Name: visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

Os autores agradecem a Sra. Soto, o Dr. Yu, e o Dr. Octeau por orientação, bem como comentários sobre o texto. Este trabalho é apoiado por NS060677.

Os experimentos com animais neste estudo foram realizados de acordo com o guia do Instituto Nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de pesquisa animal do Chanceler da Universidade da Califórnia, Los Angeles. Camundongos adultos (6 − 8 semanas de idade) de gênero misto foram utilizados em todos os experimentos.
1. preparação da solução
<ol><li>
Solução de fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF)
	<ol>
<li>P...

<ol>
	<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits.">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).</li><li>Ben Haim, L., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+astrocytes+in+neural+circuit+regulation.">Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).</li><li>Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+Shapeshifter:+Mechanisms+Allowing+Astrocytes+to+Respond+to+the+Changing+Nervous+System+During+Development,+Injury+and+Disease.">Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Circuit-Specialized+Astrocytes:+Transcriptomic,+Proteomic,+Morphological,+and+Functional+Evidence.">Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Sun, D., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+astrocytes+in+the+injured+CNS.">Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS.</a> Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).</li><li>Naskar, S., Chattarji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Elicits+Contrasting+Effects+on+the+Structure+and+Number+of+Astrocytes+in+the+Amygdala+versus+Hippocampus.">Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus.</a> eNeuro. 6 (1), (2019).</li><li>Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+spatial+arrangement+of+astrocytes+in+the+optic+nerve+head+of+the+mouse.">The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).</li><li>Grosche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+simple+approach+to+determine+astrocyte+territories+in+mouse+neocortex+and+hippocampus.">Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).</li><li>Kaynig, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automatic+reconstruction+of+neuronal+processes+from+electron+microscopy+images.">Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images.</a> Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Wilhelmsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+concept+of+reactive+astrocytes+as+cells+that+remain+within+their+unique+domains+upon+reaction+to+injury.">Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).</li><li>Williams, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-9+regulates+synapse-specific+differentiation+in+the+developing+hippocampus.">Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus.</a> Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Astrocyte+Water+Channel+Aquaporin-4+in+the+Mouse+Brain.">Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain.</a> ASN Neuro. 7 (5), (2015).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).</li><li>Luna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+structural+reactivity+and+plasticity+in+models+of+retinal+detachment.">Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).</li><li>Octeau, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optical+Neuron-Astrocyte+Proximity+Assay+at+Synaptic+Distance+Scales.">An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales.</a> Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).</li><li>Sosunov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+isocortical+and+hippocampal+astrocytes+in+the+human+brain.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).</li><li>Park, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Specificity+and+Coverage+of+hGFAP-CreERT2+[Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc]+Mouse+Line+in+Various+Brain+Regions.">Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions.</a> Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).</li><li>Koeppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Consequences+of+Synapse+Remodeling+Following+Astrocyte-Specific+Regulation+of+Ephrin-B1+in+the+Adult+Hippocampus.">Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).</li><li>Jefferis, G. S., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+and+combinatorial+neuron+labelling.">Sparse and combinatorial neuron labelling.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).</li><li>Lanjakornsiripan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+morphological+and+molecular+differences+in+neocortical+astrocytes+and+their+dependence+on+neuronal+layers.">Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).</li></ol>

O método esboçado neste papel descreve uma maneira de visualizar a morfologia do astrocyte usando o iontoforese intracelular do corante de ly em fatias levemente fixas do cérebro. Existem vários fatores críticos destacados neste protocolo que contribuem para a bem sucedida iontoforese e reconstrução morfológica das células. Um fator é a qualidade e reprodutibilidade das imagens, que é determinada em grande parte pela idade do rato e o resultado da perfusão. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57/BL6N ...

Os astrócitos são as células gliais mais abundantes no sistema nervoso central (SNC). Jogam papéis na homeostase do íon, na regulação do fluxo sanguíneo, na formação do sinapse assim como na eliminação, e na captação1do neurotransmissor. A vasta gama de funções do astrocyte é refletida em sua estrutura morfológica complexa2,3. Os astrócitos contêm vários ramos primários e secundários que se dividem em milhares de branchlets e folhetos mais finos que interagem diretamente com sinapses, dendritos, axônios, vasos sanguíneos e outras células gliais. A morfologia do astrocyte varia em diferentes regiões cerebrais, o que pode sugerir sua capacidade de desempenhar suas funções diferencialmente em circuitos neuronais4. Além disso, os astrócitos são conhecidos por alterarem sua morfologia durante o desenvolvimento, durante as condições fisiológicas, e em múltiplos estados de doença3,5,6.
Um método consistente, reprodutível é necessário para resolver com precisão a complexidade da morfologia do astrocyte. Tradicionalmente, a imunohistoquímica tem sido usada para visualizar os astrócitos com o uso de marcadores de proteínas enriquecidos astrocícitos ou astrocícitos. No entanto, esses métodos revelam o padrão de expressão protéica em vez da estrutura do astrocícito. Os marcadores comumente usados, como a proteína ácida fibrilhante glial (GFAP) e a proteína de ligação de cálcio S100 β (S100β), não expressam em todo o volume celular e, portanto, não resolvem a morfologia completa7. Abordagens genéticas para expressar proteínas fluorescentes onipresente em astrócitos (injeções virais ou linhas de repórter transgênica do mouse) podem identificar os ramos mais finos e o território geral. No entanto, é difícil diferenciar os astrócitos individuais, e as análises podem ser tendenciosas pela população de astrocícitos direcionada pelo promotor específico8. A microscopia de elétron da seção de série foi usada para revelar um retrato detalhado das interações de processos do astrocyte com sinapses. Devido aos milhares de processos de astrocyte em contato com sinapses, atualmente não é possível reconstruir uma célula inteira com essa técnica9, embora isso seja esperado para mudar com o uso de abordagens de aprendizado de máquina para análise de dados.
Neste relato, focamos em um procedimento para caracterizar astrócitos de camundongo usando iontoforese intracelular com corante amarelo de Lúcifer (LY), usando o radiatum de estrato CA1 como exemplo. O método é baseado no trabalho pioneiro passado por Eric Bushong e Mark Ellisman10,11. Os astrocytes de fatias levemente fixas do cérebro são identificados por sua forma distintiva do soma e enchido com o LY. As células são então imaged com microscopia confocal. Nós demonstramos como a iontoforese de ly pode ser usada para reconstruir astrócitos individuais e para executar análises morfológicas detalhadas de seus processos e território. Também, este método pode ser aplicado conjuntamente com immunohistochemistry para identificar relações espaciais e interações entre astrócitos e neurônios, outras pilhas glial, e vasculature do cérebro. Consideramos que a iontoforese é uma ferramenta muito adequada para analisar a morfologia em diferentes regiões cerebrais e modelos de camundongo de condições saudáveis ou de doença7,12,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:995px;" width="994">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">SF 100-20</td>
			<td style="width:240px;">An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:192px;">Pall</td>
			<td style="width:196px;">4692</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ag/AgCl ground pellet</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP2</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti Aquaporin-4 antibody</td>
			<td style="width:192px;">Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-87679</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti GFAP antibody</td>
			<td style="width:192px;">Abcam</td>
			<td style="width:196px;">ab4674</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass pipettes with filament</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6NTac mice</td>
			<td>Taconic Stock</td>
			<td style="width:196px;">B6</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td style="width:192px;">Olympus</td>
			<td style="width:196px;">FV1000MPE</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode puller- Model P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td style="width:196px;">P-97</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:196px;">0100-01</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td>
			<td style="width:192px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>400-10</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris software (Version 7.6.5)</td>
			<td style="width:192px;">Bitplane Inc.</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:192px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)</td>
			<td style="width:192px;">Clipper</td>
			<td>1050035</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:196px;">24X60-1</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">12-544-2</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:192px;">Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (40x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:196px;">LUMPLFLN 40XW</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (60x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanAPO 60X</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS tablets, 100 mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td>VWRVE404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pipette micromanipulator- Model ROE-200</td>
			<td style="width:192px;">Sutter</td>
			<td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulator- Model Omnical 2010</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">Omnical 2010</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">T8787</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome- Model #3000</td>
			<td style="width:192px;">Pelco</td>
			<td style="width:196px;">100-S</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis

Os astrócitos são componentes essenciais dos circuitos neurais. Eles telha todo o sistema nervoso central (CNS) e estão envolvidos em uma variedade de funções, que incluem o afastamento do neurotransmissor, regulação de íons, modulação sináptica, suporte metabólico para neurônios, e regulação do fluxo sanguíneo. Os astrócitos são células complexas que têm um soma, vários ramos principais, e inúmeros processos finos que contatam diversos elementos celulares dentro do neuropil. A fim de avaliar a morfologia dos astrócitos, é necessário ter um método confiável e reprodutível para visualizar sua estrutura. Nós relatamos um protocolo de confiança para executar o iontoforese intracelular dos astrócitos usando a tintura fluorescente do amarelo de Lúcifer (ly) no tecido levemente fixo do cérebro dos ratos adultos. Este método tem diversas características que são úteis caracterizar a morfologia do astrocyte. Permite a reconstrução tridimensional de astrócitos individuais, o que é útil para realizar análises morfológicas em diferentes aspectos de sua estrutura. Immunohistochemistry junto com o iontoforese de ly pode igualmente ser utilizado para compreender a interação dos astrócitos com componentes diferentes do sistema nervoso e para avaliar a expressão das proteínas dentro dos astrócitos etiquetados. Este protocolo pode ser executado em uma variedade de modelos do rato de desordens do CNS para examinar rigorosa a morfologia do astrocyte com microscopia de luz. A iontoforese de LY fornece uma aproximação experimental para avaliar a estrutura do astrocyte, especial no contexto da lesão ou da doença onde estas pilhas são propor para submeter-se a mudanças morfológicas significativas.

Os dados relatados neste estudo são de 7 − 12 células de 4 camundongos em cada experimento. Os dados médios são relatados nos painéis de figura, quando apropriado.
Para avaliar a morfologia do astrocite, realizou-se iontoforese intracelular com corante LY para preenchimento de astrócitos no estrato de CA1 radiatum, que está resumido na Figura 1. A Figura 2 retrata um astrocite representativo e sua elaborada estrutura morfológica. A célu...

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Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Os astrócitos são células morfologicamente complexas, exemplificadas por seus múltiplos processos e territórios Bushy. Para analisar sua morfologia elaborada, apresentamos um protocolo confiável para a realização de iontoforese intracelular de Lúcifer amarelo em tecido levemente fixo.

Visualizando morfologia Astrocitante usando Lúcifer iontoforese amarela

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Este método pode ser usado para facilitar a visualização de processos muito finos de astrócitos para a avaliação de interações neuronais de astrócitos na sinapse durante a doença e estados estáveis. Essa técnica também pode ser aplicada em qualquer modelo de camundongo, população celular ou região cerebral. Para preparar um eletrodo afiado com uma resistência apropriada, puxe um eletrodo de cano único de vidro borossilicato com um filamento em um puxador de micropipette.Armazene os eletrodos puxados em um recipiente fechado para evitar que a poeira entre nas pontas e mantenha os eletrodos elevados da parte inferior da caixa para evitar que as pontas quebrem. Para encher um eletrodo com solução de corante amarelo lúcifer, coloque um eletrodo na posição vertical com a ponta voltada para baixo, e pipeta de um a dois microliters de solução amarela de lúcifer na parte de trás do eletrodo. Aguarde de cinco a 10 minutos para que a solução se mova para a ponta via ação capilar antes de fixar suavemente o eletrodo preenchido em um suporte de eletrodo conectado a um manipulador com o fio de prata do porta-eletrodos em contato com o amarelo lúcifer dentro do eletrodo.Para o teste de ejeção de corante, coloque delicadamente uma fatia cerebral levemente fixa em um prato de fundo de vidro preenchido com PBS molar de 0,1 a temperatura ambiente e mantenha a fatia no lugar com uma harpa de platina com cordas de nylon. Conecte o eletrodo a uma fonte de tensão e coloque o eletrodo moído no banho contendo a fatia cerebral. Mova o objetivo de um microscópio confocal para a região de interesse do cérebro e baixe o eletrodo para a solução usando a lente de imersão de água 10X, movendo o eletrodo para o centro do campo de visão.Sob iluminação de campo brilhante, examine o eletrodo cuidadosamente com a lente de imersão de água 40X para garantir que o eletrodo apareça limpo e sem detritos ou bolhas. Mude para microscopia de varredura a laser confocal com um laser de 488 nanômetros. Ligue o estimulador a 12 volts para testar a ejeção de corante.Uma grande nuvem de corante fluorescente deve ser visível ao redor da ponta do eletrodo. Em seguida, sob campo brilhante lentamente abaixe o eletrodo em direção à fatia, parando logo acima da superfície. Para preencher um astrócito de interesse com iontopforese, use o contraste de interferência diferencial infravermelha para identificar astrócitos com somata em forma oval alongada de cerca de 10 micrômetros de diâmetro, 40 a 50 micrômetros abaixo da superfície da fatia.Este é o radiador estrato do hipocampo diretamente abaixo da camada celular piramiada. À medida que nos movemos através do tecido, podemos ver vasos sanguíneos, neurônios, astrócitos e outros tipos de células. Uma vez que um astrócito tenha sido selecionado, mova a célula para o centro do campo de visão e baixe lentamente a ponta do eletrodo na fatia, navegando através do tecido até que o eletrodo esteja na mesma planície que o corpo celular.Uma vez que o corpo celular do astrócito esteja claramente visível e delineado, devagar e suavemente avance o eletrodo para a frente, movendo o eletrodo até que a ponta empala a soma da célula. Mova o foco do objetivo lentamente para cima e para baixo para notar se o eletrodo está dentro da soma. Uma vez que a ponta do eletrodo esteja dentro da célula, ligue o estimulador a 0,5 a um volts para ejetar continuamente a corrente na célula.Usando o microscópio confocal, observe a película celular, aumentando o zoom digital para visualizar os detalhes da célula e para garantir que a ponta do eletrodo seja visível dentro da célula, conforme necessário. Aguarde cerca de 15 minutos até que os ramos e processos mais finos pareçam definidos antes de desligar a tensão e retirar suavemente a ponta do eletrodo da célula. Para imaginar a célula preenchida, aguarde de 15 a 20 minutos para que a célula retorne à sua forma original antes de ajustar a configuração do microscópio confocal para garantir que as ramificações e processos mais finos apareçam definidos sob o objetivo de 40X.Configure uma pilha Z com um tamanho de passo de 0,3 micrômetros, movendo o objetivo durante a imagem até que não haja sinal da célula e defina esse passo como o topo. Em seguida, mova o objetivo para baixo, focando através da célula até que não haja sinal e definir esse passo como o fundo. Após a imagem ser concluída, verifique se o eletrodo é ejeção de corante.Se aparecer uma grande nuvem de corante, o eletrodo pode ser usado para a próxima fatia. Caso contrário, substitua o eletrodo. Ao gerar uma projeção de intensidade máxima, uma visão detalhada da estrutura de um astrócito em seu domínio pode ser observada.Um zoom de magnitude X de quatro X no astrócito revela uma projeção de intensidade máxima de um ramo principal, vários ramos secundários, e a distribuição das ramificações e folhetos circundantes. Aqui, a imagem original de um astrócito CA1 é mostrada. O corpo celular, os principais ramos, processos e o volume de território fechados pelo astrócito são reconstruídos nessas imagens subsequentes.Após a criação das reconstruções, os volumes da soma, célula inteira e território foram quantificados. E o número de grandes filiais foi contado. Como a proteína citoesquelético que rotula filamentos de astrócitos intermediários é expressa na soma celular, ramos principais e alguns ramos de astrócito secundários, mas não nos ramos e processos mais finos.Nesta análise representativa, não foram encontradas diferenças significativas no número de ramos primários rotulados por proteína ácida fibrilar gliana e aquelas visualizadas por amarelo lúcifer. Além disso, a área celular e o volume do astrócito rotulado por proteína ácida fibrilar glial foram significativamente menores do que a área e o volume visualizado com amarelo lúcifer, demonstrando que a proteína ácida fibrilar gliana é um marcador confiável para rotular os principais ramos, mas não é útil para determinar a área geral ou o volume da célula. A quantidade de corante liberada da ponta do eletrodo depende da resistência ao eletrodo que deve ser alta o suficiente para permitir que um fluxo constante de corante seja ejetado.Estudos futuros podem examinar os diferentes componentes da estrutura de astrócitos por microscopia leve de super resolução ou por análise imunohistoquímica da expressão de proteínas específicas dentro da estrutura de astrócito.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Visualizar os Efeitos de uma experiência precoce positiva, Tátil Estimulação, em dendríticas Morfologia e Synaptic conectividade com Golgi-Cox Coloração

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Neurociência

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoramento de Astrocyte de reatividade e proliferação in Vitro sob condições isquêmicas

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analisando dendríticas Morfologia em Colunas e Camadas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Itoforese em tempo real com tetrametilamônio para quantificar fração de volume e tortuosidade do espaço extracelular cerebral

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Um romance imagens Live In Vitro e fagocitose mediada por ensaio de Astrocyte usando pH sinaptossomas conjugada com indicador

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Quantificar a Microglia morfologia de fotomicrografias de imuno-histoquímica preparado tecido usando o ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...