Name: visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00
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Die Autoren danken Frau Soto, Dr. Yu und Dr. Octeau für die Anleitung sowie Kommentare zum Text. Diese Arbeit wird von NS060677 unterstützt.

Die Tierversuche in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und vom Animal Research Committee der Kanzlerin an der University of California, Los Angeles, genehmigt. Erwachsene Mäuse (6-8 Wochen alt) mit gemischtem Geschlecht wurden in allen Experimenten verwendet.
1. Lösungsvorbereitung
<ol><li>
Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) Lösung
	<ol>
<li>Bereiten Sie fri...

<ol>
	<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits.">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).</li><li>Ben Haim, L., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+astrocytes+in+neural+circuit+regulation.">Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).</li><li>Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+Shapeshifter:+Mechanisms+Allowing+Astrocytes+to+Respond+to+the+Changing+Nervous+System+During+Development,+Injury+and+Disease.">Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Circuit-Specialized+Astrocytes:+Transcriptomic,+Proteomic,+Morphological,+and+Functional+Evidence.">Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Sun, D., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+astrocytes+in+the+injured+CNS.">Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS.</a> Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).</li><li>Naskar, S., Chattarji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Elicits+Contrasting+Effects+on+the+Structure+and+Number+of+Astrocytes+in+the+Amygdala+versus+Hippocampus.">Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus.</a> eNeuro. 6 (1), (2019).</li><li>Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+spatial+arrangement+of+astrocytes+in+the+optic+nerve+head+of+the+mouse.">The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).</li><li>Grosche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+simple+approach+to+determine+astrocyte+territories+in+mouse+neocortex+and+hippocampus.">Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).</li><li>Kaynig, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automatic+reconstruction+of+neuronal+processes+from+electron+microscopy+images.">Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images.</a> Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Wilhelmsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+concept+of+reactive+astrocytes+as+cells+that+remain+within+their+unique+domains+upon+reaction+to+injury.">Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).</li><li>Williams, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-9+regulates+synapse-specific+differentiation+in+the+developing+hippocampus.">Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus.</a> Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Astrocyte+Water+Channel+Aquaporin-4+in+the+Mouse+Brain.">Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain.</a> ASN Neuro. 7 (5), (2015).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).</li><li>Luna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+structural+reactivity+and+plasticity+in+models+of+retinal+detachment.">Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).</li><li>Octeau, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optical+Neuron-Astrocyte+Proximity+Assay+at+Synaptic+Distance+Scales.">An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales.</a> Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).</li><li>Sosunov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+isocortical+and+hippocampal+astrocytes+in+the+human+brain.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).</li><li>Park, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Specificity+and+Coverage+of+hGFAP-CreERT2+[Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc]+Mouse+Line+in+Various+Brain+Regions.">Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions.</a> Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).</li><li>Koeppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Consequences+of+Synapse+Remodeling+Following+Astrocyte-Specific+Regulation+of+Ephrin-B1+in+the+Adult+Hippocampus.">Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).</li><li>Jefferis, G. S., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+and+combinatorial+neuron+labelling.">Sparse and combinatorial neuron labelling.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).</li><li>Lanjakornsiripan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+morphological+and+molecular+differences+in+neocortical+astrocytes+and+their+dependence+on+neuronal+layers.">Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).</li></ol>

Die in diesem Artikel beschriebene Methode beschreibt eine Möglichkeit, die Astrozytenmorphologie mit intrazellulärer Iontophorese von LY-Farbstoff in leicht fixierten Gehirnscheiben zu visualisieren. Es gibt mehrere kritische Faktoren, die in diesem Protokoll hervorgehoben werden, die zu einer erfolgreichen LY-Iontophorese und morphologischen Rekonstruktion der Zellen beitragen. Ein Faktor ist die Qualität und Reproduzierbarkeit der Bilder, die weitgehend durch das Alter der Maus und das Ergebnis der Perfusion bestim...

Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen im Zentralnervensystem (ZNS). Sie spielen Rollen in Ionenhomöostase, Blutflussregulation, Synapse-Bildung sowie Elimination, und Neurotransmitter Aufnahme1. Das breite Spektrum der Astrozytenfunktionen spiegelt sich in ihrer komplexen morphologischen Struktur2,3wider. Astrozyten enthalten mehrere primäre und sekundäre Zweige, die sich in Tausende von feineren Zweigen und Flugblättern teilen, die direkt mit Synapsen, Dendriten, Axonen, Blutgefäßen und anderen Gliazellen interagieren. Astrozytenmorphologie variiert zwischen verschiedenen Hirnregionen, was auf ihre Fähigkeit hindeuten kann, ihre Funktionen differenziell in neuronalen Schaltkreisen auszuführen4. Darüber hinaus sind Astrozyten dafür bekannt, ihre Morphologie während der Entwicklung, während physiologischer Bedingungen und in mehreren Krankheitszuständen3,5,6zu verändern.
Eine konsistente, reproduzierbare Methode ist erforderlich, um die Komplexität der Astrozytenmorphologie genau aufzulösen. Traditionell wurde die Immunhistochemie verwendet, um Astrozyten mit der Verwendung von astrozytenspezifischen oder astrozytenangereicherten Proteinmarkern zu visualisieren. Diese Methoden zeigen jedoch eher das Muster der Proteinexpression als die Struktur der Astrozyten. Die häufig verwendeten Marker, wie z.B. glialfibrilläres saures Protein (GFAP) und S100 Calciumbindungsprotein (S100), drücken nicht im gesamten Zellvolumen aus und lösen somit keine vollständige Morphologie7. Genetische Ansätze zur Expressfluoreszenzproteine in Astrozyten (virale Injektionen oder transgene Mausreporterlinien) können die feineren Zweige und das gesamte Territorium identifizieren. Es ist jedoch schwierig, einzelne Astrozyten zu unterscheiden, und Analysen können durch die Astrozytenpopulation verzerrt werden, die vom spezifischen Promotor angestrebt wird8. Serial section electron microscopy wurde verwendet, um ein detailliertes Bild der Wechselwirkungen von Astrozytenprozessen mit Synapsen zu enthüllen. Aufgrund der Tausenden von Astrozytenprozessen, die synapses kontaktieren, ist es derzeit nicht möglich, eine ganze Zelle mit dieser Technik9zu rekonstruieren, obwohl dies sich mit dem Einsatz von Machine Learning-Ansätzen für die Datenanalyse ändern dürfte.
In diesem Bericht konzentrieren wir uns auf ein Verfahren zur Charakterisierung von Mausastrozyten mit intrazellulärer Iontophorese mit Luzifergelb (LY) Farbstoff, am Beispiel des CA1-Stratum-Radiatums. Die Methode basiert auf bahnbrechenden Arbeiten von Eric Bushong und Mark Ellisman10,11. Astrozyten aus leicht fixierten Hirnscheiben werden durch ihre unverwechselbare Soma-Form identifiziert und mit LY gefüllt. Die Zellen werden dann mit konfokaler Mikroskopie abgebildet. Wir zeigen, wie LY-Iontophorese verwendet werden kann, um einzelne Astrozyten zu rekonstruieren und detaillierte morphologische Analysen ihrer Prozesse und gebiete durchzuführen. Auch kann diese Methode in Verbindung mit der Immunhistochemie angewendet werden, um räumliche Beziehungen und Wechselwirkungen zwischen Astrozyten und Neuronen, anderen Gliazellen und Gehirnvaskulatur zu identifizieren. Wir betrachten LY Iontophorese als ein sehr geeignetes Werkzeug, um Morphologie in verschiedenen Hirnregionen und Mausmodelle von gesunden oder Krankheitszuständen7,12,13zu analysieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:995px;" width="994">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">SF 100-20</td>
			<td style="width:240px;">An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:192px;">Pall</td>
			<td style="width:196px;">4692</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ag/AgCl ground pellet</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP2</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti Aquaporin-4 antibody</td>
			<td style="width:192px;">Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-87679</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti GFAP antibody</td>
			<td style="width:192px;">Abcam</td>
			<td style="width:196px;">ab4674</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass pipettes with filament</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6NTac mice</td>
			<td>Taconic Stock</td>
			<td style="width:196px;">B6</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td style="width:192px;">Olympus</td>
			<td style="width:196px;">FV1000MPE</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode puller- Model P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td style="width:196px;">P-97</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:196px;">0100-01</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td>
			<td style="width:192px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>400-10</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris software (Version 7.6.5)</td>
			<td style="width:192px;">Bitplane Inc.</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:192px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)</td>
			<td style="width:192px;">Clipper</td>
			<td>1050035</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:196px;">24X60-1</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">12-544-2</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:192px;">Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (40x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:196px;">LUMPLFLN 40XW</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (60x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanAPO 60X</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS tablets, 100 mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td>VWRVE404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pipette micromanipulator- Model ROE-200</td>
			<td style="width:192px;">Sutter</td>
			<td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulator- Model Omnical 2010</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">Omnical 2010</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">T8787</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome- Model #3000</td>
			<td style="width:192px;">Pelco</td>
			<td style="width:196px;">100-S</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis

Astrozyten sind wesentliche Bestandteile neuronaler Schaltkreise. Sie kacheln das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS) und sind an einer Vielzahl von Funktionen beteiligt, die Neurotransmitter Clearance, Ionenregulierung, synaptische Modulation, metabolische Unterstützung für Neuronen, und Blutflussregulierung gehören. Astrozyten sind komplexe Zellen, die ein Soma, mehrere Hauptzweige und zahlreiche feine Prozesse haben, die verschiedene zelluläre Elemente innerhalb des Neuropils kontaktieren. Um die Morphologie von Astrozyten zu beurteilen, ist es notwendig, eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zu haben, um ihre Struktur zu visualisieren. Wir berichten über ein zuverlässiges Protokoll zur intrazellulären Iontophorese von Astrozyten mit fluoreszierendem Luzifergelb (LY) Farbstoff in leicht fixiertem Hirngewebe von erwachsenen Mäusen. Diese Methode hat mehrere Funktionen, die nützlich sind, um Astrozytenmorphologie zu charakterisieren. Es ermöglicht eine dreidimensionale Rekonstruktion einzelner Astrozyten, die nützlich ist, um morphologische Analysen zu verschiedenen Aspekten ihrer Struktur durchzuführen. Die Immunhistochemie kann zusammen mit der LY-Iontophorese auch genutzt werden, um die Wechselwirkung von Astrozyten mit verschiedenen Komponenten des Nervensystems zu verstehen und die Expression von Proteinen innerhalb der markierten Astrozyten zu bewerten. Dieses Protokoll kann in einer Vielzahl von Mausmodellen von ZNS-Störungen implementiert werden, um die Astrozytenmorphologie mit Lichtmikroskopie streng zu untersuchen. Die LY-Iontophorese bietet einen experimentellen Ansatz zur Bewertung der Astrozytenstruktur, insbesondere im Zusammenhang mit Verletzungen oder Krankheiten, bei denen diese Zellen signifikante morphologische Veränderungen erfahren sollen.

Die in dieser Studie berichteten Daten stammen aus 7 bis 12 Zellen von 4 Mäusen in jedem Experiment. Die durchschnittlichen Daten werden gegebenenfalls in den Abbildungspanels gemeldet.
Um die Astrozytenmorphologie zu bewerten, führten wir eine intrazelluläre Iontophorese mit LY-Farbstoff durch, um Astrozyten im CA1-Stratum-Radiatum zu füllen, die in Abbildung 1zusammengefasst ist. Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Astrozyten und ihre aus...

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Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrozyten sind morphologisch komplexe Zellen, die durch ihre vielfältigen Prozesse und buschigen Territorien veranschaulicht werden. Um ihre aufwendige Morphologie zu analysieren, präsentieren wir ein zuverlässiges Protokoll, um intrazelluläre Luzifer gelbe Iontophorese in leicht fixiertem Gewebe durchzuführen.

Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Luzifer gelben Iontophorese

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Diese Methode kann verwendet werden, um die Visualisierung sehr feiner Astrozytenprozesse zur Bewertung von astrozytenneuronalen Wechselwirkungen an der Synapse während krankheits- und stationärer Zustände zu erleichtern. Diese Technik kann auch in jedem Mausmodell, jeder Zellpopulation oder einer Hirnregion angewendet werden. Um eine scharfe Elektrode mit entsprechendem Widerstand vorzubereiten, ziehen Sie eine Borosilikatglas-Einfasselektrode mit einem Filament auf einem Mikropipette-Puller.Bewahren Sie die gezogenen Elektroden in einem geschlossenen Behälter auf, um zu verhindern, dass Staub in die Spitzen gelangt, und halten Sie die Elektroden von der Unterseite der Box erhöht, um zu verhindern, dass die Spitzen brechen. Um eine Elektrode mit luzifergelber Farbstofflösung zu füllen, legen Sie eine Elektrode in die vertikale Position mit der Spitze nach unten und Pipette ein bis zwei Mikroliter luzifergelbe Lösung in die Rückseite der Elektrode. Warten Sie fünf bis zehn Minuten, bis sich die Lösung über Kapillarwirkung zur Spitze bewegt, bevor Sie die gefüllte Elektrode in einem Elektrodenhalter, der mit einem Manipulator verbunden ist, vorsichtig mit dem Silberdraht des Elektrodenhalters in Kontakt mit dem Luzifergelb in der Elektrode sichern.Für den Farbstoffauswurftest eine leicht fixierte Hirnscheibe vorsichtig in eine mit 0,1 Molaren PBS gefüllte Glasbodenschale bei Raumtemperatur legen und die Scheibe mit einer Platinharfe mit Nylonsaiten an Ort und Stelle halten. Schließen Sie die Elektrode an eine Spannungsquelle an und legen Sie die Bodenelektrode in das Bad, das die Gehirnscheibe enthält. Bewegen Sie das Ziel eines konfokalen Mikroskops in die von Interesse eingunende Hirnregion und senken Sie die Elektrode mithilfe der 10-fachen Wasser-Tauchlinse in die Lösung, indem Sie die Elektrode in die Mitte des Sichtfeldes verschieben.Untersuchen Sie die Elektrode unter Hellfeldbeleuchtung sorgfältig mit der 40X Wassertauchlinse, um sicherzustellen, dass die Elektrode klar und ohne Schmutz oder Blasen erscheint. Wechseln Sie mit einem 488-Nanometer-Laser zur konfokalen Laserscanmikroskopie. Schalten Sie den Stimulator bei 12 Volt ein, um den Farbstoffauswurf zu testen.Um die Spitze der Elektrode sollte eine große fluoreszierende Farbwolke sichtbar sein. Dann, unter hellem Feld langsam senken Sie die Elektrode in Richtung der Scheibe, anhalten danieren direkt über der Oberfläche. Um eine von Interesse sindde Astrozytenmiton mit Iontophorese zu füllen, verwenden Sie den Infrarot-Differentialinterferenzkontrast, um Astrozyten mit langgestreckter ovaler Somata mit einem Durchmesser von etwa 10 Mikrometern, 40 bis 50 Mikrometer unter der Scheibenoberfläche zu identifizieren.Dies ist die Stratum-Radiatum des Hippocampus direkt unter der pyramidenförmigen Zellschicht. Während wir uns durch das Gewebe bewegen, können wir Blutgefäße, Neuronen, Astrozyten und andere Zelltypen sehen. Sobald ein Astrozyten ausgewählt wurde, bewegen Sie die Zelle in die Mitte des Sichtfeldes und senken Sie langsam die Elektrodenspitze in die Scheibe, indem Sie durch das Gewebe navigieren, bis sich die Elektrode auf der gleichen Ebene wie der Zellkörper befindet.Sobald der Zellkörper der Astrozyten deutlich sichtbar und umrissen ist, bringen Sie die Elektrode langsam und sanft vorwärts und bewegt die Elektrode, bis die Spitze das Soma der Zelle aufspießt. Bewegen Sie den Fokus des Objektivs langsam nach oben und unten, um zu beachten, ob sich die Elektrode im Inneren des Soma befindet. Sobald sich die Elektrodenspitze innerhalb der Zelle befindet, schalten Sie den Stimulator bei 0,5 bis 1 Volt ein, um kontinuierlich Strom in die Zelle auszustoßen.Beobachten Sie mit dem konfokalen Mikroskop den Zellfilm, erhöhen Sie den digitalen Zoom, um die Details der Zelle zu visualisieren und sicherzustellen, dass die Spitze der Elektrode bei Bedarf in der Zelle sichtbar ist. Warten Sie etwa 15 Minuten, bis die feineren Zweige und Prozesse definiert erscheinen, bevor Sie die Spannung ausschalten und die Elektrodenspitze vorsichtig aus der Zelle zurückziehen. Um die gefüllte Zelle abzubilden, warten Sie 15 bis 20 Minuten, bis die Zelle zu ihrer ursprünglichen Form zurückkehrt, bevor Sie die Einstellung am konfokalen Mikroskop anpassen, um sicherzustellen, dass die feineren Zweige und Prozesse unter dem 40X-Objektiv definiert erscheinen.Richten Sie einen Z-Stack mit einer Schrittgröße von 0,3 Mikrometern ein, bewegen Sie das Objektiv während der Bildgebung, bis kein Signal von der Zelle vorhanden ist, und legen Sie diesen Schritt als Oberseite fest. Bewegen Sie dann das Ziel nach unten, fokussieren Sie sich durch die Zelle, bis kein Signal vorhanden ist, und setzen Sie diesen Schritt als Boden. Überprüfen Sie nach Abschluss der Bildgebung die Elektrode auf Farbstoffauswurf.Wenn eine große Färbewolke erscheint, kann die Elektrode für die nächste Scheibe verwendet werden. Andernfalls ersetzen Sie die Elektrode. Durch die Erzeugung einer maximalen Intensitätsprojektion kann eine detaillierte Ansicht der Struktur einer Astrozyten in ihrer Domäne beobachtet werden.Ein Vier-X-Magnituden-Zoom in die Astrozyten zeigt eine maximale Intensitätsprojektion eines Hauptzweigs, mehrerer Sekundärzweige und die Verteilung der umgebenden Verzweigungen und Flugblätter. Hier wird das Originalbild einer CA1-Astrozyten gezeigt. Der Zellkörper, die Hauptzweige, Prozesse und das von der Astrozyten eingeschlossene Gebietsvolumen werden in diesen nachfolgenden Bildern rekonstruiert.Nach der Erstellung der Rekonstruktionen wurden die Volumina des Soma, der gesamten Zelle und des Territoriums quantifiziert. Und die Zahl der großen Zweige wurde gezählt. Als zytoskelettales Protein, das zwischengeschaltete Astrozytenfilamente kennzeichnet, wird in dem Zellsoma, hauptzweigen und einigen sekundären Astrozytenzweigen exprimiert, aber nicht in den feineren Zweigen und Prozessen.In dieser repräsentativen Analyse wurden keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der Primärzweige gefunden, die durch glialfibrilläres saures Protein gekennzeichnet sind, und solche, die durch luziferes Gelb visualisiert werden. Darüber hinaus waren die Zellfläche und das Volumen des Astrozyten, das durch glialfibrilläres saures Protein gekennzeichnet ist, deutlich kleiner als die mit Luzifergelb visualisierte Fläche und das Volumen, was zeigt, dass glialfibrilläres saures Protein ein zuverlässiger Marker für die Kennzeichnung wichtiger Zweige ist, aber nicht nützlich ist, um die Gesamtfläche oder das Volumen der Zelle zu bestimmen. Die Menge des von der Elektrodenspitze freigesetzten Farbstoffs hängt von der Elektrodenbeständigkeit ab, die hoch genug sein muss, um einen stetigen Farbstrom ausstoßen zu können.Zukünftige Studien können die verschiedenen Komponenten der Astrozytenstruktur durch Superauflösung Selightmikroskopie oder durch immunhistochemische Analyse der Expression spezifischer Proteine innerhalb der Astrozytenstruktur untersuchen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Forschung

Neurowissenschaften

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Überwachung der Astrozyten Reaktivität und Proliferation in Vitro unter ischämischen-ähnlichen Bedingungen

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung der Volumenfraktion und Tortuosität des Gehirns extrazellulären Raumes

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

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Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Quantifizierung der Mikroglia Morphologie von Mikrofotos von Immunohistochemistry vorbereitet Gewebe mit ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...