Name: visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00
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Los autores agradecen a la Sra. Soto, al Dr. Yu y al Dr. Octeau por su orientación, así como por sus comentarios sobre el texto. Este trabajo es compatible con NS060677.

Los experimentos con animales en este estudio se realizaron de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal del Canciller en la Universidad de California, Los Angeles. En todos los experimentos se utilizaron ratones adultos (6 a 8 semanas de edad) de género mixto.
1. Preparación de la solución
<ol><li>
Solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF)...

<ol>
	<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits.">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).</li><li>Ben Haim, L., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+astrocytes+in+neural+circuit+regulation.">Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).</li><li>Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+Shapeshifter:+Mechanisms+Allowing+Astrocytes+to+Respond+to+the+Changing+Nervous+System+During+Development,+Injury+and+Disease.">Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Circuit-Specialized+Astrocytes:+Transcriptomic,+Proteomic,+Morphological,+and+Functional+Evidence.">Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Sun, D., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+astrocytes+in+the+injured+CNS.">Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS.</a> Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).</li><li>Naskar, S., Chattarji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Elicits+Contrasting+Effects+on+the+Structure+and+Number+of+Astrocytes+in+the+Amygdala+versus+Hippocampus.">Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus.</a> eNeuro. 6 (1), (2019).</li><li>Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+spatial+arrangement+of+astrocytes+in+the+optic+nerve+head+of+the+mouse.">The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).</li><li>Grosche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+simple+approach+to+determine+astrocyte+territories+in+mouse+neocortex+and+hippocampus.">Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).</li><li>Kaynig, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automatic+reconstruction+of+neuronal+processes+from+electron+microscopy+images.">Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images.</a> Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Wilhelmsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+concept+of+reactive+astrocytes+as+cells+that+remain+within+their+unique+domains+upon+reaction+to+injury.">Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).</li><li>Williams, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-9+regulates+synapse-specific+differentiation+in+the+developing+hippocampus.">Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus.</a> Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Astrocyte+Water+Channel+Aquaporin-4+in+the+Mouse+Brain.">Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain.</a> ASN Neuro. 7 (5), (2015).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).</li><li>Luna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+structural+reactivity+and+plasticity+in+models+of+retinal+detachment.">Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).</li><li>Octeau, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optical+Neuron-Astrocyte+Proximity+Assay+at+Synaptic+Distance+Scales.">An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales.</a> Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).</li><li>Sosunov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+isocortical+and+hippocampal+astrocytes+in+the+human+brain.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).</li><li>Park, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Specificity+and+Coverage+of+hGFAP-CreERT2+[Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc]+Mouse+Line+in+Various+Brain+Regions.">Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions.</a> Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).</li><li>Koeppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Consequences+of+Synapse+Remodeling+Following+Astrocyte-Specific+Regulation+of+Ephrin-B1+in+the+Adult+Hippocampus.">Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).</li><li>Jefferis, G. S., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+and+combinatorial+neuron+labelling.">Sparse and combinatorial neuron labelling.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).</li><li>Lanjakornsiripan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+morphological+and+molecular+differences+in+neocortical+astrocytes+and+their+dependence+on+neuronal+layers.">Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).</li></ol>

El método descrito en este artículo describe una manera de visualizar la morfología de los astrocitos utilizando la iontoforesis intracelular del tinte LY en rebanadas cerebrales ligeramente fijas. Hay varios factores críticos destacados en este protocolo que contribuyen al éxito de la iontoforesis LY y la reconstrucción morfológica de las células. Un factor es la calidad y reproducibilidad de las imágenes, que se determina en gran medida por la edad del ratón y el resultado de la perfusión. En este estudio, u...

Los astrocitos son las células gliales más abundantes en el sistema nervioso central (SNC). Juegan papeles en la homeostasis iónial, regulación del flujo sanguíneo, formación de sinapsis, así como la eliminación, y la aceptación de neurotransmisores1. La amplia gama de funciones astrocitos se refleja en su compleja estructura morfológica2,3. Los astrocitos contienen varias ramas primarias y secundarias que se dividen en miles de ramitas y foliolos más finos que interactúan directamente con sinapsis, dendritas, axones, vasos sanguíneos y otras células gliales. La morfología de los astrocitos varía según las diferentes regiones cerebrales, lo que puede insinuar su capacidad para realizar sus funciones diferencialmente en los circuitos neuronales4. Además, se sabe que los astrocitos alteran su morfología durante el desarrollo, durante las condiciones fisiológicas, y en múltiples estados de enfermedad3,5,6.
Se necesita un método consistente y reproducible para resolver con precisión la complejidad de la morfología de los astrocitos. Tradicionalmente, la inmunohistoquímica se ha utilizado para visualizar astrocitos con el uso de marcadores de proteínas específicas de astrocitos o enriquecidos con astrocitos. Sin embargo, estos métodos revelan el patrón de expresión de proteínas en lugar de la estructura del astrocito. Los marcadores de uso común, como la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y la proteína de unión al calcio S100 (S100), no se expresan en todo el volumen celular y, por lo tanto, no resuelven la morfología completa7. Los enfoques genéticos para expresar las proteínas fluorescentes de forma omnipresente en los astrocitos (inyecciones virales o líneas de reporteros de ratones transgénicos) pueden identificar las ramas más finas y el territorio en general. Sin embargo, es difícil diferenciar los astrocitos individuales, y los análisis pueden ser sesgados por la población de astrocitos a los que apunta el promotor específico8. La microscopía electrónica de sección serial se ha utilizado para revelar una imagen detallada de las interacciones de los procesos de astrocitos con sinapsis. Debido a los miles de procesos de astrocitos que contactan con sinapsis, actualmente no es posible reconstruir una célula entera con esta técnica9,aunque se espera que esto cambie con el uso de enfoques de aprendizaje automático para el análisis de datos.
En este informe, nos centramos en un procedimiento para caracterizar los astrocitos de ratón utilizando la iontoforesis intracelular con el tinte amarillo Lucifer (LY), utilizando como ejemplo el radiatum de estrato CA1. El método se basa en trabajos pasados pioneros de Eric Bushong y Mark Ellisman10,11. Los astrocitos de las rebanadas cerebrales ligeramente fijas se identifican por su forma distintiva de soma y se llenan de LY. A continuación, las células se imagee con microscopía confocal. Demostramos cómo la iontoforesis LY se puede utilizar para reconstruir astrocitos individuales y realizar análisis morfológicos detallados de sus procesos y territorio. Además, este método se puede aplicar junto con la inmunohistoquímica para identificar las relaciones espaciales y las interacciones entre astrocitos y neuronas, otras células gliales y vasculatura cerebral. Consideramos QUE LA iontoforesis LY es una herramienta muy adecuada para analizar la morfología en diferentes regiones cerebrales y modelos de ratón de condiciones saludables o de enfermedad7,12,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:995px;" width="994">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">SF 100-20</td>
			<td style="width:240px;">An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:192px;">Pall</td>
			<td style="width:196px;">4692</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ag/AgCl ground pellet</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP2</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti Aquaporin-4 antibody</td>
			<td style="width:192px;">Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-87679</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti GFAP antibody</td>
			<td style="width:192px;">Abcam</td>
			<td style="width:196px;">ab4674</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass pipettes with filament</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6NTac mice</td>
			<td>Taconic Stock</td>
			<td style="width:196px;">B6</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td style="width:192px;">Olympus</td>
			<td style="width:196px;">FV1000MPE</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode puller- Model P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td style="width:196px;">P-97</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:196px;">0100-01</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td>
			<td style="width:192px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>400-10</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris software (Version 7.6.5)</td>
			<td style="width:192px;">Bitplane Inc.</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:192px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)</td>
			<td style="width:192px;">Clipper</td>
			<td>1050035</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:196px;">24X60-1</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">12-544-2</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:192px;">Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (40x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:196px;">LUMPLFLN 40XW</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (60x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanAPO 60X</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS tablets, 100 mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td>VWRVE404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pipette micromanipulator- Model ROE-200</td>
			<td style="width:192px;">Sutter</td>
			<td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulator- Model Omnical 2010</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">Omnical 2010</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">T8787</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome- Model #3000</td>
			<td style="width:192px;">Pelco</td>
			<td style="width:196px;">100-S</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis

Los astrocitos son componentes esenciales de los circuitos neuronales. Azulejon todo el sistema nervioso central (SNC) y están involucrados en una variedad de funciones, que incluyen aclaramiento de neurotransmisores, regulación iónica, modulación sináptica, apoyo metabólico a las neuronas, y regulación del flujo sanguíneo. Los astrocitos son células complejas que tienen un soma, varias ramas principales y numerosos procesos finos que contactan diversos elementos celulares dentro del neuropil. Para evaluar la morfología de los astrocitos, es necesario disponer de un método fiable y reproducible para visualizar su estructura. Reportamos un protocolo confiable para realizar la iontoforesis intracelular de astrocitos usando el tinte fluorescente amarillo Lucifer (LY) en tejido cerebral ligeramente fijo de ratones adultos. Este método tiene varias características que son útiles para caracterizar la morfología de los astrocitos. Permite la reconstrucción tridimensional de astrocitos individuales, lo que es útil para realizar análisis morfológicos sobre diferentes aspectos de su estructura. La inmunohistoquímica junto con la iontoforesis LY también se puede utilizar para entender la interacción de los astrocitos con diferentes componentes del sistema nervioso y para evaluar la expresión de proteínas dentro de los astrocitos etiquetados. Este protocolo se puede implementar en una variedad de modelos de ratón de trastornos del SNC para examinar rigurosamente la morfología de los astrocitos con microscopía ligera. La iontoforesis LY proporciona un enfoque experimental para evaluar la estructura de los astrocitos, especialmente en el contexto de lesiones o enfermedades en las que se propone que estas células se sometan a cambios morfológicos significativos.

Los datos reportados en este estudio provienen de 7 a 12 células de 4 ratones en cada experimento. Los datos medios se indican en los paneles de figuras cuando proceda.
Para evaluar la morfología de los astrocitos, realizamos iontoforesis intracelular utilizando el tinte LY para rellenar los astrocitos en el estrato radiatón CA1, que se resume en la Figura 1. La Figura 2 representa un astrocito representativo y su elaborada estructura morfológ...

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Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Los astrocitos son células morfológicamente complejas, ejemplificadas por sus múltiples procesos y territorios tupidos. Para analizar su elaborada morfología, presentamos un protocolo fiable para realizar la iontoforesis amarilla de Lucifer intracelular en tejido ligeramente fijo.

Visualización de la morfología de los astrocitos usando la iontoforesis amarilla de Lucifer

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Este método se puede utilizar para facilitar la visualización de procesos de astrocitos muy finos para la evaluación de interacciones neuronales de astrocitos en la sinapsis durante la enfermedad y estados estables. Esta técnica también se puede aplicar en cualquier modelo de ratón, población celular o región cerebral. Para preparar un electrodo afilado con una resistencia adecuada, tire de un electrodo de barril único de vidrio borosilicato con un filamento en un tirador de micropipetas.Guarde los electrodos tirados en un recipiente cerrado para evitar que el polvo entre en las puntas y mantenga los electrodos elevados desde la parte inferior de la caja para evitar que las puntas se rompan. Para llenar un electrodo con solución de tinte amarillo lucifer, coloque un electrodo en la posición vertical con la punta hacia abajo, y pipetee de uno a dos microlitros de solución amarilla lucifer en la parte posterior del electrodo. Espere de cinco a 10 minutos para que la solución se mueva a la punta a través de la acción capilar antes de asegurar suavemente el electrodo lleno en un soporte de electrodo conectado a un manipulador con el cable de plata del soporte del electrodo en contacto con el amarillo lucifer dentro del electrodo.Para la prueba de eyección de tinte, coloque suavemente una rebanada de cerebro ligeramente fija en un plato de fondo de vidrio lleno de 0.1 MOLar PBS a temperatura ambiente y mantenga la rebanada en su lugar con un arpa de platino con cuerdas de nylon. Conecte el electrodo a una fuente de tensión y coloque el electrodo de tierra en el baño que contiene la rebanada cerebral. Mueva el objetivo de un microscopio confocal a la región cerebral de interés y baje el electrodo a la solución utilizando la lente de inmersión de agua 10X, moviendo el electrodo al centro del campo de visión.Bajo iluminación de campo brillante, examine el electrodo cuidadosamente con la lente de inmersión en agua 40X para asegurarse de que el electrodo parezca transparente y sin residuos ni burbujas. Cambie a la microscopía de escaneo láser confocal con un láser de 488 nanómetros. Encienda el estimulador a 12 voltios para probar la eyección del tinte.Una gran nube de colorante fluorescente debe ser visible alrededor de la punta del electrodo. Luego, debajo del campo brillante, baje lentamente el electrodo hacia la rebanada, deteniéndose justo por encima de la superficie. Para llenar un astrocito de interés con iontoforesis, utilice el contraste de interferencia diferencial infrarroja para identificar astrocitos con somatas alargadas de forma ovalada de unos 10 micrómetros de diámetro, de 40 a 50 micrómetros por debajo de la superficie de la rebanada.Este es el estrato radiatum del hipocampo directamente debajo de la capa celular piramidal. A medida que nos movemos a través del tejido, podemos ver vasos sanguíneos, neuronas, astrocitos y otros tipos celulares. Una vez que se ha seleccionado un astrocito, mueva la celda al centro del campo de visión y baje lentamente la punta del electrodo en la rebanada, navegando a través del tejido hasta que el electrodo esté en la misma llanura que el cuerpo celular.Una vez que el cuerpo celular del astrocito es claramente visible y esbozado, avance lenta y suavemente el electrodo hacia adelante, moviendo el electrodo hasta que la punta empale el soma de la célula. Mueva el foco del objetivo lentamente hacia arriba y hacia abajo para observar si el electrodo está dentro del soma. Una vez que la punta del electrodo está dentro de la célula, encienda el estimulador en 0.5 a uno voltios para expulsar continuamente la corriente en la célula.Usando el microscopio confocal, vea la película celular, aumentando el zoom digital para visualizar los detalles de la célula y para asegurarse de que la punta del electrodo es visible dentro de la célula según sea necesario. Espere unos 15 minutos hasta que las ramas y los procesos más finos aparezcan definidos antes de apagar la tensión y retirar suavemente la punta del electrodo de la célula. Para crear una imagen de la celda rellena, espere de 15 a 20 minutos para que la célula vuelva a su forma original antes de ajustar el ajuste en el microscopio confocal para asegurarse de que las ramas y procesos más finos aparecen definidos bajo el objetivo 40X.Configure una pila Z con un tamaño de paso de 0,3 micrómetros, moviendo el objetivo durante la toma de imágenes hasta que no haya señal de la celda y establezca ese paso como la parte superior. A continuación, mueva el objetivo hacia abajo, centrándose a través de la celda hasta que no haya señal y establezca ese paso como la parte inferior. Una vez completada la toma de imágenes, compruebe si el electrodo está en busca de eyección de tinte.Si aparece una nube de tinte grande, el electrodo se puede utilizar para la siguiente rebanada. De lo contrario, sustituya el electrodo. Al generar una proyección de intensidad máxima, se puede observar una vista detallada de la estructura de un astrocito en su dominio.Un zoom de cuatro X magnitud en el astrocito revela una proyección de intensidad máxima de una rama principal, varias ramas secundarias y la distribución de las ramillas y foliolos circundantes. Aquí, se muestra la imagen original de un astrocito CA1. El cuerpo celular, las ramas principales, los procesos y el volumen del territorio encerrados por el astrocito se reconstruyen en estas imágenes posteriores.Después de que se crearon las reconstrucciones, se cuantificaron los volúmenes del soma, toda la célula y el territorio. Y el número de ramas principales fueron contadas. Como proteína citoesquelética que etiqueta filamentos astrocitos intermedios se expresa en el soma celular, ramas principales, y algunas ramas secundarias de astrocitos, pero no en las ramas y procesos más finos.En este análisis representativo, no se encontraron diferencias significativas en el número de ramas primarias etiquetadas por proteína ácida fibrilaria glial y las visualizadas por amarillo lucifer. Además, el área celular y el volumen del astrocito etiquetado por proteína ácida fibrilacionaria glial fueron significativamente más pequeños que el área y el volumen visualizado con amarillo lucifer, lo que demuestra que la proteína ácida fibrilaria glial es un marcador confiable para etiquetar las principales ramas, pero no es útil para determinar el área general o el volumen de la célula. La cantidad de tinte liberado de la punta del electrodo depende de la resistencia del electrodo que debe ser lo suficientemente alta como para permitir que se expulse un flujo constante de tinte.Estudios futuros pueden examinar los diferentes componentes de la estructura de astrocitos mediante microscopía de luz de superrescencia o mediante un análisis inmunohistoquímico de la expresión de proteínas específicas dentro de la estructura de los astrocitos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Visualización de los Efectos de una experiencia inicial positiva, Estímulo Táctil, sobre dendríticas morfología sináptica y la conectividad con Golgi-Cox tinción

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Investigación

Neurociencias

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Control de reactividad astrositos y proliferación in Vitro bajo condiciones isquémicas

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

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Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Iontoforesis en tiempo real con tetrametilamonio para cuantificar la fracción de volumen y la tortuosidad del espacio extracelular cerebral

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos de astrocitos primarios usando biotinilación

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

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Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador

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Cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

Aislamiento de poblaciones adultas de astrocitos humanos de la corteza recién congelada utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia