Name: visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00
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著者は、ソト氏、ユウ博士、オクトー博士に対する指導とテキストに対するコメントに感謝しています。この作業は NS060677 によってサポートされています。

本研究の動物実験は、実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所に従って行われ、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の首相動物研究委員会によって承認されました。全ての実験で混合性の成体マウス(6−8週齢)を用いた。
1. ソリューションの準備
<ol><li>
人工脳脊髄液(ACSF)溶液
	<ol>
<li>各実験の前に新鮮なACSF溶液(135 mM NaCl、5 mM KCl、1mM MgCl 2、14.7 mM NaHCO<...

<ol>
	<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits.">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).</li><li>Ben Haim, L., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+astrocytes+in+neural+circuit+regulation.">Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).</li><li>Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+Shapeshifter:+Mechanisms+Allowing+Astrocytes+to+Respond+to+the+Changing+Nervous+System+During+Development,+Injury+and+Disease.">Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Circuit-Specialized+Astrocytes:+Transcriptomic,+Proteomic,+Morphological,+and+Functional+Evidence.">Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Sun, D., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+astrocytes+in+the+injured+CNS.">Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS.</a> Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).</li><li>Naskar, S., Chattarji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Elicits+Contrasting+Effects+on+the+Structure+and+Number+of+Astrocytes+in+the+Amygdala+versus+Hippocampus.">Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus.</a> eNeuro. 6 (1), (2019).</li><li>Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+spatial+arrangement+of+astrocytes+in+the+optic+nerve+head+of+the+mouse.">The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).</li><li>Grosche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+simple+approach+to+determine+astrocyte+territories+in+mouse+neocortex+and+hippocampus.">Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).</li><li>Kaynig, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automatic+reconstruction+of+neuronal+processes+from+electron+microscopy+images.">Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images.</a> Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Wilhelmsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+concept+of+reactive+astrocytes+as+cells+that+remain+within+their+unique+domains+upon+reaction+to+injury.">Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).</li><li>Williams, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-9+regulates+synapse-specific+differentiation+in+the+developing+hippocampus.">Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus.</a> Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Astrocyte+Water+Channel+Aquaporin-4+in+the+Mouse+Brain.">Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain.</a> ASN Neuro. 7 (5), (2015).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).</li><li>Luna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+structural+reactivity+and+plasticity+in+models+of+retinal+detachment.">Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).</li><li>Octeau, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optical+Neuron-Astrocyte+Proximity+Assay+at+Synaptic+Distance+Scales.">An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales.</a> Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).</li><li>Sosunov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+isocortical+and+hippocampal+astrocytes+in+the+human+brain.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).</li><li>Park, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Specificity+and+Coverage+of+hGFAP-CreERT2+[Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc]+Mouse+Line+in+Various+Brain+Regions.">Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions.</a> Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).</li><li>Koeppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Consequences+of+Synapse+Remodeling+Following+Astrocyte-Specific+Regulation+of+Ephrin-B1+in+the+Adult+Hippocampus.">Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).</li><li>Jefferis, G. S., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+and+combinatorial+neuron+labelling.">Sparse and combinatorial neuron labelling.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).</li><li>Lanjakornsiripan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+morphological+and+molecular+differences+in+neocortical+astrocytes+and+their+dependence+on+neuronal+layers.">Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).</li></ol>

本論文で概説する方法は、LY色素の細胞内イオン球形成を軽く固定された脳スライスで用いてアストロサイト形態を可視化する方法について述べた。このプロトコルで強調されているいくつかの重要な要因は、細胞のLYイオントフォレシスおよび形態的再構成の成功に寄与する。1つの要因は、主にマウスの年齢と灌流の結果によって決定される画像の品質と再現性です。本研究では、生後6~8?...

アストロサイトは、中枢神経系(CNS)で最も豊富なグリア細胞です。彼らはイオン恒常性、血流調節、シナプス形成だけでなく、排除、および神経伝達物質の取り込み1で役割を果たしています。アストロサイト機能の広い範囲は、その複雑な形態構造2、3に反映されます。アストロサイトには、シナプス、デンドライト、軸、血管、および他のグリア細胞と直接相互作用する何千もの細かい枝とリーフレットに分かれたいくつかの一次および二次枝が含まれています。アストロサイトの形態は、異なる脳領域によって異なり、神経回路4でその機能を差別的に実行する能力を示唆する可能性がある。さらに、アストロサイトは、発達中、生理的状態の間、および複数の疾患状態3、5、6において形態を変化させる知られている。
アストロサイト形態の複雑さを正確に解決するには、一貫性のある再現性の高い方法が必要です。伝統的に、免疫組織化学は、アストロサイト特異的またはアストロサイト濃縮タンパク質マーカーを使用して星細胞を視覚化するために使用されてきました。しかし、これらの方法は、アストロサイトの構造ではなくタンパク質発現のパターンを明らかにする。グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)およびS100カルシウム結合タンパク質β(S100β)のような一般的に使用されるマーカーは、細胞体積全体で発現しないため、完全な形態7を解決しない。アストロサイト(ウイルス注射またはトランスジェニックマウスレポーターライン)で蛍光タンパク質をユビキタスに発現する遺伝的アプローチは、より細かい枝および全体的な領域を同定することができる。しかしながら、個々の星状細胞を区別することは困難であり、分析は特定のプロモーター8によって標的となる星状細胞集団によって偏りが生じよい。シリアルセクション電子顕微鏡は、シナプスとの星状細胞プロセスの相互作用の詳細な画像を明らかにするために使用されています。シナプスに接触する何千ものアストロサイトプロセスのため、現在、この技術9で細胞全体を再構築することは不可能ですが、これはデータ分析のための機械学習アプローチの使用によって変化することが期待されます。
本報告では、CA1層ラジエータムを例にルシファー黄色(LY)色素を用いて細胞内イオントフォレシスを用いてマウスアストロサイトを特徴付ける手順に焦点を当てる。この方法は、エリック・ブソンとマーク・エリスマン10、11による先駆的な過去の作品に基づいています。軽く固定された脳のスライスからのアストロサイトは、その独特のソマ形状によって識別され、LYで満たされます。細胞は、その後、共焦点顕微鏡で画像化されます。LYイオントフォレシスを用いて個々の星状細胞を再構築し、そのプロセスと領域の詳細な形態学的解析を行う方法を示す。また、この方法は、免疫組織化学と組み合わせて、アストロサイトとニューロン、他のグリア細胞、脳血管系との空間的関係と相互作用を同定するために適用することができる。LYイオントフォレシスは、健康または疾患状態7、12、13の異なる脳領域およびマウスモデルの形態を分析するのに非常に適したツールであると考える。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:995px;" width="994">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">SF 100-20</td>
			<td style="width:240px;">An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:192px;">Pall</td>
			<td style="width:196px;">4692</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ag/AgCl ground pellet</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP2</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti Aquaporin-4 antibody</td>
			<td style="width:192px;">Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-87679</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti GFAP antibody</td>
			<td style="width:192px;">Abcam</td>
			<td style="width:196px;">ab4674</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass pipettes with filament</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6NTac mice</td>
			<td>Taconic Stock</td>
			<td style="width:196px;">B6</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td style="width:192px;">Olympus</td>
			<td style="width:196px;">FV1000MPE</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode puller- Model P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td style="width:196px;">P-97</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:196px;">0100-01</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td>
			<td style="width:192px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>400-10</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris software (Version 7.6.5)</td>
			<td style="width:192px;">Bitplane Inc.</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:192px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)</td>
			<td style="width:192px;">Clipper</td>
			<td>1050035</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:196px;">24X60-1</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">12-544-2</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:192px;">Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (40x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:196px;">LUMPLFLN 40XW</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (60x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanAPO 60X</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS tablets, 100 mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td>VWRVE404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pipette micromanipulator- Model ROE-200</td>
			<td style="width:192px;">Sutter</td>
			<td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulator- Model Omnical 2010</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">Omnical 2010</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">T8787</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome- Model #3000</td>
			<td style="width:192px;">Pelco</td>
			<td style="width:196px;">100-S</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis

アストロサイトは神経回路の必須成分です。彼らは中枢神経系全体(CNS)をタイル化し、神経伝達物質のクリアランス、イオン調節、シナプス変調、ニューロンへの代謝サポート、血流調節を含む様々な機能に関与しています。アストロサイトは、大豆、いくつかの主要な枝、および神経ピル内の多様な細胞要素に接触する多数の微細なプロセスを有する複雑な細胞です。アストロサイトの形態を評価するためには、その構造を可視化する信頼性と再現性の高い方法が必要です。成体マウスの軽く固定された脳組織に蛍光ルシファーイエロー(LY)色素を用いてアストロサイトの細胞内イオントフォレシスを行う信頼性の高いプロトコルを報告する。この方法には、アストロサイト形態を特徴付けるために有用ないくつかの特徴があります。これは、個々の星状細胞の三次元再構成を可能にし、その構造の異なる側面で形態学的分析を行うために有用である。また、LYイオントフォアシスと共に免疫組織化学を利用して、神経系の異なる構成要素とのアストロサイトの相互作用を理解し、標識された星状細胞内のタンパク質の発現を評価することができます。このプロトコルは、光顕微鏡でアストロサイト形態を厳密に調べるために、CNS障害の様々なマウスモデルで実装することができる。LYイオントフォレシスは、特にこれらの細胞が有意な形態変化を受けることが提案されている傷害または疾患の文脈において、星状細胞構造を評価するための実験的アプローチを提供する。

本研究で報告されたデータは、各実験における4匹のマウスから7~12個の細胞から採取された。平均データは、必要に応じて図パネルに報告されます。
アストロサイト形態を評価するために、図1に要約されたCA1層ラジエータムのアストロサイトを満たすためにLY色素を用いて細胞内イオントフォレシスを行った。図2は、代表的な星状細胞...

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Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

アストロサイトは形態的に複雑な細胞であり、その複数のプロセスとふさふさした領域によって例示される。彼らの精巧な形態を分析するために、我々は軽く固定された組織で細胞内ルシファー黄色イオントフォレシスを行う信頼性の高いプロトコルを提示する。

ルシファー黄イオン球形成を用いてアストロサイト形態を可視化

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

この方法は、疾患および安定状態のシナプスにおけるアストロサイトニューロン相互作用の評価のための非常に微細なアストロサイトプロセスの可視化を容易にするために使用することができる。この手法は、マウスモデル、細胞集団、または脳領域にも適用できます。適切な抵抗を持つ鋭い電極を調製するには、マイクロピペットプーラーにフィラメントを持つホウケイ酸ガラス単一バレル電極を引っ張ります。引っ張られた電極を閉じた容器に保管して、ほこりが先端に入るのを防ぎ、電極を箱の底から高く保ち、先端が壊れないようにします。電極にルシファーイエロー染料溶液を充填するには、先端を下向きにして垂直位置に電極を置き、電極の背面に1~2マイクロリットルのルシファーイエロー溶液をピペットします。電極の内側にルシファーイエローと接触して電極ホルダーの銀線をマニピュレータに接続した電極ホルダーに充填電極を静かに固定する前に、毛細管作用で溶液が先端に移動するまで5~10分待ちます。染料放出試験では、軽く固定された脳スライスを室温で0.1モルPBSで満たされたガラス底皿にそっと入れ、ナイロン弦のプラチナハープでスライスを所定の位置に保持します。電極を電圧源に接続し、グランド電極を脳スライスを含む浴槽に入れる。共焦点顕微鏡の目的を対象の脳領域に移動し、10X水浸水レンズを使用して電極を溶液に下げ、電極を視野の中心に移動させます。明視野照明の下で、電極が透明で、破片や気泡がないように、40X水浸漬レンズで電極を注意深く調べてください。488ナノメートルレーザーで共焦点レーザー走査顕微鏡に切り替えます。12ボルトで刺激装置をオンにして、染料の放出をテストします。電極の先端の周りに大きな蛍光色素雲が見えるはずです。その後、明視野下では、電極をスライスに向かってゆっくりと下げ、表面のすぐ上で停止する。目的のアストロサイトをイオントフォアシスで満たすには、赤外線差動干渉コントラストを使用して、直径約10マイクロメートル、スライス面より40〜50マイクロメートル下の細長い楕円形のソマトンを有するアストロサイトを同定します。これは、ピラミッド型細胞層の真下にある海馬の放射状層です。組織を移動すると、血管、ニューロン、アストロサイト、その他の細胞タイプが見えます。アストロサイトを選択したら、セルを視野の中心に移動し、電極先端をスライスにゆっくりと下げ、電極が細胞体と同じプレーンになるまで組織をナビゲートします。アストロサイトの細胞体がはっきりと見えて輪郭を描いたら、電極をゆっくりと穏やかに前進させ、先端が細胞のソーマを突き刺すまで電極を動かす。目的の焦点をゆっくりと上下に動かして、電極がソーマの内側にあるかどうかを確認します。電極先端がセルの内側に入ったら、刺激器を0.5~1ボルトでオンにして、電流を連続的にセルに排出します。共焦点顕微鏡を使用して、セルフィルムを見て、デジタルズームを増やして細胞の細部を視覚化し、必要に応じて電極の先端がセル内に見えるようにします。より細かい枝とプロセスが現れるまで約15分間待ってから、電圧をオフにしてセルから電極先端をそっと引き出します。充填されたセルを画像化するには、セルが元の形に戻るのを15〜20分待ってから、共焦点顕微鏡の設定を調整して、より細かい枝とプロセスが40倍の目的の下で定義されていることを確認します。ステップサイズ0.3マイクロメートルのZスタックを設定し、セルからの信号がなくなるまでイメージング中に目的を移動させ、そのステップをトップに設定します。その後、目的を下に移動し、信号がなくなるまでセルを通してフォーカスし、そのステップを底に設定します。撮像が完了したら、電極で染料の放出を確認します。大きな染料雲が現れる場合は、電極を次のスライスに使用できます。それ以外の場合は、電極を交換してください。最大強度投影を生成することにより、そのドメインにおけるアストロサイトの構造の詳細図が観察される。アストロサイトにズーム倍率が4倍に達すると、1つの主要分岐、いくつかの二次分岐、および周囲の枝およびリーフレットの分布の最大強度の投影が明らかになります。ここでは、CA1アストロサイトの元の画像が示されています。アストロサイトで囲まれた細胞体、主要な枝、プロセス、および領土の体積は、これらの後続の画像で再構築されます。再建が行われた後、相馬、細胞全体、および領土の体積を定量化した。そして、主要な支店の数が数えられました。中間アストロサイトフィラメントに標識する細胞骨格タンパク質としては、細胞ソーマ、主要分岐、およびいくつかの二次アストロサイト分岐で発現されるが、より細かい枝およびプロセスでは発現しない。この代表的な分析では、グリアフィブリリン酸性タンパク質によって標識された一次枝の数とルシファーイエローで視覚化されるものに有意な違いは見つからなかった。また、グリアフィブリル酸性タンパク質で標識されたアストロサイトの細胞面積と体積は、ルシファーイエローで視覚化された面積および体積よりも有意に小さく、グリア細動酸性タンパク質が主要な枝を標識するための信頼できるマーカーであることを実証したが、細胞の全体的面積または体積を決定するのに有用ではない。電極先端から放出される染料の量は、色素の安定した流れを排出するのに十分な高さでなければならない電極抵抗に依存する。今後の研究では、超分解能光顕微鏡法またはアストロサイト構造内の特定のタンパク質の発現の免疫組織化学的分析によって、アストロサイト構造の異なる成分を調べることができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

ゴルジコックス染色で樹状形態とシナプス接続に関するポジティブ初期の経験、触覚刺激の効果を可視化する

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：<em&gt;インビトロ</em&gt;ニューロングリアの相互作用の詳細な調査のためのセットアップ

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

反応性アストロ サイトと増殖の in Vitro虚血のような条件下での監視

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

列およびレイヤーで樹状形態を分析します

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

脳の細胞外空間の体積分率とねじれを定量するためのテトラメチルアンモニウムによるリアルタイムイオントフォレシス

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

貪食能アッセイのアストロ サイトを介した新規体外ライブ イメージングを使用して pH インジケーター共役シナプトソーム

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

免疫組織化学準備 ImageJ を用いた組織の顕微鏡写真からミクログリアの形態の定量化

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...