Name: a cryo-pulverization protocol for processing mouse paws to evaluate molecular pathways of tissue inflammation in a collagen induced arthritis model
Uploaded: 2019-10-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model at JoVE.co

ويود المؤلفون ان يشكروا اديث جانسين علي المراجعة النقدية لمخطوطه نافين راو وجنيفر تاون لدعمهما لنشر هذه المخطوطة.

وقد أجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا لسياسات اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها التابعة لشركه Janssen R & D.
1. المبردة تجميد مطحنه القائم علي طريقه الطحن
<ol><li>عند إنهاء دراسة وكاله المخابرات الخاصة ، والفئران التضحية مع 1.5 ٪ ايزوفلوراني تليها خلع عنق الرحم.</li>
	<li>في ي?...

<ol>
	<li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis.">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).</li><li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis.">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).</li><li>Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+animal+models+in+predicting+genetic+susceptibility+to+complex+diseases+such+as+rheumatoid+arthritis.">The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).</li><li>David, C. S., Taneja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+major+histocompatibility+complex+genes+in+murine+collagen-induced+arthritis:+a+model+for+human+rheumatoid+arthritis.">Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis.</a> American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).</li><li>Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheumatoid+factors+in+mice.">Rheumatoid factors in mice.</a> Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).</li><li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis:+focus+on+interferon-gamma.">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).</li><li>Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticytokine+treatment+of+established+type+II+collagen-induced+arthritis+in+DBA/1+mice.+A+comparative+study+using+anti-TNF+alpha+anti-IL-1+alpha/beta,+and+IL-1Ra.">Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 39, 797-809 (1996).</li><li>Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+rheumatoid+arthritis.">Animal models of rheumatoid arthritis.</a> European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).</li><li>Williams, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-induced+arthritis+as+a+model+for+rheumatoid+arthritis.">Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis.</a> Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Blockade+of+TNF-alpha+and+IL-17A+Alleviates+Progression+of+Collagen-Induced+Arthritis+without+Causing+Serious+Infections+in+Mice.">Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice.</a> Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).</li></ol>

علي الرغم من ان هناك مبرر علمي قوي لتقييم المسارات الجزيئية في الانسجه الزليلي ، وركزت العديد من التقارير علي التنميط المناعي للنموذج murine CIA علي الدم المحيطي ، في حين ان البروتين وبيانات تحليل RNA من الكفوف الملتهبة محدوده نوعا ما. هناك العديد من الأسباب المحتملة لهذا التحيز: المفاصل الكاحل...

التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض التهابي مزمن الجهازية مع التهاب الغدة الدرقية المتماثل المستمر في المفاصل ومشاركه مفصليه اضافيه من أجهزه مثل الجلد والقلب والرئتين ، والعينين1. علي الرغم من ان المظاهر الجهازية للاستجابة المناعية واضحة في المرضي البشريين ، واحده من السمات المميزة للامراض RA هو تسلل الخلايا المناعية في الانسجه الزليلي وانتشار الخلايا الليفية الزليلي2.
علي غرار RA الإنسان ، الكولاجين الماوس المستحثة التهاب المفاصل (CIA) نموذج يثير التهاب الانسجه القوية مع الاستجابات المناعية النشطة في الانسجه الزليلي والمقصورات الجهازية. الحساسية من سلالات الماوس مختلفه لارتباطات نموذج وكاله المخابرات الخاصة إلى مجمع التوافق الرئيسية (mhc) النمط والخلية المحددة antigen T و B التفاعلات الخلية3,4. الاضافه إلى ذلك ، فان العديد من المسارات المسببة للامراض في RA الإنسان ، بما في ذلك إنتاج الأجسام المضادة ، وترسب معقده المناعي ، وتنشيط الخلايا النخاعية ، ومظاهر متعددة المفصليات وتشكيل بانيوس مع تسلل المناعي الزليلي ، هي أيضا واضحة في هذا النموذج 5,6. وقد استخدم المحققون هذا النموذج الراسخ CIA للتحقيق في اثار العلاجات السايسيسين المضادة للالتهابات7. وقد تم العثور علي العديد من البيولوجية المعتمدة للامراض المناعية الذاتية أو التهابيه ، مثل المضادة لل tnfα والمضادة لل-6 ، ان تكون فعاله في نموذج8،9وكاله المخابرات العامة.
التنميط التفاعلات من الجهاز المناعي في الانسجه الزليلي أمر حاسم لتوضيح أليات الجزيئية المرتبطة بالتسبب في RA. في البيئة السريرية البشرية ، والممارسة الشائعة هي اجراء الخزعات الزليلي الابره تحت اشراف التصوير بالموجات فوق الصوتية. في الإعدادات الاكلينيكيه ، يجعل الهيكل الأصغر للمفاصل الmurine إجراءات الخزعة أكثر صعوبة ان لم يكن مستحيلا. في الاونه الاخيره ، أظهرنا استخدام نموذج murine CIA لتقييم مجموعات من الادويه للتاثير علي نقاط النهاية المتباينة وحل المرض في نهج التوافقية10. وقد استخدمت طريقه الطحن المبردة طاحونة القائم علي مطحنه لمعالجه الكفوف murine الملتهبة في مساحيق ناعمه متجانسة والعمليات التي أنشئت المصب لاستخراج الحمض الريبي النيبالي والبروتينات. هذه الطريقة تحمي الحمض الريبي النيبالي والبروتين من العمليات الانزيميه والكيميائية degrative وتمكننا من تطبيق أساليب تحليليه متعددة لمصدر عينه متجانس واحد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mm stainless steel bead</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>RNA qualification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CI</td>
			<td>Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis stock solution</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>Microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube centrifuge box</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5055</td>
			<td>Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Everlast 247 Variable Speed Rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BR5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>6875</td>
			<td>Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Vial</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>6801</td>
			<td>Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td>Kit for Total Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail set 1</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539131</td>
			<td>Protease Inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein BCA Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantigene Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>QP1013</td>
			<td>bDNA analysis Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>RNA extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BR5000</td>
			<td>Rocker/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-412</td>
			<td>Spatula for powder transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Bead</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>Bead for mixing during protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Extractor</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>6884</td>
			<td>Extractor for removing the top of grinding vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cryo-pulverization protocol for processing mouse paws to evaluate molecular pathways of tissue inflammation in a collagen induced arthritis model

تنميط التغيرات الجزيئية في الانسجه المحلية أمر حاسم لفهم اليه (ق) عمل المرشحين العلاجية في الجسم الحي. في مجال البحوث التهاب المفاصل ، وتركز العديد من الدراسات علي المفاصل الملتهبة التي تتكون من خليط معقد من العظام والغضاريف والعضلات والخلايا اللحمية والخلايا المناعية. هنا ، انشانا طريقه ميكانيكيه موثوقه وقويه لتعطيل الكفوف الماوس ملتهبة في عينات المسحوق متجانسة في بيئة تسيطر عليها الديتريوم. وتمت معالجه البروتينات والحمض الريبي النيبالي لتمكين نقاط النهاية البروتينية والمتحولة والتوصيف الجزيئي لمسارات الامراض ذات الصلة في الانسجه المحلية.

هنا ، ونحن نظهر ممثل التصور الصورة هلام من الجيش النيبالي الريبي المستخرجة من الكفوف الاماميه من الفئران CIA في الشكل 2ا. RRNA 28S و rRNA 18S الفرقة تشير إلى جميع العينات لديها كميه كافيه من الحمض الريبي النيبالي سليمه. المقبل ، ونحن تظهر مؤامرة مبعثر ممثل...

Watch this Scientific Journal Video about A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model at JoVE.co

A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model

تم تطوير طريقه السحق المبردة لمعالجه الكفوف murine باستخدام مطحنه النيتروجين السائل التجميد لتحسين الغلة وجوده الحمض الريبي النيبالي أو البروتين المستخرج من الانسجه وتمكين تحليل الملامح الجزيئية المرتبطة التهابات الاستجابات.

بروتوكول تجميد السحق لمعالجه الكفوف الماوس لتقييم المسارات الجزيئية للالتهابات الانسجه في الكولاجين المستحثة نموذج التهاب المفاصل

Profiling molecular changes in local tissues is crucial to understand the mechanism(s) of action of therapeutic candidates in vivo. In the field of ...

تقييم الملامح الجزيئية في الأنسجة المحلية هو خطوة حاسمة لفهم آلية عمل المستحضرات الصيدلانية النشطة كما يتم تقييمها في النماذج قبل الفحص الطبية ذات الصلة بالأمراض. في مجال أبحاث التهاب المفاصل، والبيئة الأنسجة المحلية من الفائدة هي المفاصل الصغيرة التي تحمل الوزن والتي تتكون من خليط معقد من العظام والغضاريف والعضلات والخلايا المناعية. هنا نحن وصف طريقة قوية موثوق بها لتعطيل الميكانيكية و / أو السحق من هذه البيئة الأنسجة المعقدة في بيئة تسيطر عليها بالتبريد.ويمكن بعد ذلك استخدام هذه الطريقة لتوليد جهود التنميط البروتومية والنسخية المصبية لإنشاء التواقيع الجزيئية للمرض من مصدر عينة موحد واحد. هذه الطريقة تولد مسحوق متجانس على عكس العديد من التقنيات القديمة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يسمح الإجراء القديم لعزل درجة الحرارة لعزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة.ويمكن بعد ذلك استخدام هذه الطريقة لتوليد التنميط البروتومي والمنسخ في المصب مما يتيح التوصيف الجزيئي لمسارات المرض ذات الصلة ذات الصلة. هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى لأي مجال البحوث التي يتم اشتقاق التواقيع الجزيئية من الأنسجة. ويمكن توسيع هذه الطريقة إلى أي نظام الأنسجة المعقدة التي لديها كثيفة ويصعب فصل المكونات.على الرغم من أننا لم تقيم حتى هذه اللحظة، يمكن أن نرى التطبيق المحتمل للأنسجة الغضروف الكثيفة مثل الأذنين أو العظام. الطبيعة الحرجة للوقت لنقل المسحوق إلى أنابيب لوزن هو شيء يأخذ الممارسة. إذا أخذ الكثير من الوقت، سيبدأ المسحوق في الذوبان ويصبح غير متبلور.من المهم أن تحد من عدد العينات إلى 10 إلى 15 حتى تكون مرتاحًا للإجراء. في يوم تجهيز الأنسجة، prechill جميع الأدوات اللازمة على الجليد الجاف لمدة لا تقل عن 10 دقيقة. ارتداء قفازات حرارية لتجنب التعرض للأذى من البرد القارس.المقبل, نقل كل من مخلب الماوس المعدة في أنبوب 1.5 ملليلتر microcentuge منفصلة وعلى الفور المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل. تخزين الكفوف المجمدة في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية. عندما تكون جاهزة للمتابعة، املأ مطحنة الفريزر بالنيتروجين السائل ودعها توازن لمدة 10 دقائق على الأقل.ضع العينة غير المجهزة على الجليد الجاف واحفظها هناك لتجنب دورات التجميد/الذوبان. ثم نقل مخلب واحد هند إلى قارورة كبيرة قبل المبردة البولي طحن مع قابس الصلب السفلي. إدراج آثار الصلب قبل المبردة وإغلاق قارورة طحن البولي مع المكونات الصلب الأعلى قبل المبردة.نقل قوارير كبيرة طحن البولي مع العينات في طاحونة الفريزر المعبأة مسبقا وإغلاق الغطاء مع المشبك المطاطي وجدت في الجزء الأمامي من الصك. السماح للعينات تبرد في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، قم بتعيين مطحنة التجميد إلى برنامج دقيقة واحدة مع 10 دورات في الثانية.اضغط على زر التشغيل وانتظر حتى مطحنة التجميد لإكمال دورته. بعد ذلك، افتح غطاء مطحنة الفريزر واخرج قارورة الطحن البولي كبيرة. ضع قارورة الطحن في مستخرج وقم بإزالة قابس الصلب العلوي عن طريق الضغط النزولي على المقبض الأسود حتى ينزلق مقبس الصلب من أنبوب البولي.نقل قارورة طحن مفتوحة على الجليد الجاف واستخدام ملقط قبل المبردة لإزالة آثار الصلب. نقل مسحوق المجمدة إلى ما قبل المبردة 50 ملليلتر أنبوب مخروطي. تزن ما بين 30 و 50 ملليغرام من مسحوق المجمدة في المستويات 1.5 ملليلتر ميكروسنتريفوغ أنبوب لاستخراج الحمض النووي الريبي وبين 100 و 200 ملليغرام لاستخراج البروتين.تخزين العينات المسحوقة في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية والمضي قدما في الجيش الملكي النيبالي وعزل البروتين في غضون 24 ساعة. أولا، إضافة 10 ميكرولترات من بيتا-mercaptoethanol لكل ملليلتر من RLT العازلة. حساب حجم RLT العازلة المقابلة لنسبة 23.3 ملليلتر لكل ملليغرام من الأنسجة وإضافة الحجم المناسب من RLT العازلة مع بيتا mercaptoethanol إلى الأنبوب مع مسحوق المجمدة.دوامة العينة في 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان. استخدام 1 ملليلتر أنبوب إلى ماص صعودا وهبوطا بقوة 10 مرات ودوامة العينة مرة أخرى في 3، 000 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 13،000 مرات ز لمدة دقيقتين ونقل 700 ميكرولترات من عظمى إلى أنبوب جديد.إضافة 700 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول لهذا الأنبوب وتحميل 700 ميكرولترات من العينة على عمود تنقية الجيش الملكي النيبالي. الطرد المركزي الأنبوب بسرعة لا تقل عن 10،000 مرات ز لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق من خلال وتحميل الجزء المتبقي من العينة على العمود RNeasy والطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى بسرعة لا تقل عن 10،000 مرة ز لمدة 30 ثانية.تجاهل التدفق من خلال وغسل العمود عن طريق إضافة 700 ميكرولترات من العازلة RW1 وrrifuging ما لا يقل عن سرعة 10، 000 مرة ز لمدة 30 ثانية. إذا كان أداء خيار DNAse الهضم, 350 microliters من RW1 يضاف قبل العلاج DNAse. وبعد العلاج DNAse، يضاف 350 ميكرولترات إضافية من RW1.ثم غسل العمود مرتين عن طريق إضافة 500 ميكرولترات من RPE العازلة والطرد المركزي بسرعة لا تقل عن 10،000 مرات ز لمدة 30 ثانية مع التأكد من التخلص من تدفق من خلال كل مرة. بعد ذلك، قم بتجفيف العمود عن طريق الطرد المركزي بسرعة لا تقل عن 10,000 مرة ز لمدة دقيقتين. Elute الجيش الملكي النيبالي عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من الماء وsuguging بسرعة لا تقل عن 10، 000 مرات ز لمدة دقيقتين.جمع تدفق من خلال ونقلها إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. تحديد كمية الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة الباحث في الاختيار وتخزينها عند درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية قبل إجراء المزيد من التحليل. تمييع 10X خلية محلول الأسهم تحلل ل1X خلية محلول الأسهم تحلل مع المياه الصف ثقافة الخلية.إعادة تشكيل كوكتيل مثبطات البروتياز تعيين واحد مع ملليلتر واحد من الماء لجعل مخزون مثبطات البروتياز 100X. إضافة 100 ملليلتر من مثبطات البروتياز إلى 9.9 ملليلتر من 1X خلية تحلل العازلة للحصول على حل الأسهم النهائية 1X. إضافة أربعة microliters من الجليد الباردة الخلية العازلة لتحلل كل ملليغرام من مسحوق الأنسجة وإضافة واحد خمسة ملليمتر حبة الفولاذ المقاوم للصدأ إلى الأنبوب.دوامة الأنبوب في 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية. نقل أنبوب إلى الثلج الرطب والاستمرار في العينة التالية. بالإضافة إلى ذلك، قد يجد الباحثون أن وضع مربع عمودي يمكن أن تسهل أفضل خلط مع حبة.بعد ساعة واحدة، الطرد المركزي الأنابيب في 10،000 مرات ز وعند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. نقل اابر في أنبوب جديد مع التأكد من تجنب طبقة الدهون على القمة. تحديد تركيز البروتين الكلي.Aliquot كل عينة في أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر وتخزينها في درجة مئوية سلبية 80 حتى تصبح جاهزة لإجراء مزيد من التحليل. في هذه الدراسة، يتم استخدام طريقة السحق المبردة لمعالجة الكفوف مورين من أجل تحسين العائد ونوعية الحمض النووي الريبي أو البروتين المستخرج من الأنسجة وتمكين تحليل ملامح الجزيئية المرتبطة الاستجابات الالتهابية. تصور صورة هلام تمثيلي يظهر الحمض النووي الريبي المستخرج من الكفوف الأمامية من الفئران وكالة المخابرات المركزية.28S rrna و 18S rRNA العصابات تشير إلى أن جميع العينات لديها كمية كافية من الحمض النووي الريبي سليمة. تظهر هنا مؤامرة مبعثرة تمثيلية لتركيزات البروتين الإجمالية استنادًا إلى تحليل البروتين BCA. تركيزات البروتين الكلي من الفئران الساذجة، فئران وكالة المخابرات المركزية، أو فئران وكالة الاستخبارات المركزية تحت علاجات مختلفة قابلة للمقارنة عبر المجموعات.ثم يتم إجراء تحليلات Luminex لتحديد تركيزات السيتوكينات الالتهابية وكيموكينات في مستخلص البروتين. مؤامرة مبعثرة تمثيلية لتركيزات السيتوكينات المطبعية و chemokines يكشف أنه بالمقارنة مع الفئران الساذجة ، يتم رفع العديد من السيتوكينات في الفئران وكالة المخابرات المركزية والعلاج مع الأجسام المضادة IL17A يمنع بشكل كبير إنتاج العديد من السيتوكينات. يتم إجراء تحليل Microarray لتقييم التغيرات في النسخ في وكالة المخابرات المركزية والآثار المتعلقة بالعلاج.تظهر هنا خريطة حرارية تمثيلية للجينات زادت بشكل كبير في فئران وكالة الاستخبارات المركزية مقارنة بالفئران الساذجة. عند إجراء هذا الإجراء ، من المهم للباحثين تقليل الوقت الذي يتم فيه الاحتفاظ الأنبوب والمسحوق خارج الجليد الجاف. وهذا يساعد على منع ذوبان المسحوق والمشاكل اللاحقة للرنا والبروتين المتدهورة.تتيح الجودة العالية للتوقيعات الجزيئية الناتجة عن هذه التقنية للباحثين استجواب الملف الفريد الذي ينقله العلاجي ويسمح أيضًا بالتمايز بين الآليات التي يمكن استخدامها لعلاج الحالات التهاب المفاصل. ويمكن استخدام هذه التقنية لاستخراج عدد من الأنسجة الكثيفة مثل الأذنين والعظام لتقييم المزيد من التواقيع الجزيئية في هذه الأنسجة ذات الاهتمام. فهم كيف تُعدل العلاجات التواقيع الجزيئية للمرض يمكننا من تقييم مسارات الإشارات المحددة بشكل أفضل.وربما الأهم من ذلك، ما هي المسارات التي لا يتم تنظيمها مع الآلية العلاجية التي يتم تقييمها. عند العمل مع النيتروجين السائل والجليد الجاف، لا بد من استخدام معدات الحماية الشخصية بما في ذلك القفازات ودروع الوجه ذات التصنيف الصحيح. يمكن أن يسبب التعرض للجلد لأكثر من بضع ثوان حروقًا شديدة.عند العمل مع كميات كبيرة من الجليد الجاف، من المهم أن تعمل في منطقة جيدة التهوية كما الجليد الجاف النشرات ثاني أكسيد الكربون.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

التصوير من HIV-1 مغلف من صنع المشبك الفيروسية، واشارة على طبقات ثنائية الدهون الاصطناعية

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

دراسة دور النسيج اللمفي البلعوم المرتبط (NALT) في الردود الفأر إلى اللقاحات

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

نموذج الفأر لالتهاب الناجم عن مسببات الأمراض المزمنة في مواقع المحلية والجهازية

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

والطريقة الأمثل لعزل وتوسيع قسما ثابتا الطبيعية الخلايا التائية القاتلة من الماوس الطحال

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

الإدارة داخل القصبة الهوائية لل<em&gt; المستدمية النزلية</em&gt; في نماذج الماوس لدراسة التهاب الشعب الهوائية

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

التصور من الخلايا اللمفاوية معربا-22-IL عن طريق الفئران مراسل

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

التمايز في المختبر من خلايا CD4 الإنسان + FOXP3 + المستحثة تنظيم الخلايا التائية (iTregs) من خلايا CD4 + T السذاجة باستخدام بروتوكول تحتوي على TGF-β-

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

طريقة لقياس وظيفة الغدة اللعابية في الفئران

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...