Name: visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

Авторы благодарят г-жу Сото, д-ра Yu и д-ра Октко за рекомендации, а также за комментарии к тексту. Эта работа поддерживается NS060677.

Эксперименты на животных в этом исследовании были проведены в соответствии с Национальным институтом здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по исследованиям животных канцлера в Университете Калифорнии, Лос-Анджелес. Взр...

<ol>
	<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits.">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).</li><li>Ben Haim, L., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+astrocytes+in+neural+circuit+regulation.">Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).</li><li>Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+Shapeshifter:+Mechanisms+Allowing+Astrocytes+to+Respond+to+the+Changing+Nervous+System+During+Development,+Injury+and+Disease.">Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Circuit-Specialized+Astrocytes:+Transcriptomic,+Proteomic,+Morphological,+and+Functional+Evidence.">Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Sun, D., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+astrocytes+in+the+injured+CNS.">Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS.</a> Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).</li><li>Naskar, S., Chattarji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Elicits+Contrasting+Effects+on+the+Structure+and+Number+of+Astrocytes+in+the+Amygdala+versus+Hippocampus.">Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus.</a> eNeuro. 6 (1), (2019).</li><li>Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+spatial+arrangement+of+astrocytes+in+the+optic+nerve+head+of+the+mouse.">The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).</li><li>Grosche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+simple+approach+to+determine+astrocyte+territories+in+mouse+neocortex+and+hippocampus.">Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).</li><li>Kaynig, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automatic+reconstruction+of+neuronal+processes+from+electron+microscopy+images.">Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images.</a> Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Wilhelmsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+concept+of+reactive+astrocytes+as+cells+that+remain+within+their+unique+domains+upon+reaction+to+injury.">Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).</li><li>Williams, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-9+regulates+synapse-specific+differentiation+in+the+developing+hippocampus.">Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus.</a> Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Astrocyte+Water+Channel+Aquaporin-4+in+the+Mouse+Brain.">Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain.</a> ASN Neuro. 7 (5), (2015).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).</li><li>Luna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+structural+reactivity+and+plasticity+in+models+of+retinal+detachment.">Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).</li><li>Octeau, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optical+Neuron-Astrocyte+Proximity+Assay+at+Synaptic+Distance+Scales.">An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales.</a> Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).</li><li>Sosunov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+isocortical+and+hippocampal+astrocytes+in+the+human+brain.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).</li><li>Park, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Specificity+and+Coverage+of+hGFAP-CreERT2+[Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc]+Mouse+Line+in+Various+Brain+Regions.">Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions.</a> Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).</li><li>Koeppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Consequences+of+Synapse+Remodeling+Following+Astrocyte-Specific+Regulation+of+Ephrin-B1+in+the+Adult+Hippocampus.">Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).</li><li>Jefferis, G. S., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+and+combinatorial+neuron+labelling.">Sparse and combinatorial neuron labelling.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).</li><li>Lanjakornsiripan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+morphological+and+molecular+differences+in+neocortical+astrocytes+and+their+dependence+on+neuronal+layers.">Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).</li></ol>

Метод, изложенный в настоящей статье, описывает способ визуализации морфологии астроцитов с помощью внутриклеточного ионтофореза ЛАЙ-красителя в слегка фиксированных ломтиках мозга. Есть несколько критических факторов, отмеченных в этом протоколе, которые способствуют успешной ион?...

Астроциты являются наиболее распространенными глиальными клетками в центральной нервной системе (ЦНС). Они играют роль в ионного гомеостаза, регуляции кровотока, формирования синапсов, а также ликвидации, и поглощение нейромедиатора1. Широкий спектр функций астроцитов отражается в их сложной морфологической структуре2,3. Астроциты содержат несколько первичных и вторичных ветвей, которые делятся на тысячи тонких ветвей и листовок, которые непосредственно взаимодействуют с синапсами, дендритами, аксонами, кровеносными сосудами и другими глиальными клетками. Морфология астроцитов варьируется в разных областях мозга, что может намекать на их способность выполнять свои функции дифференцированным в нейронных цепях4. Кроме того, астроциты, как известно, изменить свою морфологию во время развития, во время физиологических условий, и в нескольких состояниях болезни3,5,6.
Для точного решения сложности морфологии астроцитов необходим последовательный, воспроизводимый метод. Традиционно, иммуногистохимия была использована для визуализации астроцитов с использованием астроцитов конкретных или астроцитов обогащенных маркеров белка. Тем не менее, эти методы показывают структуру экспрессии белка, а не структуру астроцитов. Широко используемые маркеры, такие как глиальный фибриллюкислый кислотный белок (GFAP) и S100 кальций связывающий белок (S100), не выражаются во всем объеме клеток и, таким образом, не разрешают полную морфологию7. Генетические подходы к экспрессу флуоресцентных белков повсеместно в астроцитах (вирусные инъекции или трансгенные линии репортера мыши) могут определить более тонкие ветви и общую территорию. Тем не менее, трудно дифференцировать отдельные астроциты, и анализы могут быть предвзятыми по популяции астроцитов, мишенью для конкретногопромоутера 8. Для выявления детальной картины взаимодействия астроцитных процессов с синапсами используется серийная электронная микроскопия. Из-за тысяч астроцитов процессов контакта синапсов, в настоящее время не представляется возможным реконструировать всю ячейку с этой техникой9, хотя это, как ожидается, изменится с использованием машинного обучения подходов для анализа данных.
В этом отчете мы сосредоточиваемся на процедуре характеристики астроцитов мыши с использованием внутриклеточного ионтофорасиса с желтым (LY) красителем Люцифера, используя радиат слоя CA1 в качестве примера. Метод основан на новаторской прошлой работе Эрикbus и Марк Эллисман10,11. Астроциты из слегка фиксированных ломтиков мозга идентифицируются по их отличительной форме сомы и заполнены LY. Клетки затем изображены с конфокальной микроскопией. Мы демонстрируем, как ионтофорес LY может быть использован для реконструкции отдельных астроцитов и проведения детального морфологического анализа их процессов и территории. Кроме того, этот метод может быть применен в сочетании с иммуногистохимии для выявления пространственных связей и взаимодействий между астроцитами и нейронами, другими глиальными клетками и сосудами мозга. Мы считаем, LY ионтофорез, чтобы быть очень подходящим инструментом для анализа морфологии в различных областях мозга и мыши модели здоровых или заболеваний условия7,12,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:995px;" width="994">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">SF 100-20</td>
			<td style="width:240px;">An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:192px;">Pall</td>
			<td style="width:196px;">4692</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ag/AgCl ground pellet</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP2</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti Aquaporin-4 antibody</td>
			<td style="width:192px;">Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-87679</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti GFAP antibody</td>
			<td style="width:192px;">Abcam</td>
			<td style="width:196px;">ab4674</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass pipettes with filament</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6NTac mice</td>
			<td>Taconic Stock</td>
			<td style="width:196px;">B6</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td style="width:192px;">Olympus</td>
			<td style="width:196px;">FV1000MPE</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode puller- Model P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td style="width:196px;">P-97</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:196px;">0100-01</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td>
			<td style="width:192px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>400-10</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris software (Version 7.6.5)</td>
			<td style="width:192px;">Bitplane Inc.</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:192px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)</td>
			<td style="width:192px;">Clipper</td>
			<td>1050035</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:196px;">24X60-1</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">12-544-2</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:192px;">Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (40x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:196px;">LUMPLFLN 40XW</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (60x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanAPO 60X</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS tablets, 100 mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td>VWRVE404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pipette micromanipulator- Model ROE-200</td>
			<td style="width:192px;">Sutter</td>
			<td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulator- Model Omnical 2010</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">Omnical 2010</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">T8787</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome- Model #3000</td>
			<td style="width:192px;">Pelco</td>
			<td style="width:196px;">100-S</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis

Астроциты являются важнейшими компонентами нейронных цепей. Они плитки всей центральной нервной системы (ЦНС) и участвуют в различных функций, которые включают нейромедиатор зазор, ионная регуляция, синаптической модуляции, метаболической поддержки нейронов, и регулирование кровотока. Астроциты являются сложными клетками, которые имеют сома, несколько крупных ветвей, и многочисленные тонкие процессы, которые контактируют с различными клеточными элементами в нейропиле. Для того, чтобы оценить морфологию астроцитов, необходимо иметь надежный и воспроизводимый метод визуализации их структуры. Мы сообщаем о надежном протоколе для выполнения внутриклеточного ионтофореза астроцитов с использованием флуоресцентного желтого (LY) красителя Люцифера в слегка фиксированной ткани мозга от взрослых мышей. Этот метод имеет несколько особенностей, которые полезны для характеристики морфологии астроцитов. Это позволяет трехмерную реконструкцию отдельных астроцитов, что полезно для проведения морфологического анализа по различным аспектам их структуры. Иммуногистохимия вместе с ионтофорусом LY также может быть использована для понимания взаимодействия астроцитов с различными компонентами нервной системы и для оценки экспрессии белков в обозначенных астроцитах. Этот протокол может быть реализован в различных моделях мыши расстройств ЦНС для тщательного изучения морфологии астроцитов с помощью световой микроскопии. Ионтофорез LY обеспечивает экспериментальный подход к оценке структуры астроцитов, особенно в контексте травмы или болезни, где эти клетки предлагается претерпеть значительные морфологические изменения.

Данные, представленные в этом исследовании, от 7 до 12 клеток от 4 мышей в каждом эксперименте. Средние данные регистрируются в группах цифр, где это уместно.
Для оценки морфологии астроцитов мы провели внутриклеточный ионтофорус с помощью LY красителя для заполнения астроц...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Астроциты являются морфологически сложными клетками, о чем свидетельствует их многочисленные процессы и густые территории. Для анализа их сложной морфологии мы представляем надежный протокол для выполнения внутриклеточного люцифера желтого ионтофореза в слегка фиксированной ткани.

Визуализация морфологии астроцитов с использованием люцифера желтого ионтофореза

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Этот метод может быть использован для облегчения визуализации очень тонких процессов астроцитов для оценки астроцитов нейрональных взаимодействий при синапсе во время болезни и устойчивых состояний. Этот метод также может быть применен в любой модели мыши, популяции клеток или области мозга. Чтобы подготовить острый электрод с соответствующим сопротивлением, потяните борозиликатное стекло одноствольного электрода с нитью на шкиве микропайпта.Храните вытащил электродов в закрытом контейнере, чтобы предотвратить пыль от входа в советы и держать электроды подняты со дна коробки, чтобы предотвратить советы от разрушения. Чтобы заполнить электрод раствором люцифера желтого красителя, поместите электрод в вертикальное положение с наконечником вниз, и пипетку от одного до двух микролитров люцифера желтого раствора в задней части электрода. Подождите от пяти до 10 минут для решения, чтобы перейти к кончику через капиллярное действие, прежде чем мягко обеспечения заполнены электрода в держатель электрода подключен к манипулятору с серебряной проволокой держатель электрода в контакте с люцифера желтый внутри электрода.Для теста на выброс красителя аккуратно поместите слегка фиксированный ломтик мозга в стеклянную нижнюю тарелку, наполненную 0,1 молярным PBS при комнатной температуре, и удерживайте ломтик на месте с платиновой арфой с нейлоновыми струнами. Подключите электрод к источнику напряжения и поместите наземный электрод в ванну, содержащую срез мозга. Переместите цель конфокального микроскопа в область интереса мозга и опустите электрод в раствор с помощью объектива погружения воды 10X, перемещая электрод в центр поля зрения.При ярко-полевом освещении внимательно изучите электрод с помощью объектива погружения в воду 40X, чтобы электрод был ясным и без мусора или пузырьков. Переключитесь на конфокальные лазерные сканирующие микроскопии с помощью 488-нанометрового лазера. Включите стимулятор на 12 вольт, чтобы проверить выброс красителя.Вокруг кончика электрода должно быть видно большое облако флуоресцентного красителя. Затем, под ярким полем медленно опустите электрод к ломтику, останавливаясь чуть выше поверхности. Чтобы заполнить астроцит, представляющий интерес, ионтофорезом, используйте инфракрасный дифференциальный интерференционный контраст для идентификации астроцитов с удлиненной овальной соматой диаметром около 10 микрометров, на 40-50 микрометров ниже поверхности среза.Это слой излучения гиппокампа непосредственно под слоем пирамидальных клеток. По мере того как мы двигаем через ткань, мы можем увидеть кровеносные сосуды, нейроны, астроциты, и другие типы клетки. После того, как астроцит был выбран, переместить клетку в центр поля зрения и медленно опустите кончик электрода в ломтик, навигация по ткани, пока электрод находится на той же равнине, как тело клетки.Как только клеточное тело астроцита хорошо видно и обрисовано, медленно и осторожно продвигает электрод вперед, перемещая электрод до тех пор, пока кончик не пронзит сому клетки. Перемещение фокус цели медленно вверх и вниз, чтобы отметить, если электрод находится внутри сомы. Как только кончик электрода находится внутри клетки, включите стимулятор на 0,5 к одному вольту, чтобы непрерывно выбрасывать ток в клетку.Используя конфокальный микроскоп, наблюдайте за пленкой клетки, увеличивая цифровой зум, чтобы визуализировать детали клетки и убедиться, что кончик электрода виден внутри клетки по мере необходимости. Подождите около 15 минут, пока не появятся более тонкие ветви и процессы, прежде чем выключить напряжение и аккуратно вывести кончик электрода из клетки. Чтобы изображение заполненной ячейки, подождите от 15 до 20 минут для ячейки, чтобы вернуться к своей первоначальной форме, прежде чем настроить настройки на конфокальный микроскоп, чтобы убедиться, что тонкие ветви и процессы появляются определены в соответствии с целью 40X.Настройка стека q с размером шага 0,3 микрометра, перемещение цели во время изображения до тех пор, пока нет сигнала от ячейки и установить этот шаг в качестве верхней. Затем смести цель вниз, фокусировка через ячейку, пока нет сигнала и установить этот шаг в качестве дна. После завершения визуализации проверьте электрод на выброс красителя.Если появляется большое облако красителя, электрод может быть использован для следующего среза. В противном случае замените электрод. Создавая проекцию максимальной интенсивности, можно наблюдать детальное представление о структуре астроцита в его домене.ЧетырехМ величина X зум в астроцит показывает максимальную интенсивность проекции одной крупной ветви, несколько вторичных ветвей, а также распределение окружающих ветвей и листовок. Здесь показано исходное изображение астроцита CA1. В этих последующих изображениях реконструируются клеточное тело, основные ветви, процессы и объем территории, окруженный астроцитом.После того, как были созданы реконструкции, были количественно оценены объемы сомы, всей ячейки и территории. И количество крупных филиалов было подсчитано. Как цитоскелетный белок, который маркирует промежуточные нити астроцитов выражается в клеточной соме, основных ветвях и некоторых вторичных ветвях астроцитов, но не в более тонких ветвях и процессах.В этом репрезентативном анализе не было обнаружено существенных различий в количестве первичных ветвей, помеченных глиальным фибриллярдным кислым белком, и в тех, которые визуализированы люцифер-желтым цветом. Кроме того, площадь клеток и объем астроцита, помеченного глиальным фибриллярным кислым белком, были значительно меньше площади и объема, визуализированы люциферным желтым цветом, что продемонстрировано, что глиальный фибриллярный кислый белок является надежным маркером для маркировки основных ветвей, но не полезен для определения общей площади или объема клетки. Количество красителя, высвобождаемого из наконечника электрода, зависит от сопротивления электрода, которое должно быть достаточно высоким, чтобы можно было выбрасывать устойчивый поток красителя.Будущие исследования могут исследовать различные компоненты структуры астроцитов с помощью световой микроскопии супер разрешения или иммуногистохимического анализа экспрессии конкретных белков в структуре астроцитов.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Визуализация Эффекты положительного ранний опыт, тактильная стимуляция, на дендритных морфологии и синаптические связи с Гольджи-Кокса Окрашивание

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Непрямой Нейрон-астроцитов Анализ Совместное культивирование:<em&gt; In Vitro</em&gt; Настройка для детального исследования Нейрон-глии взаимодействий

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Мониторинг экзоцитоз реактивности и распространения в Vitro условиях ишемии как

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Анализ Дендритные Морфология в столбцах и слоях

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Ионтофорез в реальном времени с тетраметиламмонием для количественного определения объемной доли и торможности внеклеточного пространства мозга

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Определение экспрессии клеточной поверхности и эндоцитарной скорости белков в культурах первичных астроцитов с использованием биотинилирования

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Роман В Vitro Live изображений Assay экзоцитоз-опосредованной с помощью фагоцитоза pH индикатор конъюгированных синаптосомах

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Количественное определение морфологии микроглии от микрофотографиями иммуногистохимия подготовлен с использованием ImageJ ткани

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...