Name: visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00
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Les auteurs remercient Mme Soto, le Dr Yu et le Dr Octeau pour leurs conseils ainsi que leurs commentaires sur le texte. Ce travail est soutenu par NS060677.

Les expériences sur les animaux dans cette étude ont été effectuées conformément au National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et ont été approuvées par le Comité de recherche sur les animaux du chancelier à l'Université de Californie à Los Angeles. Des souris adultes (6 à 8 semaines) de sexe mixte ont été utilisées dans toutes les expériences.
1. Préparation de la solution
<ol><li>
Solution de liquide céphalo-rachidien artificie...

<ol>
	<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits.">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).</li><li>Ben Haim, L., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+astrocytes+in+neural+circuit+regulation.">Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).</li><li>Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+Shapeshifter:+Mechanisms+Allowing+Astrocytes+to+Respond+to+the+Changing+Nervous+System+During+Development,+Injury+and+Disease.">Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Circuit-Specialized+Astrocytes:+Transcriptomic,+Proteomic,+Morphological,+and+Functional+Evidence.">Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Sun, D., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+astrocytes+in+the+injured+CNS.">Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS.</a> Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).</li><li>Naskar, S., Chattarji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Elicits+Contrasting+Effects+on+the+Structure+and+Number+of+Astrocytes+in+the+Amygdala+versus+Hippocampus.">Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus.</a> eNeuro. 6 (1), (2019).</li><li>Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+spatial+arrangement+of+astrocytes+in+the+optic+nerve+head+of+the+mouse.">The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).</li><li>Grosche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+simple+approach+to+determine+astrocyte+territories+in+mouse+neocortex+and+hippocampus.">Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).</li><li>Kaynig, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automatic+reconstruction+of+neuronal+processes+from+electron+microscopy+images.">Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images.</a> Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Wilhelmsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+concept+of+reactive+astrocytes+as+cells+that+remain+within+their+unique+domains+upon+reaction+to+injury.">Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).</li><li>Williams, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-9+regulates+synapse-specific+differentiation+in+the+developing+hippocampus.">Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus.</a> Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Astrocyte+Water+Channel+Aquaporin-4+in+the+Mouse+Brain.">Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain.</a> ASN Neuro. 7 (5), (2015).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).</li><li>Luna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+structural+reactivity+and+plasticity+in+models+of+retinal+detachment.">Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).</li><li>Octeau, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optical+Neuron-Astrocyte+Proximity+Assay+at+Synaptic+Distance+Scales.">An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales.</a> Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).</li><li>Sosunov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+isocortical+and+hippocampal+astrocytes+in+the+human+brain.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).</li><li>Park, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Specificity+and+Coverage+of+hGFAP-CreERT2+[Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc]+Mouse+Line+in+Various+Brain+Regions.">Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions.</a> Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).</li><li>Koeppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Consequences+of+Synapse+Remodeling+Following+Astrocyte-Specific+Regulation+of+Ephrin-B1+in+the+Adult+Hippocampus.">Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).</li><li>Jefferis, G. S., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+and+combinatorial+neuron+labelling.">Sparse and combinatorial neuron labelling.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).</li><li>Lanjakornsiripan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+morphological+and+molecular+differences+in+neocortical+astrocytes+and+their+dependence+on+neuronal+layers.">Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).</li></ol>

La méthode décrite dans cet article décrit une manière de visualiser la morphologie d'astrocyte utilisant l'iontophoresis intracellulaire du colorant de LY dans les tranches légèrement fixes de cerveau. Il y a plusieurs facteurs critiques mis en évidence dans ce protocole qui contribuent à l'iontophoresis réussi de LY et à la reconstruction morphologique des cellules. Un facteur est la qualité et la reproductibilité des images, qui est déterminée en grande partie par l'âge de la souris et le résultat de l...

Les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du système nerveux central (SNC). Ils jouent des rôles dans l'homéostasie ionique, la régulation du flux sanguin, la formation de synapse ainsi que l'élimination, et l'élimination des neurotransmetteurs1. La large gamme de fonctions d'astrocyte se reflète dans leur structure morphologique complexe2,3. Les astrocytes contiennent plusieurs branches primaires et secondaires qui se divisent en milliers de branches et de folioles plus fines qui interagissent directement avec les synapses, les dendrites, les axones, les vaisseaux sanguins et d'autres cellules gliales. La morphologie des astrocytes varie selon les régions du cerveau, ce qui peut indiquer leur capacité à remplir leurs fonctions de façon différentielle dans les circuits neuronaux4. En outre, les astrocytes sont connus pour modifier leur morphologie au cours du développement, pendant les conditions physiologiques, et dans les états de maladie multiples3,5,6.
Une méthode cohérente et reproductible est nécessaire pour résoudre avec précision la complexité de la morphologie des astrocytes. Traditionnellement, l'immunohistochimie a été utilisée pour visualiser les astrocytes avec l'utilisation de marqueurs de protéines enrichis d'astrocytes ou d'astrocytes. Cependant, ces méthodes révèlent le modèle d'expression des protéines plutôt que la structure de l'astrocyte. Les marqueurs couramment utilisés, tels que la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et la protéine de liaison du calcium S100 (S100), ne s'expriment pas dans l'ensemble du volume cellulaire et ne résolvent donc pas la morphologie complète7. Les approches génétiques pour exprimer les protéines fluorescentes de façon omniprésente dans les astrocytes (injections virales ou lignes transgéniques de reporter de souris) peuvent identifier les branches plus fines et le territoire global. Cependant, il est difficile de différencier les astrocytes individuels, et les analyses peuvent être biaisées par la population d'astrocytes ciblée par le promoteur spécifique8. La microscopie électronique de section série a été employée pour indiquer une image détaillée des interactions des processus d'astrocyte avec des synapses. En raison des milliers de processus d'astrocyte s'entrelaçant des synapses, il n'est actuellement pas possible de reconstruire une cellule entière avec cette technique9, bien que cela devrait changer avec l'utilisation d'approches d'apprentissage automatique pour l'analyse des données.
Dans ce rapport, nous nous concentrons sur une procédure pour caractériser les astrocytes de souris utilisant l'iontophoresis intracellulaire avec le colorant jaune de Lucifer (LY), utilisant le radiatum de strate de CA1 comme exemple. La méthode est basée sur des travaux passés pionniers par Eric Bushong et Mark Ellisman10,11. Les astrocytes des tranches de cerveau légèrement fixes sont identifiés par leur forme distinctive de soma et remplis de LY. Les cellules sont ensuite représentées avec une microscopie confocale. Nous démontrons comment l'iontophoresis de LY peut être employé pour reconstruire les astrocytes individuels et effectuer des analyses morphologiques détaillées de leurs processus et territoire. En outre, cette méthode peut être appliquée en conjonction avec l'immunohistochimie pour identifier les relations spatiales et les interactions entre les astrocytes et les neurones, d'autres cellules gliales, et la vascularisation du cerveau. Nous considérons l'iontophoresis de LY comme un outil très approprié pour analyser la morphologie dans différentes régions du cerveau et modèles de souris des conditions saines ou de la maladie7,12,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:995px;" width="994">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">SF 100-20</td>
			<td style="width:240px;">An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:192px;">Pall</td>
			<td style="width:196px;">4692</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ag/AgCl ground pellet</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP2</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti Aquaporin-4 antibody</td>
			<td style="width:192px;">Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-87679</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti GFAP antibody</td>
			<td style="width:192px;">Abcam</td>
			<td style="width:196px;">ab4674</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass pipettes with filament</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6NTac mice</td>
			<td>Taconic Stock</td>
			<td style="width:196px;">B6</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td style="width:192px;">Olympus</td>
			<td style="width:196px;">FV1000MPE</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode puller- Model P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td style="width:196px;">P-97</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:196px;">0100-01</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td>
			<td style="width:192px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>400-10</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris software (Version 7.6.5)</td>
			<td style="width:192px;">Bitplane Inc.</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:192px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)</td>
			<td style="width:192px;">Clipper</td>
			<td>1050035</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:196px;">24X60-1</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">12-544-2</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:192px;">Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (40x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:196px;">LUMPLFLN 40XW</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (60x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanAPO 60X</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS tablets, 100 mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td>VWRVE404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pipette micromanipulator- Model ROE-200</td>
			<td style="width:192px;">Sutter</td>
			<td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulator- Model Omnical 2010</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">Omnical 2010</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">T8787</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome- Model #3000</td>
			<td style="width:192px;">Pelco</td>
			<td style="width:196px;">100-S</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis

Les astrocytes sont des composants essentiels des circuits neuronaux. Ils carirent l'ensemble du système nerveux central (SNC) et sont impliqués dans une variété de fonctions, qui comprennent le dégagement des neurotransmetteurs, la régulation des ions, la modulation synaptique, le soutien métabolique aux neurones, et la régulation du flux sanguin. Les astrocytes sont des cellules complexes qui ont un soma, plusieurs branches principales, et de nombreux processus fins qui contactent divers éléments cellulaires dans le neuropil. Afin d'évaluer la morphologie des astrocytes, il est nécessaire d'avoir une méthode fiable et reproductible pour visualiser leur structure. Nous rapportons un protocole fiable pour exécuter l'iontophoresis intracellulaire des astrocytes utilisant le colorant jaune fluorescent de Lucifer (LY) dans le tissu de cerveau légèrement fixé des souris adultes. Cette méthode a plusieurs caractéristiques qui sont utiles pour caractériser la morphologie des astrocytes. Il permet la reconstruction tridimensionnelle des astrocytes individuels, ce qui est utile pour effectuer des analyses morphologiques sur différents aspects de leur structure. L'immunohistochimie avec l'iontophoresis de LY peut également être employée pour comprendre l'interaction des astrocytes avec différents composants du système nerveux et pour évaluer l'expression des protéines dans les astrocytes étiquetés. Ce protocole peut être mis en œuvre dans une variété de modèles murins de troubles du SNC pour examiner rigoureusement la morphologie des astrocytes avec microscopie légère. LY iontophoresis fournit une approche expérimentale pour évaluer la structure des astrocytes, en particulier dans le contexte de blessures ou de maladies où ces cellules sont proposées pour subir des changements morphologiques importants.

Les données rapportées dans cette étude proviennent de cellules de 7 à 12 cellules de 4 souris dans chaque expérience. Les données moyennes sont communiquées dans les panneaux de chiffres, le cas échéant.
Pour évaluer la morphologie des astrocytes, nous avons effectué une iontophoresis intracellulaire à l'aide de colorant LY pour remplir les astrocytes dans le radiatum de la strate CA1, qui est résumé à la figure 1. La figure 2 repr...

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Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Les astrocytes sont des cellules morphologiquement complexes, illustrées par leurs multiples processus et territoires touffus. Pour analyser leur morphologie élaborée, nous présentons un protocole fiable pour exécuter l'iontophoresis jaune intracellulaire de Lucifer dans le tissu légèrement fixé.

Visualiser la morphologie de l'astrocyte à l'aide de lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Cette méthode peut être utilisée pour faciliter la visualisation de processus d’astrocytes très fins pour l’évaluation des interactions neuronales des astrocytes à la synapse pendant la maladie et les états stables. Cette technique peut également être appliquée dans n’importe quel modèle de souris, population cellulaire, ou région du cerveau. Pour préparer une électrode tranchante avec une résistance appropriée, tirez une électrode en verre borosilicate à canon unique avec un filament sur un pull de micropipette.Rangez les électrodes tirées dans un récipient fermé pour empêcher la poussière d’entrer dans les extrémités et gardez les électrodes élevées du fond de la boîte pour empêcher les pointes de se briser. Pour remplir une électrode de solution de colorant jaune lucifer, placez une électrode en position verticale avec la pointe orientée vers le bas, et pipette un à deux microlitres de solution jaune lucifer à l’arrière de l’électrode. Attendez cinq à dix minutes pour que la solution se déplace vers la pointe par action capillaire avant de fixer doucement l’électrode remplie dans un support d’électrode relié à un manipulateur avec le fil d’argent du support d’électrode en contact avec le jaune lucifer à l’intérieur de l’électrode.Pour l’essai d’éjection de colorant, placez doucement une tranche légèrement fixe de cerveau dans un plat inférieur en verre rempli de PBS molaire de 0,1 à température ambiante et maintenez la tranche en place avec une harpe platine avec des cordes de nylon. Connectez l’électrode à une source de tension et placez l’électrode au sol dans le bain contenant la tranche du cerveau. Déplacez l’objectif d’un microscope confocal vers la région du cerveau d’intérêt et abaissez l’électrode dans la solution à l’aide de la lentille d’immersion d’eau 10X, déplaçant l’électrode au centre du champ de vision.Sous l’éclairage du champ lumineux, examinez attentivement l’électrode à l’aide de la lentille d’immersion d’eau 40X pour vous assurer que l’électrode semble claire et sans débris ni bulles. Passez à la microscopie à balayage laser confoccal avec un laser de 488 nanomètres. Allumez le stimulateur à 12 volts pour tester l’éjection de colorant.Un gros nuage de colorant fluorescent doit être visible autour de la pointe de l’électrode. Puis, sous le champ lumineux lentement abaisser l’électrode vers la tranche, s’arrêtant juste au-dessus de la surface. Pour remplir un astrocyte d’intérêt avec l’iontophoresis, utilisez le contraste infrarouge d’interférence différentielle pour identifier les astrocytes avec somata ovale allongé d’environ 10 micromètres de diamètre, 40 à 50 micromètres sous la surface de la tranche.C’est le radiatum stratique de l’hippocampe directement en dessous de la couche cellulaire pyramidale. Comme nous nous déplaçons à travers les tissus, nous pouvons voir les vaisseaux sanguins, les neurones, les astrocytes, et d’autres types de cellules. Une fois qu’un astrocyte a été sélectionné, déplacez la cellule au centre du champ de vision et abaissez lentement la pointe de l’électrode dans la tranche, naviguant à travers le tissu jusqu’à ce que l’électrode soit sur la même plaine que le corps cellulaire.Une fois que le corps cellulaire de l’astrocyte est clairement visible et décrit, avancez lentement et doucement l’électrode vers l’avant, déplaçant l’électrode jusqu’à ce que la pointe empale le soma de la cellule. Déplacez l’objectif lentement de haut en bas pour noter si l’électrode est à l’intérieur du soma. Une fois que la pointe de l’électrode est à l’intérieur de la cellule, allumez le stimulateur à 0,5 à un volts pour éjecter continuellement le courant dans la cellule.À l’aide du microscope confocal, regardez le film cellulaire, augmentant le zoom numérique pour visualiser les détails de la cellule et pour vous assurer que la pointe de l’électrode est visible à l’intérieur de la cellule si nécessaire. Attendez environ 15 minutes jusqu’à ce que les branches et les processus plus fins apparaissent définis avant d’éteindre la tension et de retirer doucement la pointe de l’électrode de la cellule. Pour imager la cellule remplie, attendez de 15 à 20 minutes que la cellule revienne à sa forme originale avant d’ajuster le réglage du microscope confocal pour s’assurer que les branches et les processus plus fins semblent définis sous l’objectif 40X.Configurez une pile Z avec une taille d’étape de 0,3 micromètre, déplaçant l’objectif pendant l’imagerie jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de signal de la cellule et définissez cette étape comme le haut. Déplacez ensuite l’objectif vers le bas, en se concentrant à travers la cellule jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de signal et définissez cette étape comme le fond. Une fois l’imagerie terminée, vérifiez l’électrode pour l’éjection de teinture.Si un gros nuage de colorant apparaît, l’électrode peut être utilisée pour la tranche suivante. Sinon, remplacez l’électrode. En générant une projection d’intensité maximale, une vue détaillée de la structure d’un astrocyte dans son domaine peut être observée.Un zoom de magnitude quatre X sur l’astrocyte révèle une projection d’intensité maximale d’une branche majeure, plusieurs branches secondaires, et la distribution des branchettes et des folioles environnantes. Ici, l’image originale d’un astrocyte CA1 est affichée. Le corps cellulaire, les branches principales, les processus et le volume du territoire inclus par l’astrocyte sont reconstruits dans ces images ultérieures.Après la création des reconstructions, les volumes du soma, de la cellule entière et du territoire ont été quantifiés. Et le nombre de succursales principales a été compté. Comme protéine cytosquelettique qui étiquette les filaments intermédiaires d’astrocyte est exprimée dans le soma cellulaire, les branches principales, et quelques branches secondaires d’astrocyte, mais pas dans les branches et les processus plus fins.Dans cette analyse représentative, aucune différence significative n’a été trouvée dans le nombre de branches primaires étiquetées par protéine acide fibrillaire gliale et celles visualisent par le jaune lucifer. En outre, la zone cellulaire et le volume de l’astrocyte étiquetés par protéine acide fibrillaire gliale étaient significativement plus petits que la zone et le volume visualisés avec le jaune lucifer, démontrant que la protéine acide fibrillaire gliale est un marqueur fiable pour l’étiquetage des branches principales, mais n’est pas utile pour déterminer la zone globale ou le volume de la cellule. La quantité de colorant libérée par la pointe de l’électrode dépend de la résistance aux électrodes qui doit être suffisamment élevée pour permettre l’éjecter d’un flux régulier de colorant.Les études futures peuvent examiner les différents composants de la structure des astrocytes par microscopie légère à super résolution ou par analyse immunohistochimique de l’expression de protéines spécifiques dans la structure des astrocytes.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Recherche

Neurosciences

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