Name: visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

저자는 소토 씨, 유 박사, 옥토 박사에게 지도와 텍스트에 대한 의견에 감사드립니다. 이 작업은 NS060677에서 지원됩니다.

이 연구에서 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행 하 고 캘리포니아 대학에서 총리의 동물 연구 위원회에 의해 승인 되었다, 로스 앤젤레스. 성인 마우스(6-8주령)의 혼성 성생을 모든 실험에서 사용하였다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>
인공 뇌척수액 (ACSF) 용액
	<ol>
<li>각 실험 전에 신선한 ACSF 용액(135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1...

<ol>
	<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits.">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).</li><li>Ben Haim, L., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+astrocytes+in+neural+circuit+regulation.">Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).</li><li>Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+Shapeshifter:+Mechanisms+Allowing+Astrocytes+to+Respond+to+the+Changing+Nervous+System+During+Development,+Injury+and+Disease.">Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Circuit-Specialized+Astrocytes:+Transcriptomic,+Proteomic,+Morphological,+and+Functional+Evidence.">Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Sun, D., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+astrocytes+in+the+injured+CNS.">Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS.</a> Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).</li><li>Naskar, S., Chattarji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Elicits+Contrasting+Effects+on+the+Structure+and+Number+of+Astrocytes+in+the+Amygdala+versus+Hippocampus.">Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus.</a> eNeuro. 6 (1), (2019).</li><li>Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+spatial+arrangement+of+astrocytes+in+the+optic+nerve+head+of+the+mouse.">The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).</li><li>Grosche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+simple+approach+to+determine+astrocyte+territories+in+mouse+neocortex+and+hippocampus.">Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).</li><li>Kaynig, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automatic+reconstruction+of+neuronal+processes+from+electron+microscopy+images.">Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images.</a> Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Wilhelmsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+concept+of+reactive+astrocytes+as+cells+that+remain+within+their+unique+domains+upon+reaction+to+injury.">Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).</li><li>Williams, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-9+regulates+synapse-specific+differentiation+in+the+developing+hippocampus.">Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus.</a> Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Astrocyte+Water+Channel+Aquaporin-4+in+the+Mouse+Brain.">Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain.</a> ASN Neuro. 7 (5), (2015).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).</li><li>Luna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+structural+reactivity+and+plasticity+in+models+of+retinal+detachment.">Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).</li><li>Octeau, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optical+Neuron-Astrocyte+Proximity+Assay+at+Synaptic+Distance+Scales.">An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales.</a> Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).</li><li>Sosunov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+isocortical+and+hippocampal+astrocytes+in+the+human+brain.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).</li><li>Park, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Specificity+and+Coverage+of+hGFAP-CreERT2+[Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc]+Mouse+Line+in+Various+Brain+Regions.">Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions.</a> Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).</li><li>Koeppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Consequences+of+Synapse+Remodeling+Following+Astrocyte-Specific+Regulation+of+Ephrin-B1+in+the+Adult+Hippocampus.">Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).</li><li>Jefferis, G. S., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+and+combinatorial+neuron+labelling.">Sparse and combinatorial neuron labelling.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).</li><li>Lanjakornsiripan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+morphological+and+molecular+differences+in+neocortical+astrocytes+and+their+dependence+on+neuronal+layers.">Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).</li></ol>

이 백서에 설명된 방법은 가볍게 고정된 두뇌 조각에 있는 LY 염료의 세포내 이온 백공증을 사용하여 성상 세포 형태를 구상하는 쪽을 기술합니다. 세포의 성공적인 LY 이온 토포레시스 및 형태학적 재건에 기여하는 이 프로토콜에서 강조된 몇몇 중요한 요인이 있습니다. 한 가지 요인은 이미지의 품질과 재현성이며, 이는 주로 마우스의 나이와 관류의 결과에 의해 결정됩니다. 이 연구에서는, 우?...

성상 세포는 중추 신경계에서 가장 풍부한 신경교 세포입니다 (CNS). 그들은 이온 항상성, 혈류 조절, 시냅스 형성뿐만 아니라 제거 및 신경 전달 물질 섭취 량1. 성상 세포 함수의 넓은 범위는 복잡한 형태 구조2,3에반영됩니다. 성상 세포는 시냅스, 모수석, 축사, 혈관 및 기타 신경교 세포와 직접 상호 작용하는 수천 개의 미세한 가지와 전단지로 나누는 여러 가지 기본 및 이차 가지를 포함합니다. 성상 세포 형태는 신경 회로4에서 그들의 기능을 차별적으로 수행하는 그들의 기능에 암시할 수 있는 다른 두뇌 지구에 걸쳐변화합니다. 더욱이, 성상 세포는 발달 도중, 생리적인 조건 도중, 및 다중 질병 상태3,5,6에서그들의 형태를 바꾸기 위하여 알려지고 있습니다.
성상 세포 형태학의 복잡성을 정확하게 해결하기 위해서는 일관되고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 전통적으로, 면역히스토화학은 성상세포 특이적 또는 성상세포 농축 단백질 마커를 사용하여 성상세포를 시각화하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 방법은 성상 세포의 구조보다는 단백질 발현의 패턴을 드러낸다. 신경교 섬유산성 단백질(GFAP) 및 S100 칼슘 결합 단백질 β(S100β)와 같은 일반적으로 사용되는 마커는 전체 세포 부피에서 발현되지 않으며 따라서 완전한 형태론7을해결하지 못한다. 성상 세포 (바이러스 주사 또는 형질 전환 마우스 기자 라인)에서 유비쿼터스형형 단백질을 발현하는 유전 적 접근법은 미세한 가지 및 전체 영역을 식별 할 수 있습니다. 그러나, 개별 성상세포를 구별하기 어렵고, 분석은 특정 프로모터8에의해 표적화된 성상세포 집단에 의해 편향될 수 있다. 직렬 섹션 전자 현미경 검사법은 시냅스와 성상 세포 프로세스의 상호 작용의 상세한 그림을 밝히기 위하여 이용되었습니다. 시냅스와 접촉하는 수천 개의 성상 세포 프로세스로 인해 현재이 기술9로전체 세포를 재구성 할 수는 없지만 데이터 분석을위한 기계 학습 접근 법을 사용하여 변경 될 것으로 예상됩니다.
이 보고서에서는 CA1 지층 라디덤을 예로 사용하여 루시퍼 옐로우(LY) 염료로 세포내 이온포레시스를 사용하여 마우스 성상세포를 특성화하는 절차에 중점을 둡니다. 이 방법은 에릭 부송과 마크 엘리스만10,11의선구적인 과거 작품을 기반으로합니다. 가볍게 고정 된 뇌 조각에서 성상 세포는 그들의 독특한 소마 모양에 의해 확인 되 고 LY로 가득. 세포는 공초점 현미경 검사법으로 그 때 심상됩니다. 우리는 LY 이온 토포레시스가 개별 성상 세포들을 재구성하고 그들의 프로세스 및 영토의 상세한 형태학적 분석을 수행하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 또한,이 방법은 성상 세포와 뉴런, 다른 신경교 세포, 뇌 혈관 사이의 공간 관계와 상호 작용을 식별하기 위해 면역 조직 화학과 함께 적용 할 수 있습니다. 우리는 LY 이온 토포레시스가 건강 또는 질병 상태의 다른 뇌 영역 및 마우스 모델에서 형태를 분석하는 매우 적합한 도구라고 생각7,12,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:995px;" width="994">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">SF 100-20</td>
			<td style="width:240px;">An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:192px;">Pall</td>
			<td style="width:196px;">4692</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ag/AgCl ground pellet</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP2</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti Aquaporin-4 antibody</td>
			<td style="width:192px;">Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-87679</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti GFAP antibody</td>
			<td style="width:192px;">Abcam</td>
			<td style="width:196px;">ab4674</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass pipettes with filament</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6NTac mice</td>
			<td>Taconic Stock</td>
			<td style="width:196px;">B6</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td style="width:192px;">Olympus</td>
			<td style="width:196px;">FV1000MPE</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode puller- Model P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td style="width:196px;">P-97</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:196px;">0100-01</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td>
			<td style="width:192px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>400-10</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris software (Version 7.6.5)</td>
			<td style="width:192px;">Bitplane Inc.</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:192px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)</td>
			<td style="width:192px;">Clipper</td>
			<td>1050035</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:196px;">24X60-1</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">12-544-2</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:192px;">Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (40x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:196px;">LUMPLFLN 40XW</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (60x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanAPO 60X</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS tablets, 100 mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td>VWRVE404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pipette micromanipulator- Model ROE-200</td>
			<td style="width:192px;">Sutter</td>
			<td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulator- Model Omnical 2010</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">Omnical 2010</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">T8787</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome- Model #3000</td>
			<td style="width:192px;">Pelco</td>
			<td style="width:196px;">100-S</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis

성상 세포는 신경 회로의 필수 구성 요소입니다. 그(것)들은 전체 중추 신경계 (CNS)를 타일하고 신경 전달 물질 정리, 이온 규칙, 시냅스 변조, 뉴런에 대한 신진 대사 지원 및 혈류 조절을 포함하는 다양한 기능에 관여합니다. 성상 세포는 소마, 여러 가지, 그리고 neuropil 내의 다양한 세포 요소에 접촉하는 수많은 미세 한 과정이 복잡한 세포입니다. 성상 세포의 형태를 평가하기 위해서는 구조를 시각화하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 우리는 성인 마우스에서 가볍게 고정 된 뇌 조직에서 형광 루시퍼 노란색 (LY) 염료를 사용하여 성상 세포의 세포 내 이온 토포레스를 수행하는 신뢰할 수있는 프로토콜을보고합니다. 이 방법에는 성상 세포 형태를 특성화하는 데 유용한 몇 가지 기능이 있습니다. 그것은 개별 성상 세포의 3 차원 재건을 허용, 이는 구조의 다른 측면에 형태 학적 분석을 수행하는 데 유용합니다. LY 이온 토포레시스와 함께 면역 조직 화학은 또한 신경계의 다른 구성 요소와 성상 세포의 상호 작용을 이해하고 표지 된 성상 세포 내에서 단백질의 발현을 평가하기 위해 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 경검사법으로 성상세포 형태를 엄격하게 검사하기 위해 CNS 장애의 다양한 마우스 모델에서 구현될 수 있다. LY 이온 토포레시스는 성상 세포 구조를 평가하기 위한 실험적 접근법을 제공하며, 특히 이러한 세포가 중요한 형태학적 변화를 겪도록 제안된 부상이나 질병의 맥락에서.

본 연구에서 보고된 데이터는 각 실험에서 4개의 마우스로부터 7-12개의 세포로부터 의입니다. 평균 데이터는 적절한 경우 그림 패널에 보고됩니다.
성상 세포 형태를 평가하기 위해, 우리는 그림 1에요약된 CA1 지층 라디에움에 성상 세포를 채우기 위해 LY 염료를 사용하여 세포 내 이온 토포레증을 수행했습니다. 그림 2는 대표적인 성상 세포...

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Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

성상 세포는 형태학적으로 복잡한 세포이며, 여러 과정과 덤불 영토에 의해 예시됩니다. 그들의 정교한 형태를 분석하기 위하여는, 우리는 가볍게 고정한 조직에서 세포내 Lucifer 황색 이온 포레시스를 능력을 발휘하기 위하여 믿을 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

루시퍼 황색 이온토포레시스를 사용하여 성상세포 형태 시각화

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

이 방법은 질병 및 꾸준한 상태 동안 시냅스에서 성상 세포 상호 작용의 평가를 위한 매우 미세한 성상세포 과정의 시각화를 용이하게 하는 데 사용할 수 있다. 이 기술은 또한 어떤 마우스 모형, 세포 인구, 또는 두뇌 지구에 적용될 수 있습니다. 적절한 저항으로 날카로운 전극을 준비하려면 마이크로 피펫 풀러에 필라멘트가 있는 보로실리케이트 유리 단일 배럴 전극을 당깁니다.먼지가 팁에 들어가는 것을 방지하고 팁이 파손되지 않도록 상자 의 바닥에서 높은 전극을 유지하기 위해 밀폐 된 용기에 당겨진 전극을 저장합니다. 루시퍼 옐로우 염료 용액으로 전극을 채우기 위해 팁이 아래쪽으로 향하는 수직 위치에 전극을 배치하고, 파이펫 1~2개의 마이크로리터의 피펫을 전극 의 뒷면에 넣습니다. 용액이 모세관 작용을 통해 팁으로 이동하기 까지 5~10분 정도 기다린 후 전극 내부의 용화물 노란색과 접촉하는 전극 홀더의 은색 와이어와 연결된 전극 홀더에 채워진 전극을 부드럽게 고정하십시오.염료 배출 테스트를 위해 가볍게 고정된 뇌 슬라이스를 실온에서 0.1 대구 PBS로 채워진 유리 바닥 접시에 부드럽게 놓고 나일론 끈이 달린 백금 하프로 슬라이스를 제자리에 고정시십시오. 전극을 전압 소스에 연결하고 접지 전극을 뇌 슬라이스를 포함하는 욕조에 배치합니다. 공초점 현미경의 목표를 관심 있는 뇌 영역으로 이동하고 전극을 10X 수질 침지 렌즈를 사용하여 용액으로 낮추고 전극을 시야의 중심으로 이동시합니다.밝은 필드 조명 아래에서 40X 수질 침수 렌즈로 전극을 주의 깊게 검사하여 전극이 투명하고 파편이나 거품없이 나타나도록 하십시오. 488 나노미터 레이저로 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법으로 전환합니다. 12볼트에서 자극기를 켜서 염료 배출을 테스트합니다.대형 형광염염분 구름은 전극 의 끝 주위에 표시되어야 합니다. 그런 다음 밝은 필드 아래에서 천천히 전극을 슬라이스쪽으로 낮추고 표면 바로 위에 멈춥춥시다. 이온토포레시스로 관심 있는 성상세포를 채우려면 적외선 차동 간섭 대비를 사용하여 길쭉한 타원형 소마타가 있는 성상세포에 직경 약 10마이크로미터, 슬라이스 표면 아래 40~50마이크로미터를 식별합니다.이것은 피라미드 세포 층 바로 아래 해마의 지층 방사체입니다. 우리가 조직을 통해 이동할 때, 우리는 혈관, 신경 세포, 성상 세포 및 그밖 세포 모형을 볼 수 있습니다. 성상세포가 선택되면, 세포를 시야 의 중심으로 이동하고 천천히 전극 팁을 슬라이스로 낮추고 전극이 세포 몸과 동일한 평원에 될 때까지 조직을 탐색합니다.성상세포의 세포 본체가 명확하게 보이고 윤곽을 드러내면, 천천히 부드럽게 전극을 앞으로 전진시키고, 팁이 세포의 소마를 뚫을 때까지 전극을 움직입니다. 전극이 소마 내부에 있는지 주의하기 위해 목표의 초점을 천천히 위아래로 이동합니다. 전극 끝이 세포 내부에 있으면 0.5 ~1볼트의 자극기를 켜서 전류를 지속적으로 셀로 배출합니다.공초점 현미경을 사용하여, 세포 필름을 보고, 디지털 줌을 증가시켜 세포의 세부 사항을 시각화하고 전극의 끝이 필요에 따라 셀 내부에 보이는지 확인합니다. 전압을 끄고 셀에서 전극 끝을 부드럽게 철회하기 전에 미세한 가지와 프로세스가 정의 될 때까지 약 15 분 동안 기다립니다. 채워진 셀을 이미지하기 위해, 세포가 원래 의 형태로 돌아갈 때까지 15~20분 기다린 후 공초점 현미경의 설정을 조정하여 40X 목표에 따라 미세한 분기와 프로세스가 정의된지 확인합니다.0.3 마이크로미터의 스텝 크기로 Z 스택을 설정하고, 세포에서 신호가 없을 때까지 이미징하는 동안 목표를 이동하고 해당 단계를 정상으로 설정합니다. 그런 다음 신호를 볼 때까지 셀을 통해 초점을 맞추고 목표를 아래로 이동하고 해당 단계를 바닥으로 설정합니다. 이미징이 완료되면 전극에서 염색 배출을 확인합니다.큰 염료 구름이 나타나면 전극을 다음 슬라이스에 사용할 수 있습니다. 그렇지 않으면 전극을 교체하십시오. 최대 강도 투영을 생성함으로써 해당 도메인의 성상세포 구조에 대한 자세한 뷰를 관찰할 수 있습니다.성상세포로 4X 크기 확대하면 하나의 주요 분기, 여러 보조 분기 및 주변 분기 및 전단지의 분포의 최대 강도 투영을 알 수 있습니다. 여기서CA1 성상세포의 원본 이미지가 표시됩니다. 세포 체, 주요 분기, 프로세스 및 성상세포에 의해 동봉된 영토 부피는 이러한 후속 이미지에서 재구성됩니다.재건이 만들어진 후, 소마, 전체 세포 및 영토의 양이 정량화되었다. 그리고 주요 지점의 수는 계산되었다. 중간 성상 세포 필라멘트를 라벨세포 켈레탈 단백질로 세포 소마, 주요 분기 및 일부 이차 성상세포 가지에서 발현되지만 미세한 가지 및 공정에서는 발현되지 않습니다.이 대표적인 분석에서는, 신경교 세동산 단백질에 의해 표지된 1 차적인 분기의 수및 그 루시퍼 노란색에 의해 그 시각화에서 중요한 다름이 발견되지 않았습니다. 또한, 글리아 세동 산성 단백질에 의해 표지된 성상세포의 세포 면적 및 부피는 루시퍼 옐로우로 시각화된 면적 및 부피보다 현저히 작었으며, 글리아 세동 산성 단백질은 주요 분기를 표지하는 신뢰할 수 있는 마커이지만 세포의 전체 영역 또는 부피를 결정하는 데 유용하지 않다는 것을 입증하였다. 전극 끝에서 방출되는 염료의 양은 염료의 꾸준한 스트림이 배출될 수 있을 만큼 충분히 높아야 하는 전극 저항에 달려 있다.향후 연구는 초분해성 광 현미경 검사법에 의해 또는 성상세포 구조 내의 특정 단백질의 발현의 면역조직화학적 분석에 의해 성상세포 구조의 다른 성분을 검사할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

골지 콕스 염색과 돌기​​ 형태와 시냅스 연결에 대한 긍정적 인 초기 경험, 촉각 자극의 효과를 시각화

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

연구

신경과학

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

사이토 반응성 및 확산에서 체 외에 허 혈 성 같은 조건 모니터링

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

뇌의 세포 외 공간의 부피비와 비틀림을 정량화하기위한 테트라 메틸 암모늄을 이용한 실시간 이온 도입

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Biotinylation을 사용하여 기본 Astrocyte 문화에서 단백질의 세포 표면 표현 및 Endocytic 속도를 결정

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...