Name: visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

Forfatterne takker MS Soto, Dr. Yu, og Dr. Octeau for veiledning, samt kommentarer på teksten. Dette arbeidet er støttet av NS060677.

Dyret eksperimenter i denne studien ble utført i samsvar med National Institute of Health guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr og ble godkjent av kansler ' s Animal Research Committee ved University of California, Los Angeles. Voksne mus (6 − 8 uker gammel) av blandet kjønn ble brukt i alle eksperimenter.
1. klargjøring av løsning
<ol><li>
Kunstig spinalvæske (ACSF) løsning
	<ol>
<li>Forbered frisk ACSF-løsning (135 mm NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, ...

<ol>
	<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits.">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).</li><li>Ben Haim, L., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+astrocytes+in+neural+circuit+regulation.">Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).</li><li>Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+Shapeshifter:+Mechanisms+Allowing+Astrocytes+to+Respond+to+the+Changing+Nervous+System+During+Development,+Injury+and+Disease.">Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Circuit-Specialized+Astrocytes:+Transcriptomic,+Proteomic,+Morphological,+and+Functional+Evidence.">Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Sun, D., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+astrocytes+in+the+injured+CNS.">Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS.</a> Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).</li><li>Naskar, S., Chattarji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Elicits+Contrasting+Effects+on+the+Structure+and+Number+of+Astrocytes+in+the+Amygdala+versus+Hippocampus.">Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus.</a> eNeuro. 6 (1), (2019).</li><li>Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+spatial+arrangement+of+astrocytes+in+the+optic+nerve+head+of+the+mouse.">The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).</li><li>Grosche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+simple+approach+to+determine+astrocyte+territories+in+mouse+neocortex+and+hippocampus.">Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).</li><li>Kaynig, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automatic+reconstruction+of+neuronal+processes+from+electron+microscopy+images.">Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images.</a> Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Wilhelmsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+concept+of+reactive+astrocytes+as+cells+that+remain+within+their+unique+domains+upon+reaction+to+injury.">Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).</li><li>Williams, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-9+regulates+synapse-specific+differentiation+in+the+developing+hippocampus.">Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus.</a> Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Astrocyte+Water+Channel+Aquaporin-4+in+the+Mouse+Brain.">Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain.</a> ASN Neuro. 7 (5), (2015).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).</li><li>Luna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+structural+reactivity+and+plasticity+in+models+of+retinal+detachment.">Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).</li><li>Octeau, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optical+Neuron-Astrocyte+Proximity+Assay+at+Synaptic+Distance+Scales.">An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales.</a> Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).</li><li>Sosunov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+isocortical+and+hippocampal+astrocytes+in+the+human+brain.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).</li><li>Park, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Specificity+and+Coverage+of+hGFAP-CreERT2+[Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc]+Mouse+Line+in+Various+Brain+Regions.">Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions.</a> Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).</li><li>Koeppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Consequences+of+Synapse+Remodeling+Following+Astrocyte-Specific+Regulation+of+Ephrin-B1+in+the+Adult+Hippocampus.">Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).</li><li>Jefferis, G. S., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+and+combinatorial+neuron+labelling.">Sparse and combinatorial neuron labelling.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).</li><li>Lanjakornsiripan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+morphological+and+molecular+differences+in+neocortical+astrocytes+and+their+dependence+on+neuronal+layers.">Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).</li></ol>

Metoden skissert i denne utredningen beskriver en måte å visualisere astrocytt morfologi ved hjelp av intracellulære Iontoforese av LY fargestoff i lett faste hjerne skiver. Det er flere kritiske faktorer uthevet i denne protokollen som bidrar til vellykket LY Iontoforese og morfologiske rekonstruksjon av cellene. En faktor er kvaliteten og reproduserbarhet av bildene, som bestemmes i stor grad av alder av musen og utfallet av. I denne studien brukte vi C57/BL6N mus 6 − 8 uker gammel. En vellykket blod (sterkt avhen...

Astrocytter er de mest tallrike gliacellene cellene i det sentrale nervesystemet (CNS). De spiller roller i ion homeostase, blodstrøm regulering, synapse formasjon, samt eliminering, og signalstoffet opptak1. Det store utvalget av astrocytt funksjoner gjenspeiles i deres komplekse morfologiske struktur2,3. Astrocytter inneholder flere primære og sekundære grener som deler seg inn i tusenvis av finere branchlets og brosjyrer som direkte samhandler med synapser, dendrites, axons, blodkar og andre gliacellene celler. Astrocytt morfologi varierer på tvers av ulike hjerneregioner, noe som kan hint på deres evne til å utføre sine funksjoner differensielt i neuronal kretser4. Videre er astrocytter kjent for å endre sin morfologi under utvikling, under fysiologiske forhold, og i flere sykdomstilstander3,5,6.
En konsistent, reproduserbar metode er nødvendig for å nøyaktig løse kompleksiteten av astrocytt morfologi. Tradisjonelt har immunhistokjemi blitt brukt til å visualisere astrocytter med bruk av astrocytt spesifikke eller astrocytt beriket protein markører. Disse metodene avslører imidlertid mønsteret av protein uttrykk i stedet for astrocytt struktur. De brukte markører, for eksempel gliacellene fibrillary surt protein (GFAP) og S100 kalsium bindende protein β (S100β), ikke uttrykker i hele celle volumet og dermed ikke løse komplett morfologi7. Genetiske tilnærminger for å uttrykke fluorescerende proteiner overalt i astrocytter (virale injeksjoner eller transgene mus reporter linjer) kan identifisere finere grener og generelle territorium. Det er imidlertid vanskelig å differensiere individuelle astrocytter, og analysene kan være partisk av den astrocytt befolkningen som er målrettet mot den spesifikke arrangøren8. Serial § elektron mikroskopi har blitt brukt til å avdekke et detaljert bilde av interaksjoner av astrocytt prosesser med synapser. På grunn av tusenvis av astrocytt prosesser som kontakter synapser, er det for øyeblikket ikke mulig å rekonstruere en hel celle med denne teknikken9, selv om dette er forventet å endre med bruk av maskin læringstilnærminger for dataanalyse.
I denne rapporten fokuserer vi på en prosedyre for å karakterisere muse astrocytter ved hjelp av intracellulære Iontoforese med Lucifer gul (LY) fargestoff, ved hjelp av CA1 stratum radiatum som et eksempel. Metoden er basert på banebrytende tidligere arbeid av Eric Bushong og Markus Ellisman10,11. Astrocytter fra lett faste hjerne skiver identifiseres av deres karakteristiske Soma form og fylt med LY. Cellene blir deretter avbildet med konfokalmikroskopi mikroskopi. Vi demonstrerer hvordan LY-Iontoforese kan brukes til å rekonstruere individuelle astrocytter og utføre detaljerte morfologiske analyser av deres prosesser og territorium. Denne metoden kan også brukes sammen med immunhistokjemi for å identifisere romlige forhold og interaksjoner mellom astrocytter og neurons, andre gliacellene celler, og hjernen blodkar. Vi anser ly Iontoforese å være et svært egnet verktøy for å analysere morfologi i ulike hjernen regioner og mus modeller av sunne eller sykdom forhold7,12,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:995px;" width="994">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">SF 100-20</td>
			<td style="width:240px;">An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:192px;">Pall</td>
			<td style="width:196px;">4692</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ag/AgCl ground pellet</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP2</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti Aquaporin-4 antibody</td>
			<td style="width:192px;">Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-87679</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti GFAP antibody</td>
			<td style="width:192px;">Abcam</td>
			<td style="width:196px;">ab4674</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass pipettes with filament</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6NTac mice</td>
			<td>Taconic Stock</td>
			<td style="width:196px;">B6</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td style="width:192px;">Olympus</td>
			<td style="width:196px;">FV1000MPE</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode puller- Model P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td style="width:196px;">P-97</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:196px;">0100-01</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td>
			<td style="width:192px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>400-10</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris software (Version 7.6.5)</td>
			<td style="width:192px;">Bitplane Inc.</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:192px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)</td>
			<td style="width:192px;">Clipper</td>
			<td>1050035</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:196px;">24X60-1</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">12-544-2</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:192px;">Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (40x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:196px;">LUMPLFLN 40XW</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (60x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanAPO 60X</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS tablets, 100 mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td>VWRVE404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pipette micromanipulator- Model ROE-200</td>
			<td style="width:192px;">Sutter</td>
			<td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulator- Model Omnical 2010</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">Omnical 2010</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">T8787</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome- Model #3000</td>
			<td style="width:192px;">Pelco</td>
			<td style="width:196px;">100-S</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis

Astrocytter er essensielle komponenter av nevrale kretser. De flis hele sentralnervesystemet (CNS) og er involvert i en rekke funksjoner, som inkluderer signalstoffet klaring, ion regulering, Synaptic modulering, metabolsk støtte til neurons, og blodstrøm regulering. Astrocytter er komplekse celler som har en Soma, flere store grener, og mange fine prosesser som kontakter ulike cellulære elementer innenfor neuropil. For å vurdere morfologi av astrocytter, er det nødvendig å ha en pålitelig og reproduserbar metode for å visualisere deres struktur. Vi rapporterer en pålitelig protokoll for å utføre intracellulære Iontoforese av astrocytter ved hjelp av fluorescerende Lucifer gul (LY) fargestoff i lett fast hjernevev fra voksen mus. Denne metoden har flere funksjoner som er nyttige for å karakterisere astrocytt morfologi. Det gir mulighet for tredimensjonal rekonstruksjon av individuelle astrocytter, som er nyttig å utføre morfologiske analyser på ulike aspekter av deres struktur. Immunhistokjemi sammen med LY-Iontoforese kan også benyttes for å forstå samspillet mellom astrocytter med ulike komponenter i nervesystemet og for å evaluere uttrykket av proteiner innenfor de merkede astrocytter. Denne protokollen kan implementeres i en rekke musemodeller av CNS lidelser for å grundig undersøke astrocytt morfologi med lys mikroskopi. LY Iontoforese gir en eksperimentell tilnærming for å evaluere astrocytt struktur, spesielt i sammenheng med skade eller sykdom der disse cellene er foreslått å gjennomgå betydelige morfologiske endringer.

Dataene som rapporteres i denne studien, er fra 7 − 12 celler fra 4 mus i hvert eksperiment. Gjennomsnittsdata rapporteres i figur panelene der det er hensiktsmessig.
For å vurdere astrocytt morfologi, utførte vi intracellulære Iontoforese bruker LY fargestoff for å fylle astrocytter i CA1 stratum radiatum, som er oppsummert i figur 1. Figur 2 viser en representativ astrocytt og dens forseggjorte morfologiske struktur. Cellen ble avbildet et...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytter er morfologisk komplekse celler, som er et eksempel på flere prosesser og buskete territorier. For å analysere deres forseggjort morfologi, presenterer vi en pålitelig protokoll for å utføre intracellulære Lucifer gul Iontoforese i lett fast vev.

Visualisere Astrocytt morfologi bruke Lucifer Yellow Iontoforese

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Denne metoden kan brukes til å lette visualiseringen av svært fine astrocytterprosesser for evaluering av astrocyttnevroniske interaksjoner ved synapse under sykdom og steady states. Denne teknikken kan også brukes i en hvilken som helst musemodell, cellepopulasjon eller hjerneregion. For å forberede en skarp elektrode med passende motstand, trekk en borosilikatglass enkelt fat elektrode med en filament på en mikropipette avtrekker.Oppbevar de trukket elektrodene i en lukket beholder for å hindre at støv kommer inn i tuppene og hold elektrodene hevet fra bunnen av esken for å hindre at tuppene bryter. For å fylle en elektrode med lucifer gul fargestoffløsning, plasser en elektrode i vertikal stilling med spissen vendt nedover, og pipette en til to mikroliter med lucifer gul oppløsning inn på baksiden av elektroden. Vent i fem til 10 minutter til oppløsningen går over til spissen via kapillærhandling før du forsiktig fester den fylte elektroden i en elektrodeholder koblet til en manipulator med sølvtråden på elektrodeholderen i kontakt med lucifergulen inne i elektroden.For fargeutstøtingstesten, legg forsiktig en lett fast hjerneskive i en glassbunnsrett fylt med 0,1 molar PBS ved romtemperatur og hold skiven på plass med en platinaharpe med nylonstrenger. Koble elektroden til en spenningskilde og plasser jordelektroden i badekaret som inneholder hjerneskiven. Flytt målet med et konfokalt mikroskop til hjernens interesseområde og senk elektroden inn i løsningen ved hjelp av 10X vannsenkingslinsen, og flytt elektroden til midten av synsfeltet.Under lysfeltbelysning må du undersøke elektroden nøye med 40X vannsenkingslinsen for å sikre at elektroden ser klar ut og uten rusk eller bobler. Bytt til konfokal laserskanning mikroskopi med en 488-nanometer laser. Slå på stimulatoren ved 12 volt for å teste fargeutstøtingen.En stor fluorescerende fargesky skal være synlig rundt spissen av elektroden. Deretter, under lyst felt sakte senke elektroden mot skiven, stopper like over overflaten. For å fylle en astrocytt av interesse med iiontoforese, bruk den infrarøde differensialinterferenskontrast for å identifisere astrocytter med langstrakte ovalformede somata ca 10 mikrometer i diameter, 40 til 50 mikrometer under skiveoverflaten.Dette er stratum radiatum av hippocampus rett under pyramidecellelaget. Når vi beveger oss gjennom vevet, kan vi se blodkar, nevroner, astrocytter og andre celletyper. Når en astrocytt er valgt, flytter du cellen til midten av synsfeltet og senker elektrodespissen sakte ned i skiven, navigerer gjennom vevet til elektroden er på samme slette som cellekroppen.Når cellekroppen av astrocytten er tydelig synlig og skissert, sakte og forsiktig fremme elektroden fremover, flytte elektroden til spissen spidder soma av cellen. Flytt fokuset på målet sakte opp og ned for å merke seg om elektroden er inne i soma. Når elektrodespissen er inne i cellen, slår du på stimulatoren ved 0,5 til ett volt for å kontinuerlig kaste ut strøm inn i cellen.Bruk det konfokale mikroskopet, se cellefilmen, øke den digitale zoomen for å visualisere detaljene i cellen og for å sikre at spissen av elektroden er synlig inne i cellen etter behov. Vent i ca 15 minutter til de finere grenene og prosessene vises definert før du slår av spenningen og trekker forsiktig elektrodespissen ut av cellen. Hvis du vil se den fylte cellen, venter du 15 til 20 minutter på at cellen går tilbake til den opprinnelige formen før du justerer innstillingen på det konfokale mikroskopet for å forsikre deg om at de finere grenene og prosessene vises definert under 40X-målet.Sett opp en Z-stabel med en trinnstørrelse på 0,3 mikrometer, flytt målet mens du bilde av til det ikke er noe signal fra cellen og angi dette trinnet som toppen. Flytt deretter målet ned, med fokus gjennom cellen til det ikke er noe signal og sett det trinnet som bunnen. Når bildet er fullført, kontroller elektroden for utstøting av fargestoff.Hvis en stor fargesky vises, kan elektroden brukes til neste skive. Ellers erstatter du elektroden. Ved å generere en maksimal intensitetprojeksjon, kan en detaljert visning av strukturen til en astrocytt i domenet observeres.En fire X-størrelseszoom inn i astrocytten avslører en maksimal intensitetsprojeksjon av en stor gren, flere sekundære grener og fordelingen av de omkringliggende forgrenene og brosjyrene. Her vises det opprinnelige bildet av en CA1 astrocyte. Cellekroppen, store grener, prosesser og territoriumvolum omsluttet av astrocytten rekonstrueres i disse påfølgende bildene.Etter at rekonstruksjonene ble opprettet, ble volumene av soma, hele cellen og territoriet kvantifisert. Og antall store grener ble talt. Som cytoskeletal protein som merker mellomliggende astrocytt filamenter uttrykkes i cellen soma, store grener, og noen sekundære astrocytt grener, men ikke i de finere grener og prosesser.I denne representative analysen ble det ikke funnet signifikante forskjeller i antall primære grener merket av glialflimmersyreprotein og de som visualiserer ved lucifer gul. Videre var celleområdet og volumet av astrocytten merket med glialflimmersyreprotein betydelig mindre enn området og volumet visualisert med lucifer gul, noe som viser at glialflimmersyre protein er en pålitelig markør for merking av store grener, men er ikke nyttig for å bestemme det totale arealet eller volumet av cellen. Mengden fargestoff som frigjøres fra elektrodespissen, er avhengig av elektrodemotstanden som må være høy nok til at en jevn strøm av fargestoff kan kastes ut.Fremtidige studier kan undersøke de ulike komponentene i astrocyttstruktur ved superoppløsnings lysmikroskopi eller ved immunohistokjemisk analyse av uttrykket av spesifikke proteiner innenfor astrocyttstrukturen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Visualisere effekten av en positiv tidlig Experience, Taktil Stimulering, på dendrittiske morfologi og Synaptic Connectivity med Golgi-Cox Farging

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforese av glutamat og GABA: Et nyttig verktøy for å etterforske Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Den Indirekte Neuron-astrocyte coculture analyse: En<em&gt; In Vitro</em&gt; Oppsett for detaljert undersøkelse av Neuron-gliaceller interaksjoner

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Overvåking astrocytter reaktivitet og spredning in Vitro Under iskemiske-lignende forhold

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analysere Dendritic Morfologi i kolonner og Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Real-time Iontophoresis med tetrametylammonium for å kvantifisere volumfraksjon og tortuositet i hjernens ekstracellulære rom

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Bestemmelse av eksponering av celloverflate og endocytisk proteinprotein i primære astrocytkulturer ved bruk av biotinylering

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

En roman I Vitro Live bildebehandling analysen av astrocytter-mediert fagocytose bruker pH indikator-konjugerte Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Kvantifisere Microglia morfologi Photomicrographs av Immunohistochemistry forberedt Tissue benytter ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...