Name: a cryo-pulverization protocol for processing mouse paws to evaluate molecular pathways of tissue inflammation in a collagen induced arthritis model
Uploaded: 2019-10-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model at JoVE.co

Die Autoren danken Edith Janssen für die kritische Überprüfung des Manuskripts und Navin Rao und Jennifer Towne für ihre Unterstützung der Veröffentlichung dieses Manuskripts.

Alle Tierversuche wurden im Einklang mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Janssen R&D durchgeführt.
1. Kryogene Gefrierwerk Mühlen-basierte Pulverisierungsmethode
<ol><li>Nach Beendigung der CIA-Studie opfern Mäuse mit 1,5% Isofluran, gefolgt von zervikaler Dislokation.</li>
	<li>Am Tag der Gewebeverarbeitung alle Instrumente (Spatzer, Schleiffläschchen usw.) auf Trockeneis für mindestens 10 min vorkühlen. Thermische Handschuhe tragen, um Fros...

<ol>
	<li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis.">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).</li><li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis.">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).</li><li>Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+animal+models+in+predicting+genetic+susceptibility+to+complex+diseases+such+as+rheumatoid+arthritis.">The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).</li><li>David, C. S., Taneja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+major+histocompatibility+complex+genes+in+murine+collagen-induced+arthritis:+a+model+for+human+rheumatoid+arthritis.">Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis.</a> American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).</li><li>Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheumatoid+factors+in+mice.">Rheumatoid factors in mice.</a> Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).</li><li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis:+focus+on+interferon-gamma.">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).</li><li>Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticytokine+treatment+of+established+type+II+collagen-induced+arthritis+in+DBA/1+mice.+A+comparative+study+using+anti-TNF+alpha+anti-IL-1+alpha/beta,+and+IL-1Ra.">Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 39, 797-809 (1996).</li><li>Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+rheumatoid+arthritis.">Animal models of rheumatoid arthritis.</a> European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).</li><li>Williams, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-induced+arthritis+as+a+model+for+rheumatoid+arthritis.">Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis.</a> Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Blockade+of+TNF-alpha+and+IL-17A+Alleviates+Progression+of+Collagen-Induced+Arthritis+without+Causing+Serious+Infections+in+Mice.">Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice.</a> Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).</li></ol>

Obwohl es starke wissenschaftliche Gründe für die Bewertung molekularer Pfade in Synovialgeweben gibt, konzentrierten sich viele Berichte über die Immunprofilierung des murinen CIA-Modells auf peripheres Blut, während Protein- und RNA-Analysedaten von entzündeten Pfoten eher begrenzt sind. Es gibt mehrere mögliche Gründe für diese Voreingenommenheit: murine Sprunggelenke sind nicht größer als 2 cm; Die betroffenen Bereiche bestehen aus Haut-, Knochen- und Bindegeweben, die mit traditionellen Methoden wie Gewebe...

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch systemische entzündliche Erkrankung mit anhaltender symmetrischer Synovitis in den Gelenken und extra artikulärer Beteiligung von Organen wie Haut, Herz, Lunge und Augen1. Obwohl die systemischen Manifestationen der Immunantwort bei menschlichen Patienten offensichtlich sind, ist eines der Kennzeichen der RA-Pathologie die Infiltration von Immunzellen im Synovialgewebe und die Proliferation von synovialen Fibroblastenzellen2.
Ähnlich wie beim menschlichen RA löst das Modell der Mauskollagen-induzierten Arthritis (CIA) starke Gewebeentzündungen mit aktiven Immunantworten in Synovialgeweben und systemischen Fächern aus. Die Anfälligkeit verschiedener Mausstämme für CIA-Modellverbindungen mit DemInthek-Komplex (MHC) und antigenspezifischen T-Zell- und B-Zell-Wechselwirkungen3,4. Darüber hinaus sind viele pathogene Wege in der menschlichen RA, einschließlich der Autoantikörperproduktion, immunkomplexer Ablagerung, myeloische Zellaktivierung, polyartikulärer Manifestationen und Pannusbildung mit synovialer Immuninfiltration, in diesem Modell ebenfalls zu sehen. 5,6. Die Ermittler haben dieses etablierte CIA-Modell verwendet, um die Auswirkungen entzündungshemmender Zytokinbehandlungen zu untersuchen7. Viele Biologika, die für Autoimmun- oder entzündliche Erkrankungen zugelassen sind, wie Z.B. Anti-TNF und Anti-IL-6, werden im CIA-Modell8,9als wirksam befunden.
Die Profilierung der Wechselwirkungen des Immunsystems im Synovialgewebe ist entscheidend, um molekulare Mechanismen im Zusammenhang mit der Pathogenese von RA aufzuklären. Im klinischen Umfeld des Menschen ist es gängige Praxis, Nadelsynovialbiopsien unter Anleitung der Ultraschall-Bildgebung durchzuführen. In den präklinischen Umgebungen erschwert die kleinere Architektur der murinen Gelenke die Biopsieverfahren viel schwieriger, wenn nicht gar unmöglich. Kürzlich haben wir die Verwendung des murinen CIA-Modells demonstriert, um Kombinationen von Medikamenten zu bewerten, um unterschiedliche Endpunkte zu beeinflussen und Krankheiten in einem kombinatorischen Ansatz zu lösen10. Eine kryogene Gefrierwalzen-Pulverisierungsmethode wurde eingesetzt, um entzündete murine Pfoten zu homogenen Feinenpulvern zu verarbeiten und nachgelagerte Prozesse zur Extraktion von RNA und Proteinen zu etablieren. Diese Methode schützt RNA und Protein vor enzymatischen und chemischen Degrativen Prozessen und ermöglicht es uns, mehrere Analysemethoden auf eine einzige homogenisierte Probenquelle anzuwenden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mm stainless steel bead</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>RNA qualification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CI</td>
			<td>Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis stock solution</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>Microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube centrifuge box</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5055</td>
			<td>Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Everlast 247 Variable Speed Rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BR5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>6875</td>
			<td>Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Vial</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>6801</td>
			<td>Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td>Kit for Total Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail set 1</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539131</td>
			<td>Protease Inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein BCA Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantigene Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>QP1013</td>
			<td>bDNA analysis Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>RNA extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BR5000</td>
			<td>Rocker/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-412</td>
			<td>Spatula for powder transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Bead</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>Bead for mixing during protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Extractor</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>6884</td>
			<td>Extractor for removing the top of grinding vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cryo-pulverization protocol for processing mouse paws to evaluate molecular pathways of tissue inflammation in a collagen induced arthritis model

Die Profilierung molekularer Veränderungen in lokalen Geweben ist entscheidend, um den Wirkmechanismus(en) der therapeutischen Kandidaten in vivo zu verstehen. Im Bereich der Arthritisforschung konzentrieren sich viele Studien auf entzündete Gelenke, die aus einer komplexen Mischung aus Knochen, Knorpel, Muskel, Stromalzellen und Immunzellen bestehen. Hier haben wir eine zuverlässige und robuste mechanische Methode etabliert, um entzündete Mauspfoten in homogenpulverisierte Proben in einer kryogen kontrollierten Umgebung zu stören. Protein- und RNA-Lysate wurden verarbeitet, um proteomische und transkriptionelle Endpunkte und die molekulare Charakterisierung relevanter Krankheitswege im lokalen Gewebe zu ermöglichen.

Hier zeigen wir eine repräsentative Gelbildvisualisierung von RNA, die aus Vorderpfoten von CIA-Mäusen extrahiert wurde, in Abbildung 2A. Die 28S rRNA und das 18S rRNA-Band zeigen an, dass alle Proben eine ausreichende Menge an intakter RNA haben. Als Nächstes zeigen wir in Abbildung 2Beine repräsentative Streuungsdiagramm der gesamten Proteinkonzentrationen auf der Grundlage der Protein-BCA-...

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A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model

Eine kryogene Pulverisierungsmethode zur Verarbeitung von murinen Pfoten mit einer flüssigen Stickstoff-Gefriermühle wurde entwickelt, um die Ausbeute und Qualität der aus den Geweben extrahierten RNA oder Proteine zu verbessern und die Analyse molekularer Profile im Zusammenhang mit entzündlichen Antworten.

Ein Kryo-Pulverisierungsprotokoll zur Verarbeitung von Mauspfoten zur Bewertung molekularer Wege von Gewebeentzündungen in einem Kollagen-induzierten Arthritis-Modell

Profiling molecular changes in local tissues is crucial to understand the mechanism(s) of action of therapeutic candidates in vivo. In the field of ...

Die Bewertung molekularer Profile in lokalen Geweben ist ein entscheidender Schritt, um den Wirkmechanismus von Wirkstoffen zu verstehen, da sie in krankheitsrelevanten präklinischen Modellen bewertet werden. Im Bereich der Arthritisforschung sind die kleinen gewichtstragenden Gelenke, die aus einer komplexen Mischung aus Knochen, Knorpel, Muskel und Immunzellen bestehen, von Interesse. Hier beschreiben wir eine zuverlässige, robuste Methode zur mechanischen Störung und/oder Pulverisierung dieser komplexen Gewebeumgebung in einer kryogen kontrollierten Umgebung.Diese Methode kann dann verwendet werden, um nachgelagerte proteomische und transkriptionelle Profilierungsbemühungen zu generieren, um molekulare Signaturen von Krankheiten aus einer einzigen einheitlichen Probenquelle zu ermitteln. Diese Methode erzeugt ein homogenes Pulver im Gegensatz zu vielen anderen alten Techniken. Zusätzlich ermöglicht das alte Temperaturisolationsverfahren die Isolierung hochwertiger RNA.Diese Methode kann dann verwendet werden, um nachgeschaltete proteomische und transkriptionelle Profilierung zu erzeugen, die eine molekulare Charakterisierung relevanter Krankheitswege von Interesse ermöglicht. Diese Methode kann Einblicke in jedes Forschungsfeld geben, das molekulare Signaturen aus Geweben ableitet. Die Methode könnte auf jedes komplexe Gewebesystem ausgedehnt werden, das dichte und schwer zu dissoziierende Bestandteile hat.Obwohl wir bis zu diesem Punkt nicht bewertet haben, konnten wir eine mögliche Anwendung auf dichte Knorpelgewebe wie Ohren oder Knochen sehen. Die zeitkritische Natur der Übertragung des Pulvers auf Rohre zum Wiegen ist etwas, das Übung erfordert. Wenn zu viel Zeit in Anspruch genommen wird, beginnt das Pulver zu tauen und amorph zu werden.Es ist wichtig, die Anzahl der Proben auf 10 bis 15 zu begrenzen, bis Sie mit dem Verfahren vertraut sind. Am Tag der Gewebeverarbeitung alle benötigten Instrumente auf Trockeneis für mindestens 10 Minuten vorchillen. Tragen Sie Thermohandschuhe, um nicht durch die extreme Kälte geschädigt zu werden.Als nächstes jede der vorbereiteten Mauspfote in ein separates 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen und sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren. Bewahren Sie die gefrorenen Pfoten bei minus 80 Grad Celsius auf. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, füllen Sie eine Gefriermühle mit flüssigem Stickstoff und lassen Sie sie mindestens 10 Minuten aushalten.Legen Sie die unverarbeitete Probe auf Trockeneis und halten Sie sie dort auf, um Frost-/Tauzyklen zu vermeiden. Dann eine Hinterpfote in eine vorgekühlte große Polycarbonat-Schleifflasche mit einem unteren Stahlstecker geben. Setzen Sie den vorgekühlten Stahlstoßsozer ein und schließen Sie die Polycarbonat-Schleifflasche mit dem vorgekühlten Stahlstopfen.Die großen Polycarbonat-Schleiffläschchen mit den Proben in die fertige Gefriermühle geben und den Deckel mit dem an der Vorderseite des Instruments gefundenen Gummiverschluss schließen. Lassen Sie die Proben eine Minute im flüssigen Stickstoff abkühlen. Als nächstes stellen Sie die Gefriermühle auf das einminütige Programm mit 10 Zyklen pro Sekunde.Drücken Sie die Lauftaste und warten Sie, bis die Gefriermühle ihren Zyklus abgeschlossen hat. Danach öffnen Sie den Deckel der Gefriermühle und nehmen Sie die große Polycarbonat-Schleifflasche heraus. Legen Sie die Schleifflasche in einen Extraktor und entfernen Sie den oberen Stahlstecker, indem Sie den schwarzen Griff nach unten drücken, bis der Stahlstecker aus dem Polycarbonatrohr gleitet.Übertragen Sie die geöffnete Schleifflasche auf Trockeneis und verwenden Sie vorgekühlte Zangen, um den Stahlstoßsoper zu entfernen. Das gefrorene Pulver in ein vorgekühltes 50-Milliliter-Konusrohr geben. Wiegen Sie zwischen 30 und 50 Milligramm des gefrorenen Pulvers in eine gestufte 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhre für die RNA-Extraktion und zwischen 100 und 200 Milligramm für die Proteinextraktion.Bewahren Sie die pulverisierten Proben bei minus 80 Grad Celsius auf und gehen Sie innerhalb von 24 Stunden zu RNA- und Proteinisolationen über. Fügen Sie zunächst 10 Mikroliter Beta-Mercaptoethanol für jeden Milliliter RLT-Puffer hinzu. Berechnen Sie das Volumen des RLT-Puffers entsprechend einem Verhältnis von 23,3 Milliliter pro Milligramm Gewebe und fügen Sie das entsprechende Volumen des RLT-Puffers mit Beta-Mercaptoethanol mit gefrorenem Pulver in die Röhre ein.Wirbeln Sie die Probe bei 3.000 RPM für 10 Sekunden. Verwenden Sie einen Ein-Milliliter-Pipetter, um 10 Mal kräftig nach oben und unten zu pipette und die Probe 20 Sekunden lang bei 3.000 Umdrehungen wieder zu wirbeln. Zentrifugieren Sie bei 13.000 mal g für zwei Minuten und übertragen Sie 700 Mikroliter des Überstandes auf ein frisches Rohr.700 Mikroliter 70%Ethanol in diese Röhre geben und 700 Mikroliter der Probe auf eine RNA-Reinigungskolonne laden. Zentrifugieren Sie das Rohr mit einer Geschwindigkeit von mindestens 10.000 mal g für 30 Sekunden. Entsorgen Sie den Durchfluss und laden Sie den restlichen Teil der Probe 30 Sekunden lang auf die RNeasy-Säule und zentrieren Sie das Rohr wieder mit einer Geschwindigkeit von mindestens 10.000 mal g.Entsorgen Sie den Durchfluss und waschen Sie die Säule, indem Sie 700 Mikroliter RW1-Puffer hinzufügen und mindestens die Geschwindigkeit von 10.000 mal g für 30 Sekunden zentrifugieren. Bei der Durchführung der Option DNAse-Verdauung werden 350 Mikroliter RW1 vor der DNAse-Behandlung hinzugefügt. Und nach der Behandlung von DNAse werden weitere 350 Mikroliter RW1 hinzugefügt.Waschen Sie dann die Säule zweimal, indem Sie 500 Mikroliter RPE-Puffer und Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit von mindestens 10.000 mal g für 30 Sekunden hinzufügen, um sicherzustellen, dass der Durchfluss jedes Mal verworfen wird. Danach trocknen Sie die Säule, indem Sie sie mit einer Geschwindigkeit von mindestens 10.000 mal g für zwei Minuten zentrieren. Elute die RNA durch Zugabe von 50 Mikroliter Wasser und Zentrifugieren mit einer Geschwindigkeit von mindestens 10.000 mal g für zwei Minuten.Sammeln Sie den Durchfluss und übertragen Sie ihn in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr. Bestimmen Sie die RNA-Menge mit der Methode der Wahl des Forschers und speichern Sie sie bei negativen 80 Grad Celsius vor der weiteren Analyse. Verdünnen Sie die 10-fache Zelllyse-Stammlösung zu einer 1X Zelllyse-Stammlösung mit Zellkultur-Wasser.Rekonstituieren Sie den Protease-Hemmer-Cocktail mit einem Milliliter Wasser, um einen 100-Fach-Protease-Hemmer-Bestand zu bilden. Fügen Sie 100 Milliliter Protease-Inhibitor zu 9,9 Milliliter 1X Zelllysepuffer hinzu, um eine 1X Endstocklösung zu erhalten. Fügen Sie vier Mikroliter eiskalte ZelllysePuffer für jedes Milligramm Gewebepulver und fügen Sie eine fünf Millimeter Edelstahl Perle in das Rohr.Wirbeln Sie das Rohr bei 3.000 U/min für 60 Sekunden. Übertragen Sie die Röhre auf nasses Eis und fahren Sie mit der nächsten Probe fort. Darüber hinaus können Forscher feststellen, dass das Platzieren der Box vertikal eine bessere Vermischung mit der Perle erleichtern kann.Nach einer Stunde zentrieren Sie die Rohre bei 10.000 mal g und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Übertragen Sie die Überräube in ein frisches Rohr, um sicherzustellen, dass die Fettschicht auf der Oberseite zu vermeiden. Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration.Jede Probe in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren zu führen und bei negativen 80 Grad Celsius aufbewahren, bis sie für weitere Analysen bereit sind. In dieser Studie wird eine kryogene Pulverisierungsmethode verwendet, um murine Pfoten zu verarbeiten, um die Ausbeute und Qualität der aus den Geweben extrahierten RNA oder Proteine zu verbessern und die Analyse molekularer Profile im Zusammenhang mit Entzündungsreaktionen zu ermöglichen. Eine repräsentative Gelbildvisualisierung zeigt die RNA, die aus den Vorderpfoten von CIA-Mäusen extrahiert wurde.Die 28S rRNA und die 18S rRNA Bänder zeigen an, dass alle Proben eine ausreichende Menge an intakter RNA haben. Hier wird eine repräsentative Streuungsdarstellung der gesamten Proteinkonzentrationen auf Basis der Protein-BCA-Analyse gezeigt. Die Gesamtproteinkonzentrationen von naiven Mäusen, CIA-Mäusen oder CIA-Mäusen unter verschiedenen Behandlungen sind gruppenübergreifend vergleichbar.Luminex-Analysen werden dann durchgeführt, um die Konzentrationen von entzündlichen Zytokinen und Chemokinen im Proteinextrakt zu bestimmen. Eine repräsentative Streuung der Konzentrationen normalisierter Zytokine und Chemokine zeigt, dass im Vergleich zu naiven Mäusen mehrere Zytokine bei CIA-Mäusen erhöht werden und die Behandlung mit Anti-IL17A-Antikörpern die Produktion mehrerer Zytokine erheblich hemmt. Die Mikroarray-Analyse wird durchgeführt, um Transkriptom-Änderungen in CIA und behandlungsbedingte Effekte zu bewerten.Eine repräsentative Heatmap-Diagramm von Genen deutlich erhöht bei CIA-Mäuseim Vergleich zu naiven Mäusen wird hier gezeigt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es für die Forscher wichtig, die Zeit zu minimieren, die die Röhre und das Pulver aus Trockeneis herausgehalten werden. Dies hilft, das Auftauen des Pulvers und nachfolgende Probleme mit der abgebauten RNA und dem Protein zu verhindern.Die hohe Qualität der durch diese Technik erzeugten molekularen Signaturen ermöglicht es den Forschern, das einzigartige Profil, das ein Therapeutisches vermittelt, abzuhören und ermöglicht darüber hinaus die Differenzierung von Mechanismen, die zur Behandlung von arthritischen Bedingungen eingesetzt werden können. Diese Technik könnte verwendet werden, um eine Reihe von dichten Geweben wie Ohren und Knochen zu extrahieren, um molekulare Signaturen in diesen Geweben von Interesse weiter zu bewerten. Das Verständnis, wie Therapeutika die molekularen Signaturen von Krankheiten modulieren, ermöglicht es uns, besser zu beurteilen, welche spezifischen Signalwege moduliert werden.Und vielleicht noch wichtiger, welche Wege nicht reguliert werden, wenn der therapeutische Mechanismus bewertet wird. Bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff und Trockeneis ist es unerlässlich, persönliche Schutzausrüstung einschließlich ordnungsgemäß bewerteter Handschuhe und Gesichtsschutzmittel zu verwenden. Die Exposition der Haut für mehr als ein paar Sekunden kann schwere Verbrennungen verursachen.Bei der Arbeit mit großen Mengen Trockeneis ist es wichtig, in einem gut belüfteten Bereich zu arbeiten, da Trockeneis Kohlendioxid freisetzt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Überprüfung der Rolle der Nasopharynx-assoziierte lymphoide Gewebe (NALT) in Maus auf Impfstoffe

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Einem Mausmodell für Pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Seiten

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intratracheale Verabreichung von<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In Mausmodelle zur Untersuchung Atemwegsentzündung

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Eine Methode zur Messung der Speicheldrüse Funktion bei Mäusen

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...