Name: visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

Yazarlar rehberlik yanı sıra metin üzerinde yorum için Bayan Soto, Dr Yu ve Dr Octeau teşekkür ederiz. Bu çalışma NS060677 tarafından desteklenir.

Bu çalışmada hayvan deneyleri, Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Için Sağlık Enstitüsü Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirildi ve Los Angeles California Üniversitesi'ndeki Rektör Hayvan Araştırma Komitesi tarafından onaylandı. Tüm deneylerde karışık cinsiyetli yetişkin fareler (6−8 haftalık) kullanılmıştır.
1. Çözüm Hazırlama
<ol><li>
Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözeltisi
	<ol>
<li>Her deneyden önce taz...

<ol>
	<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits.">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).</li><li>Ben Haim, L., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+astrocytes+in+neural+circuit+regulation.">Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).</li><li>Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+Shapeshifter:+Mechanisms+Allowing+Astrocytes+to+Respond+to+the+Changing+Nervous+System+During+Development,+Injury+and+Disease.">Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Circuit-Specialized+Astrocytes:+Transcriptomic,+Proteomic,+Morphological,+and+Functional+Evidence.">Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Sun, D., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+astrocytes+in+the+injured+CNS.">Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS.</a> Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).</li><li>Naskar, S., Chattarji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Elicits+Contrasting+Effects+on+the+Structure+and+Number+of+Astrocytes+in+the+Amygdala+versus+Hippocampus.">Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus.</a> eNeuro. 6 (1), (2019).</li><li>Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+spatial+arrangement+of+astrocytes+in+the+optic+nerve+head+of+the+mouse.">The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).</li><li>Grosche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+simple+approach+to+determine+astrocyte+territories+in+mouse+neocortex+and+hippocampus.">Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).</li><li>Kaynig, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automatic+reconstruction+of+neuronal+processes+from+electron+microscopy+images.">Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images.</a> Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Wilhelmsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+concept+of+reactive+astrocytes+as+cells+that+remain+within+their+unique+domains+upon+reaction+to+injury.">Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).</li><li>Williams, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-9+regulates+synapse-specific+differentiation+in+the+developing+hippocampus.">Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus.</a> Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Astrocyte+Water+Channel+Aquaporin-4+in+the+Mouse+Brain.">Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain.</a> ASN Neuro. 7 (5), (2015).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).</li><li>Luna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+structural+reactivity+and+plasticity+in+models+of+retinal+detachment.">Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).</li><li>Octeau, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optical+Neuron-Astrocyte+Proximity+Assay+at+Synaptic+Distance+Scales.">An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales.</a> Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).</li><li>Sosunov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+isocortical+and+hippocampal+astrocytes+in+the+human+brain.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).</li><li>Park, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Specificity+and+Coverage+of+hGFAP-CreERT2+[Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc]+Mouse+Line+in+Various+Brain+Regions.">Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions.</a> Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).</li><li>Koeppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Consequences+of+Synapse+Remodeling+Following+Astrocyte-Specific+Regulation+of+Ephrin-B1+in+the+Adult+Hippocampus.">Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).</li><li>Jefferis, G. S., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+and+combinatorial+neuron+labelling.">Sparse and combinatorial neuron labelling.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).</li><li>Lanjakornsiripan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+morphological+and+molecular+differences+in+neocortical+astrocytes+and+their+dependence+on+neuronal+layers.">Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).</li></ol>

Bu yazıda özetlenen yöntem, hafifçe sabitlenmiş beyin dilimlerinde LY boyasının hücre içi iontoforezini kullanarak astrosit morfolojisini görselleştirmenin bir yolunu açıklamaktadır. Bu protokolde vurgulanan ve başarılı LY iyontoforezine ve hücrelerin morfolojik rekonstrüksiyonuna katkıda bulunan birçok kritik faktör bulunmaktadır. Bir faktör kalitesi ve büyük ölçüde farenin yaşı ve perfüzyon sonucu tarafından belirlenir görüntülerin çoğaltılabilirlik vardır. Bu çalışmada 6−8 ...

Astrositler merkezi sinir sistemindeki en bol glial hücrelerdir (CNS). Onlar iyon homeostazı rol oynamak, kan akımı düzenleme, sinaps oluşumu yanı sıra eleme, ve nörotransmitter alımı1. Astrosit fonksiyonlarıgeniş bir yelpazede karmaşık morfolojik yapısı2yansıtılır ,3. Astrositler, sinapslar, dendritler, akslar, kan damarları ve diğer glial hücrelerle doğrudan etkileşime giren binlerce ince dal ve broşüre ayrılan birkaç birincil ve ikincil dal içerir. Astrosit morfolojisi farklı beyin bölgeleri arasında değişir, hangi nöronal devrelerde farklı işlevlerini gerçekleştirmek için yeteneklerini ipucu olabilir4. Ayrıca, astrositler gelişim sırasında morfolojisini değiştirmek için bilinen, fizyolojik koşullar sırasında, ve birden fazla hastalık devletlerde 3,5,6.
Astrosit morfolojisinin karmaşıklığını doğru bir şekilde çözmek için tutarlı, tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir. Geleneksel olarak, immünohistokimya astrosit spesifik veya astrosit zenginleştirilmiş protein belirteçleri kullanımı ile astrosit görselleştirmek için kullanılmıştır. Ancak bu yöntemler astrositin yapısından çok protein ekspresyonunun paternini ortaya koymaktadır. Glial fibrillary asidik protein (GFAP) ve S100 kalsiyum bağlayıcı protein β (S100β) gibi yaygın olarak kullanılan belirteçler tüm hücre hacminde ifade etmez ve böylece tam morfolojiyi çözemez7. Floresan proteinleri astrositlerde (viral enjeksiyonlar veya transgenik fare muhabiri çizgileri) her yerde ifade etmek için genetik yaklaşımlar ince dalları ve genel bölgeyi belirleyebilir. Ancak, bireysel astrositleri ayırt etmek zordur ve analizler özel organizatör8tarafından hedeflenen astrosit popülasyonu tarafından önyargılı olabilir. Seri kesit elektron mikroskobu sinapslar ile astrosit süreçlerin etkileşimleri ayrıntılı bir resim ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Sinapslarla temas eden binlerce astrosit süreci nedeniyle, şu anda bu teknik9ile tüm hücreyi yeniden yapılandırmak mümkün değildir , ancak bu veri analizi için makine öğrenme yaklaşımlarının kullanımı ile değişmesi beklenmektedir.
Bu raporda, fare astrositlerini Lucifer sarısı (LY) boya ile hücre içi iyontoforez kullanarak, CA1 stratum radiatum'u örnek olarak kullanarak karakterize eden bir prosedüre odaklanıyoruz. Yöntem Eric Bushong ve Mark Ellisman10,11tarafından öncü geçmiş çalışmaları dayanmaktadır. Hafifçe sabitlenmiş beyin dilimlerinden gelen astrositler kendine özgü soma şekilleri ile tanımlanır ve LY ile doldurulur. Hücreler daha sonra konfokal mikroskopi ile görüntülenir. LY iyontoforezinin tek tek astrositleri yeniden yapılandırmak ve süreçlerinin ve bölgelerinin ayrıntılı morfolojik analizlerini yapmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, bu yöntem astrositler ve nöronlar, diğer glial hücreler ve beyin vaskülatür arasındaki mekansal ilişkileri ve etkileşimleri belirlemek için immünohistokimya ile birlikte uygulanabilir. LY iyontoforezinin farklı beyin bölgelerinde morfolojiyi ve sağlıklı veya hastalık lı hastalık lı fare modellerini analiz etmek için çok uygun bir araç olduğunu düşünüyoruz7,12,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:995px;" width="994">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">SF 100-20</td>
			<td style="width:240px;">An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:192px;">Pall</td>
			<td style="width:196px;">4692</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ag/AgCl ground pellet</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP2</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti Aquaporin-4 antibody</td>
			<td style="width:192px;">Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-87679</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anti GFAP antibody</td>
			<td style="width:192px;">Abcam</td>
			<td style="width:196px;">ab4674</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass pipettes with filament</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6NTac mice</td>
			<td>Taconic Stock</td>
			<td style="width:196px;">B6</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>21108</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td style="width:192px;">Olympus</td>
			<td style="width:196px;">FV1000MPE</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium Phosphate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode puller- Model P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td style="width:196px;">P-97</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:196px;">0100-01</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td>
			<td style="width:192px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>400-10</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris software (Version 7.6.5)</td>
			<td style="width:192px;">Bitplane Inc.</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:192px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)</td>
			<td style="width:192px;">Clipper</td>
			<td>1050035</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:192px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:196px;">24X60-1</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:192px;">Fisher</td>
			<td style="width:196px;">12-544-2</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:192px;">Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (40x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:196px;">LUMPLFLN 40XW</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens (60x)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanAPO 60X</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS tablets, 100 mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td>VWRVE404</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pipette micromanipulator- Model ROE-200</td>
			<td style="width:192px;">Sutter</td>
			<td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulator- Model Omnical 2010</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td style="width:196px;">Omnical 2010</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">T8787</td>
			<td>An identical alternative can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome- Model #3000</td>
			<td style="width:192px;">Pelco</td>
			<td style="width:196px;">100-S</td>
			<td>A similar alternative can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing astrocyte morphology using lucifer yellow iontophoresis

Astrositler nöral devrelerin temel bileşenleridir. Onlar tüm merkezi sinir sistemi döşeme (CNS) ve nörotransmitter temizliği, iyon regülasyonu, sinaptik modülasyon, nöronlar için metabolik destek ve kan akımı düzenleme dahil fonksiyonları, çeşitli katılır. Astrositler bir soma olan karmaşık hücrelerdir, birkaç ana dalları, ve nöropil içinde çeşitli hücresel elementlertemas çok sayıda ince süreçler. Astrositlerin morfolojisini değerlendirmek için yapılarını görselleştirmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yönteme sahip olmak gerekir. Erişkin farelerden hafifçe sabitlenmiş beyin dokusunda floresan Lucifer sarısı (LY) boya kullanarak astrositlerin hücre içi iyontoforezini gerçekleştirmek için güvenilir bir protokol sıyoruz. Bu yöntem, astrosit morfolojisi karakterize etmek için yararlı olan çeşitli özelliklere sahiptir. Bu, yapılarının farklı yönleri üzerinde morfolojik analizler yapmak için yararlı olan bireysel astrositlerin üç boyutlu yeniden yapılandırılmasına olanak sağlar. Ly iyontoforezi ile birlikte immünohistokimya, astrositlerin sinir sisteminin farklı bileşenleriyle etkileşimini anlamak ve etiketli astrositler içindeki proteinlerin ekspresyonunu değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu protokol, ışık mikroskobu ile astrosit morfolojisini titizlikle incelemek için CNS bozukluklarının çeşitli fare modellerinde uygulanabilir. LY iontoforezi, astrosit yapısını değerlendirmek için deneysel bir yaklaşım sağlar, özellikle bu hücrelerin önemli morfolojik değişikliklere uğraması önerildiği yaralanma veya hastalık bağlamında.

Bu çalışmada bildirilen veriler her deneyde 4 fareden 7−12 hücreden elde edilebistir. Ortalama veriler, uygun olduğu durumlarda şekil panellerinde raporlanır.
Astrosit morfolojisini değerlendirmek için, Şekil 1'deözetlenen CA1 stratum radyatumdaki astrositleri doldurmak için LY boyası kullanarak hücre içi iyontoforez uyguladık. Şekil 2 temsili bir astrositi ve ayrıntılı morfolojik yapısını betimlemektedir. Hücre 488 nm la...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis at JoVE.com

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrositler morfolojik olarak karmaşık hücrelerdir, çoklu süreçleri ve gür bölgeleri ile örneklenirler. Ayrıntılı morfolojilerini analiz etmek için, hafifçe sabit dokuda hücre içi Lucifer sarı iontoforezi gerçekleştirmek için güvenilir bir protokol salıyoruz.

Lucifer Sarı İontoforez kullanarak Astrosit Morfolojisini Görselleştirme

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Bu yöntem, hastalık ve sabit durumlar sırasında sinaps astrosit nöronal etkileşimlerin değerlendirilmesi için çok ince astrosit süreçlerinin görselleştirilmesikolaylaştırmak için kullanılabilir. Bu teknik, herhangi bir fare modelinde, hücre popülasyonunda veya beyin bölgesinde de uygulanabilir. Uygun bir direnç ile keskin bir elektrot hazırlamak için, bir mikropipet puller bir filament ile borosilikat cam tek namlulu elektrot çekin.Çekilen elektrotları, tozun uçlara girmesini önlemek için kapalı bir kapta saklayın ve uçların kırılmasını önlemek için elektrotları kutunun altından yüksek tutun. Bir elektrotu lucifer sarı boya çözeltisi ile doldurmak için, ucu aşağıya bakacak şekilde dikey konuma bir elektrot yerleştirin ve elektrotun arkasına bir ila iki mikrolitre lucifer sarı çözeltisi pipeti yerleştirin. Çözeltinin kılcal hareket le uca hareket etmesi için 5 ila 10 dakika bekleyin ve elektrotun içindeki berrak sarı ile temas eden elektrot tutucunun gümüş teli ile manipülatöre bağlı bir elektrot tutucuya bağlı elektrot tutucuda doldurulmuş elektrotun emniyetini hafifçe emniyete alın.Boya ejeksiyon testi için, hafifçe sabit bir beyin dilimini oda sıcaklığında 0,1 molar PBS ile dolu cam bir alt tabağa yerleştirin ve dilimi naylon telli platin bir arp ile yerinde tutun. Elektrodu bir voltaj kaynağına bağlayın ve zemin elektrodu beyin dilimini içeren banyoya yerleştirin. Konfokal mikroskobun amacını beyin bölgesine taşıyın ve elektrodu 10X su daldırma merceği kullanarak çözeltiye indirin ve elektrodu görüş alanının merkezine taşıyın.Parlak alan aydınlatması altında, elektrotun berrak ve enkaz veya kabarcık olmadan görünmesini sağlamak için elektrodu 40X su daldırma lensi ile dikkatle inceleyin. 488 nanometrelazer ile confocal lazer tarama mikroskobu geçin. Boya ejeksiyonu test etmek için uyarıcıyı 12 voltta açın.Elektrotun ucu etrafında büyük bir floresan boya bulutu görülmelidir. Daha sonra, parlak alan altında yavaşça dilim doğru elektrot indirin, yüzeyin hemen üzerinde durarak. İontoforez ile ilgi bir astrosit doldurmak için, dilim yüzeyinin altında yaklaşık 10 mikrometre çapında, uzatılmış oval şekilli somata ile astrositleri tanımlamak için kızılötesi diferansiyel girişim kontrast kullanın.Bu hipokampusun stratum radyonu. Dokuda ilerlerken kan damarlarını, nöronları, astrositleri ve diğer hücre tiplerini görebiliriz. Bir astrosit seçildikten sonra, hücreyi görüş alanının merkezine taşıyın ve elektrot ucunu yavaşça dilime indirin, elektrot hücre gövdesi ile aynı düzlükte olana kadar dokuda gezinin.Astrositin hücre gövdesi açıkça görülebildiğinde ve ana hatlarıyla belirtildiğinde, elektrodu yavaşça ileri doğru ilerletin, ucu hücrenin soma'sını çökene kadar elektrot hareket ettirir. Elektrot soma içinde olup olmadığını not etmek için hedefin odak yavaş yavaş yukarı ve aşağı hareket ettirin. Elektrot ucu hücrenin içine girdikten sonra, uyarıcıyı 0,5 ila 1 volt avecürün leterek sürekli olarak hücreye atmasını önele.Confocal mikroskobu kullanarak hücre filmini izleyin, hücrenin ayrıntılarını görselleştirmek ve elektrotun ucunun gerektiğinde hücre içinde görünür olduğundan emin olmak için dijital yakınlaştırmayı artırın. Voltajı kapatmadan ve elektrot ucunu hücreden yavaşça çekmeden önce ince dallar ve işlemler tanımlanmış görünene kadar yaklaşık 15 dakika bekleyin. Dolu hücreyi görüntülemek için, 40X hedefi altında daha ince dalların ve işlemlerin tanımlandıktan emin olmak için konfokal mikroskoptaki ayarı ayarlamadan önce hücrenin orijinal formuna dönmesi için 15 ila 20 dakika bekleyin.0,3 mikrometre adım boyutunda bir Z destesi ayarlayın, hücreden sinyal gelene kadar görüntüleme sırasında hedefi hareket ettirin ve bu adımı üst olarak ayarlayın. Daha sonra hiçbir sinyal olana kadar hücre üzerinden odaklanarak, hedef aşağı taşıyın ve alt olarak bu adımı ayarlayın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, boya ejeksiyonu için elektrot kontrol edin.Büyük bir boyama bulutu görünürse, elektrot bir sonraki dilim için kullanılabilir. Aksi takdirde, elektrot değiştirin. Maksimum yoğunluklu projeksiyon oluşturarak, bir astrositin etki alanında yapısının ayrıntılı bir görünümü gözlemlenebilir.Astrosite dört X kadir zoom bir ana dal, birkaç ikincil dalları niçin maksimum yoğunluklu projeksiyon ve çevredeki dalve broşürlerin dağılımını ortaya koymaktadır. Burada, bir CA1 astrositorijinal görüntü gösterilir. Astrosit tarafından kaplanmış hücre gövdesi, ana dalları, süreçleri ve bölge hacmi bu sonraki görüntülerde yeniden oluşturulur.Rekonstrüksiyonlar oluşturulduktan sonra soma, tüm hücre ve bölgenin hacimleri ölçüldü. Ve büyük şubelerin sayısı sayıldı. Ara astrosit filamentleri etiketleyen sitosiskelet proteini olarak hücre soma, ana dallar ve bazı ikincil astrosit dallarında ifade edilir, ancak daha ince dal ve süreçlerde ifade edilmez.Bu temsili analizde glial fibrillary asidik protein ile etiketlenen primer branş sayısında ve lucifer sarısı ile görselleştirilebilenlerde anlamlı bir fark saptanmadı. Ayrıca, glial fibrillary asidik protein ile etiketlenen astrositin hücre alanı ve hacmi, glial fibrillary asidik proteinin büyük dalları nitretifite için güvenilir bir belirteç olduğunu, ancak hücrenin genel alanını veya hacmini belirlemek için yararlı olmadığını göstererek, lucifer sarısı ile görselleştirilen alan ve hacimden önemli ölçüde daha küçüktü. Elektrot ucundan salınan boya miktarı, sürekli bir boya akışının atılabilmesi için yeterince yüksek olması gereken elektrot direncine bağlıdır.İleride yapılan çalışmalar, astrosit yapısının farklı bileşenlerini süper çözünürlüklü ışık mikroskobu veya astrosit yapısı içindeki spesifik proteinlerin ekspresyonunun immünohistokimyasal analizi ile inceleyebilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Golgi-Cox Boyama ile dendritik morfoloji ve sinaptik bağlantı üzerinde olumlu bir Erken Deneyimi, Tactile uyarılması Etkileri, görselleştirme

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı Vitro iskemik benzeri koşullar altında izleme

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Sütunlar ve Katmanlar dendritik Morfoloji Analizi

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Beyin Ekstraselüler Alanının Hacim Fraksiyonu ve Kıvrımını Nicelleştirmek için Tetrametilamonyum ile Gerçek Zamanlı İyontoforez

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Bir roman In Vitro canlı görüntüleme Astrocyte tahlil-aracılı fagositoz kullanarak pH göstergesi Birleşik Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

ImageJ kullanarak doku hazırlanan immünhistokimya Photomicrographs üzerinden Microglia morfoloji miktarının

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...