40x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:196px;">LUMPLFLN 40XW</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (60x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanAPO 60X</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS tablets, 100 mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td>VWRVE404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pipette micromanipulator- Model ROE-200</td>
			<td style="width:192px;">Sutter</td>
			<td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulator- Model Omnical 2010</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">Omnical 2010</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">T8787</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome- Model #3000</td>
			<td style="width:192px;">Pelco</td>
			<td style="width:196px;">100-S</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis

Astrocyten zijn essentiële componenten van neurale circuits. Ze tegel het gehele centrale zenuwstelsel (CNS) en zijn betrokken bij een verscheidenheid van functies, waaronder de klaring van de neurotransmitter, Ion regulatie, synaptische modulatie, metabole ondersteuning voor neuronen, en de regulering van de bloedstroom. Astrocyten zijn complexe cellen met een Soma, verschillende belangrijke takken en tal van fijne processen die verschillende cellulaire elementen in de neuro pil contacteren. Om de morfologie van astrocyten te beoordelen, is het noodzakelijk om een betrouwbare en reproduceerbaar methode te hebben om hun structuur te visualiseren. We rapporteren een betrouwbaar protocol voor het uitvoeren van intracellulaire Iontoforese van astrocyten met behulp van fluorescerende Lucifer geel (LY) kleurstof in licht vaste hersenweefsel van volwassen muizen. Deze methode heeft verschillende functies die nuttig zijn om de morfologie van astrocyten te karakteriseren. Het maakt de driedimensionale reconstructie van individuele astrocyten mogelijk, wat nuttig is om morfologische analyses uit te voeren op verschillende aspecten van hun structuur. Immunohistochemie samen met LY iontforesis kan ook worden gebruikt om de interactie van astrocyten met verschillende componenten van het zenuwstelsel te begrijpen en om de expressie van eiwitten binnen de gelabelde astrocyten te evalueren. Dit protocol kan worden geïmplementeerd in een verscheidenheid van Muismodellen van CZS-aandoeningen om de morfologie van astrocyten grondig te onderzoeken met lichte microscopie. LY Iontoforese biedt een experimentele benadering om de astrocyten structuur te evalueren, vooral in de context van letsel of ziekte, waarbij deze cellen worden voorgesteld om significante morfologische veranderingen te ondergaan.

De in deze studie gerapporteerde gegevens zijn van 7 − 12 cellen van 4 muizen in elk experiment. De gemiddelde gegevens worden in de deelvensters waar nodig gerapporteerd.
Om de morfologie van astrocyten te beoordelen, voerden we intracellulaire Iontoforese uit met behulp van LY Dye om astrocyten te vullen in het CA1 stratum radiatum, dat wordt samengevat in Figuur 1. Figuur 2 toont een representatieve astrocyten en de uitgebreide morfologische ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocyten zijn morfologisch complexe cellen, geïllustreerd door hun meerdere processen en bossige gebieden. Om hun uitgebreide morfologie te analyseren, presenteren wij een betrouwbaar protocol voor het uitvoeren van intracellulaire Lucifer gele Iontoforese in licht vast weefsel.

Visualisering van de morfologie van de astrocyten met behulp van Lucifer geel Iontforesis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Deze methode kan worden gebruikt om de visualisatie van zeer fijne astrocytenprocessen te vergemakkelijken voor de evaluatie van astrocytenneuronale interacties bij de synaps tijdens ziekte en stabiele toestanden. Deze techniek kan ook worden toegepast in elk muismodel, celpopulatie of hersengebied. Om een scherpe elektrode met een geschikte weerstand voor te bereiden, trekt u een borosilicaatglas single barrel elektrode met een gloeidraad op een micropipet trekker.Bewaar de getrokken elektroden in een gesloten container om te voorkomen dat stof in de uiteinden komt en houd de elektroden vanaf de bodem van de doos verhoogd om te voorkomen dat de uiteinden breken. Om een elektrode te vullen met lucifer gele kleurstof oplossing, plaats een elektrode in de verticale positie met de tip naar beneden gericht, en pipette een tot twee microliters van lucifer gele oplossing in de achterkant van de elektrode. Wacht vijf tot tien minuten tot de oplossing via capillaire werking naar de punt is verplaatst voordat u de gevulde elektrode voorzichtig vastzet in een elektrodehouder die is aangesloten op een manipulator met de zilverdraad van de elektrodehouder in contact met de lucifergeel in de elektrode.Voor de kleurstof uitwerptest, plaats voorzichtig een licht vaste hersenen slice in een glazen bodem schotel gevuld met 0,1 molaire PBS op kamertemperatuur en houd het plak op zijn plaats met een platina harp met nylon snaren. Sluit de elektrode aan op een spanningsbron en plaats de grondelektrode in het bad met de hersenschijf. Verplaats het doel van een confocale microscoop naar het hersengebied van belang en verlaag de elektrode in de oplossing met behulp van de 10X wateronderdompelingslens, die de elektrode naar het midden van het gezichtsveld verplaatst.Onder heldere veldverlichting moet u de elektrode zorgvuldig onderzoeken met de 40X wateronderdompelingslens om ervoor te zorgen dat de elektrode helder en zonder vuil of bellen lijkt. Schakel over op confocale laserscannde microscopie met een laser van 488 nanometer. Zet de stimulator op 12 volt om de kleurstof uitwerping te testen.Een grote fluorescerende kleurstofwolk moet zichtbaar zijn rond het puntje van de elektrode. Dan, onder helder-veld langzaam lager de elektrode in de richting van de slice, stoppen net boven het oppervlak. Om een astrocyt van belang te vullen met iontophorese, gebruik maken van de infrarood differentiële interferentie contrast om astrocyten te identificeren met langwerpige ovaalvormige somata ongeveer 10 micrometer in diameter, 40 tot 50 micrometer onder het snijoppervlak.Dit is het stratum radiatum van de hippocampus direct onder de piramidale cellaag. Als we door het weefsel gaan, kunnen we bloedvaten, neuronen, astrocyten en andere celtypen zien. Zodra een astrocyt is geselecteerd, verplaats de cel naar het midden van het gezichtsveld en laat u de elektrodepunt langzaam in het segment zakken en navigeert door het weefsel totdat de elektrode zich op dezelfde vlakte bevindt als het cellichaam.Zodra het cellichaam van de astrocyt duidelijk zichtbaar en geschetst is, langzaam en voorzichtig de elektrode naar voren, waardoor de elektrode wordt verplaatst totdat de punt de soma van de cel doorboort. Beweeg de focus van het doel langzaam op en neer om op te merken of de elektrode zich in de soma bevindt. Zodra de elektrodepunt zich in de cel bevindt, schakelt u de stimulator op 0,5 tot 1 volt in om continu stroom in de cel uit te werpen.Met behulp van de confocale microscoop, bekijk de celfilm, het verhogen van de digitale zoom om de details van de cel te visualiseren en om ervoor te zorgen dat de punt van de elektrode zichtbaar is in de cel als dat nodig is. Wacht ongeveer 15 minuten tot de fijnere takken en processen worden gedefinieerd voordat u de spanning uitschakelt en de elektrodepunt voorzichtig uit de cel haalt. Als u de gevulde cel wilt weergeven, wacht u 15 tot 20 minuten voordat de cel terugkeert naar zijn oorspronkelijke vorm voordat u de instelling op de confocale microscoop aanpast om ervoor te zorgen dat de fijnere takken en processen worden gedefinieerd onder de doelstelling 40X.Stel een Z-stack in met een stapgrootte van 0,3 micrometer, verplaats de doelstelling terwijl de weergave is totdat er geen signaal van de cel is en stel die stap in als de bovenkant. Beweeg dan het doel naar beneden, scherpstellen door de cel totdat er geen signaal en stel die stap als de bodem. Nadat de beeldvorming is voltooid, controleert u de elektrode op kleurstofuitwerping.Als er een grote kleurstofwolk verschijnt, kan de elektrode worden gebruikt voor het volgende segment. Vervang anders de elektrode. Door het genereren van een maximale intensiteitsprojectie kan een gedetailleerd beeld van de structuur van een astrocyt in zijn domein worden waargenomen.Een vier X magnitude zoom in de astrocyte onthult een maximale intensiteit projectie van een grote tak, verschillende secundaire takken, en de verdeling van de omliggende vertakkingen en folders. Hier wordt het originele beeld van een CA1 astrocyt getoond. Het cellichaam, de belangrijkste takken, processen en het gebiedsvolume dat door astrocyt wordt ingesloten worden gereconstrueerd in deze volgende beelden.Nadat de reconstructies werden gemaakt, werden de volumes van de soma, de hele cel en het grondgebied gekwantificeerd. En het aantal grote filialen werd geteld. Als cytoskeletale eiwit dat tussenliggende astrocyten filamenten labels wordt uitgedrukt in de cel soma, grote takken, en sommige secundaire astrocyten takken, maar niet in de fijnere takken en processen.In deze representatieve analyse werden geen significante verschillen gevonden in het aantal primaire takken dat wordt aangeduid met gliafzuurzuur eiwit en die visualiseren door lucifer geel. Verder waren het celgebied en het volume van het astrocyt gelabeld door gliafibrillair zuur eiwit aanzienlijk kleiner dan het gebied en het volume gevisualiseerd met lucifer geel, wat aantoont dat gliamzuurzuur eiwit een betrouwbare marker is voor het labelen van grote takken, maar niet nuttig is voor het bepalen van het totale gebied of volume van de cel. De hoeveelheid kleurstof die vrijkomt uit de elektrodepunt is afhankelijk van de elektrodeweerstand die hoog genoeg moet zijn om een gestage stroom van kleurstof te kunnen uitwerpen.Toekomstige studies kunnen de verschillende componenten van astrocytenstructuur onderzoeken door superresolutie lichtmicroscopie of door immunohistochemische analyse van de expressie van specifieke eiwitten binnen de astrocytenstructuur.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Visualiseren van de effecten van een positieve vroege Experience, Tactiel Stimulatie, op dendritische morfologie en Synaptic Connectiviteit met Golgi-Cox kleuring

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

De indirecte Neuron-astrocyten Coculture Assay: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up voor het gedetailleerd onderzoek van het neuron-glia interacties

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Toezicht Astrocyt reactiviteit en proliferatie in Vitro ischemische-achtige omstandigheden

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Het analyseren van dendrietmorfologie in Kolommen en Lagen

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Bepaling van de expressie van de celoppervlakte en de endocytische snelheid van eiwitten in primaire astrocytekulturen met behulp van biotinylering

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Kwantificeren van Microglia morfologie van Photomicrographs van Immunohistochemistry bereid van weefsel met behulp van ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...