Name: a cryo-pulverization protocol for processing mouse paws to evaluate molecular pathways of tissue inflammation in a collagen induced arthritis model
Uploaded: 2019-10-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model at JoVE.co

המחברים רוצים להודות לאדית ג'סן על הסקירה הקריטית של כתב היד וNavin ראו וג טאון על תמיכתם בפרסום כתב היד הזה.

כל ניסויי החיות נערכו בהתאם למדיניות הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC) של ינסן R & D.
1. מקפיא קריוגני מיל מבוסס שיטת הטחינה
<ol><li>בסיום מחקר ה-CIA, עכברים להקריב עם 1.5% isof, ואחריו פריקה צוואר הרחם.</li>
	<li>ביום עיבוד רקמות, מראש לצנן את כל המכשירים (מלקחיים, שחיקה בבקבוקונ...

<ol>
	<li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis.">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).</li><li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis.">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).</li><li>Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+animal+models+in+predicting+genetic+susceptibility+to+complex+diseases+such+as+rheumatoid+arthritis.">The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).</li><li>David, C. S., Taneja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+major+histocompatibility+complex+genes+in+murine+collagen-induced+arthritis:+a+model+for+human+rheumatoid+arthritis.">Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis.</a> American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).</li><li>Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheumatoid+factors+in+mice.">Rheumatoid factors in mice.</a> Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).</li><li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis:+focus+on+interferon-gamma.">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).</li><li>Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticytokine+treatment+of+established+type+II+collagen-induced+arthritis+in+DBA/1+mice.+A+comparative+study+using+anti-TNF+alpha+anti-IL-1+alpha/beta,+and+IL-1Ra.">Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 39, 797-809 (1996).</li><li>Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+rheumatoid+arthritis.">Animal models of rheumatoid arthritis.</a> European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).</li><li>Williams, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-induced+arthritis+as+a+model+for+rheumatoid+arthritis.">Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis.</a> Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Blockade+of+TNF-alpha+and+IL-17A+Alleviates+Progression+of+Collagen-Induced+Arthritis+without+Causing+Serious+Infections+in+Mice.">Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice.</a> Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).</li></ol>

למרות שיש הרציונל המדעי חזק להעריך מסלולים מולקולריים ברקמות אמתחת, דיווחים רבים על פרופיל החיסון של מודל ה-CIA murine התמקדו דם היקפי, בעוד חלבונים ו-RNA ניתוח נתונים של כפות מודלק הם מוגבלים למדי. ישנן מספר סיבות אפשריות להטיה זו: מפרקי הקרסול של מוריין אינם גדולים מ-~ 2 ס מ; האזורים המושפעים מור?...

דלקת מפרקים שיגרונית (RA) היא מחלה דלקתית כרונית מערכתית עם דלקת סימטרי מתמשך במפרקים ומעורבות נוספת של איברים כגון העור, הלב, הריאות, ועיניים1. למרות הביטויים מערכתית של התגובה החיסונית ניכרת בחולים אנושיים, אחד הסימנים ההיכר של הפתולוגיה RA הוא הסתננות של תאים חיסוניים ברקמת אמתחת והתפשטות של תאים מערכת פיברונובקבוקון2.
בדומה RA אנושי, העכבר קולגן המושרה דלקת מפרקים (CIA) מודל מעורר דלקת רקמה חזקה עם תגובות החיסון פעיל ברקמות אמתחת ו מערכתית תאים. הרגישות של זנים שונים של העכבר כדי CIA מודל קישורים לקומפלקס היסטליקציות העיקריים (mhc) haplotype ו אנטיגן מסוים תא T אינטראקציה עם תא2,4. בנוסף, מסלולים פתוגניים רבים ב-RA האנושי, כולל הפקת נוגדן אוטומטי, מורכבות החיסון המערכת, הפעלת תא מיאלואידית, ביטויים פוליפרגניים והיווצרות pannoבקבוקון עם חדירה חיסונית מערכת, הם גם ברור במודל זה 5,6. החוקרים המועסקים במודל זה מבוסס היטב CIA כדי לחקור את ההשפעות של טיפולי ציטוקין אנטי דלקתיות7. ביולוגי רבים מאושרים עבור מחלות אוטואימוניות או דלקתיות, כגון אנטי-tnfα ו anti-IL-6, נמצאים יעיל במודל ה-CIA8,9.
יצירת פרופיל האינטראקציות של המערכת החיסונית ברקמת אמתחת היא חיונית כדי להבהיר מנגנונים מולקולריים הקשורים בפתוגנזה של RA. בסביבה הקלינית האנושית, מנהג נפוץ הוא לבצע ביופסיות מערכת המחט תחת הדרכתו של הדמיה אולטרסאונד. בהגדרות טרום קלינית, הארכיטקטורה הקטנה של המפרקים murine עושה הליכים ביופסיה הרבה יותר קשה אם לא בלתי אפשרי. לאחרונה, הדגמנו את הניצול של הדגם murine CIA כדי להעריך שילובים של תרופות כדי להשפיע על נקודות קצה שונים ולפתור את המחלה בגישה קומבינטורית10. מקפיא ההקפאה טחנת המכונה שיטת הטחינה היה מועסק כדי לעבד כפות מורתיות מודלק לתוך אבקות בסדר הומוגנית והקימו תהליכי הזרם כדי לחלץ RNA וחלבונים. שיטה זו מגינה על RNA וחלבונים מתהליכים degrative מגמטיים וכימיים ומאפשרת לנו להחיל שיטות אנליטיות מרובות על מקור יחיד הומוגניים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mm stainless steel bead</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>RNA qualification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CI</td>
			<td>Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis stock solution</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>Microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube centrifuge box</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5055</td>
			<td>Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Everlast 247 Variable Speed Rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BR5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>6875</td>
			<td>Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Vial</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>6801</td>
			<td>Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td>Kit for Total Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail set 1</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539131</td>
			<td>Protease Inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein BCA Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantigene Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>QP1013</td>
			<td>bDNA analysis Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>RNA extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BR5000</td>
			<td>Rocker/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-412</td>
			<td>Spatula for powder transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Bead</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>Bead for mixing during protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Extractor</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>6884</td>
			<td>Extractor for removing the top of grinding vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cryo-pulverization protocol for processing mouse paws to evaluate molecular pathways of tissue inflammation in a collagen induced arthritis model

יצירת פרופילים של שינויים מולקולריים ברקמות המקומיות חיונית להבנת המנגנון (ים) של פעולה של מועמדים טיפוליים בvivo. בתחום של מחקר דלקת פרקים, מחקרים רבים מתמקדים המפרקים דלקתית המורכבת תערובת מורכבת של עצם, סחוס, שריר, סטרומה תאים ותאים חיסוניים. כאן, הקמנו שיטה מכנית אמינה ואיתנה כדי לשבש כפות העכבר מודלק לתוך דגימות הומוגנית מרוסק בסביבה מבוקרת קריובית. חלבון ו-RNA lysates היו מעובדים כדי לאפשר את נקודות הקצה של פרוטאומית וטרנססקריפט ואפיון מולקולרי של מסלולים רלוונטיים למחלות ברקמה המקומית.

כאן, אנו מראים הדמיית תמונה מייצגת ג'ל של RNA שחולצו מן הכפות הקדמיות של עכברי ה-CIA באיור 2א. ה -28 rRNA ו-18 rRNA הלהקה מצביעים על כל הדגימות יש כמות מספקת של RNA שלם. לאחר מכן, אנו מציגים מגרש פיזור מייצג של ריכוזי חלבון סך מבוסס על ניתוח BCA חלבון בא...

Watch this Scientific Journal Video about A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model at JoVE.co

A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model

שיטה מתישה קריוגניים כדי לעבד כפות מורתיות באמצעות טחנת חנקן נוזלי המקפיא פותחה כדי לשפר את התשואה והאיכות של RNA או חלבון שחולצו מן הרקמות ולאפשר ניתוח של פרופילים מולקולריים הקשורים דלקתיות תגובות.

פרוטוקול הקפאה-מתישה לעיבוד כפות העכבר כדי להעריך מסלולים מולקולריים של דלקת רקמות במודל דלקת מפרקים קולגן המושרה

Profiling molecular changes in local tissues is crucial to understand the mechanism(s) of action of therapeutic candidates in vivo. In the field of ...

ההערכה של פרופילים מולקולריים ברקמות מקומיות היא צעד קריטי להבנת מנגנון הפעולה של תרופות פעילות כפי שהם מוערכים במודלים פרה-קליניים רלוונטיים למחלות. בתחום חקר דלקת פרקים, סביבת העניין של הרקמה המקומית היא המפרקים נושאי המשקל הקטנים המורכבים מתערובת מורכבת של עצם, סחוס, שרירים ותאי חיסון. כאן אנו מתארים שיטה אמינה וחזקה לשיבוש מכני ו/או עיסת סביבת רקמות מורכבת זו בסביבה מבוקרת קריוגנית.שיטה זו יכולה לשמש לאחר מכן כדי ליצור במורד הזרם proteomic ו מאמצי פרופיל שעתוק להקמת חתימות מולקולריות של מחלה ממקור מדגם אחיד אחד. שיטה זו מייצרת אבקה הומוגנית שלא כמו טכניקות ישנות רבות אחרות. בנוסף, הליך בידוד הטמפרטורה הישן מאפשר בידוד של רנ"א באיכות גבוהה.שיטה זו יכולה לשמש לאחר מכן ליצירת פרופיל פרוטומי ותעתיק במורד הזרם המאפשר אפיון מולקולרי של מסלולי המחלה הרלוונטיים של עניין. שיטה זו יכולה לספק תובנות לכל תחום מחקר הנגזר חתימות מולקולריות מרקמות. השיטה יכולה להיות מורחבת לכל מערכת רקמות מורכבת שיש לה צפוף וקשה לניתק מרכיבים.למרות שלא הערכנו עד לנקודה זו, אנו יכולים לראות יישום פוטנציאלי לרקמות סחוס צפופות כמו אוזניים או עצמות. האופי הקריטי של העברת האבקה לצינורות לשקילה הוא משהו שלוקח תרגול. אם לוקחים יותר מדי זמן, האבקה תתחיל להפשיר ותהפוך לאמורפית.חשוב להגביל את מספר הדגימות ל- 10 עד 15 עד שתרגיש בנוח עם ההליך. ביום עיבוד הרקמות, prechill כל המכשירים הדרושים על קרח יבש במשך מינימום של 10 דקות. ללבוש כפפות תרמיות כדי למנוע פגיעה על ידי הקור הקיצוני.לאחר מכן, להעביר כל כף העכבר מוכן לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר נפרד מיד הצמד להקפיא חנקן נוזלי. אחסן את הכפות הקפואות ב-80 מעלות צלזיוס שליליות. כאשר מוכן להמשיך, למלא טחנת מקפיא עם חנקן נוזלי ולתת לו לצייד לפחות 10 דקות.מניחים את המדגם לא מעבד על קרח יבש ולשמור אותו שם כדי למנוע הקפאת / הפשרה מחזורים. ואז להעביר כפה אחורית אחת לתוך בקבוקון טחינה פוליקרבונט גדול מקורר מראש עם תקע פלדה התחתון. הכנס את משפיע הפלדה המצונן מראש וסגור את בקבוקון שחיקת הפוליקרבונט עם תקע הפלדה העליון המצונן מראש.מעבירים את בקבוקוני שחיקת הפוליקרבונט הגדולים עם הדגימות לטחנת המקפיא שמולאה מראש וסגרו את המכסה עם אבזם הגומי שנמצא בחזית המכשיר. תן לדגימות להתקרר בחנקן הנוזלי לדקה אחת. לאחר מכן, הגדר את טחנת המקפיא לתוכנית דקה אחת עם 10 מחזורים לשנייה.לחץ על כפתור הריצה והמתן עד שטחנת המקפיא תשלים את המחזור שלה. לאחר מכן, לפתוח את המכסה של טחנת המקפיא ולה להוציא את בקבוקון שחיקה פוליקרבונט גדול. מניחים את בקבוקון השחזה לתוך מחלץ ולהסיר את תקע הפלדה העליון על ידי הצבת לחץ כלפי מטה על הידית השחורה עד תקע הפלדה מחליק מתוך צינור פוליקרבונט.מעבירים את בקבוקון הטחינה שנפתח לקרח יבש ולהשתמש במקלות מצוננים מראש כדי להסיר את משפיע הפלדה. מעבירים את האבקה הקפואה לצינור חרוט מצונן מראש של 50 מיליליטר. לשקול בין 30 ל 50 מיליגרם של האבקה הקפואה לתוך צינור microcentrifuge שכבתי 1.5 מיליליטר עבור מיצוי RNA ובין 100 ל 200 מיליגרם עבור מיצוי חלבון.לאחסן את הדגימות מרוסקות ב 80 מעלות צלזיוס שלילי ולהמשיך בידודי RNA וחלבונים בתוך 24 שעות. ראשית, להוסיף 10 microliters של בטא-mercaptoethanol עבור כל מיליליטר של מאגר RLT. לחשב את הנפח של מאגר RLT המתאים ליחס של 23.3 מיליליטר למיליגרם של רקמה ולהוסיף את הנפח המתאים של מאגר RLT עם בטא-mercaptoethanol לצינור עם אבקה קפואה.Vortex המדגם ב 3, 000 סל"ד במשך 10 שניות. השתמש pipetter מיליליטר אחד כדי pipette למעלה ולמטה במרץ 10 פעמים מערבולת המדגם שוב ב 3, 000 סל"ד במשך 20 שניות. צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים g במשך שתי דקות ולהעביר 700 microliters של supernatant לצינור טרי.הוסף 700 microliters של 70%אתנול לצינור זה לטעון 700 microliters של המדגם על עמוד טיהור RNA. צנטריפוגה הצינור במהירות של לפחות 10,000 פעמים g במשך 30 שניות. השלך את הזרימה דרך לטעון את החלק הנותר של המדגם על העמוד RNeasy צנטריפוגה הצינור שוב במהירות של לפחות 10, 000 פעמים g במשך 30 שניות.השלך את הזרימה דרך ולשטוף את העמודה על ידי הוספת 700 microliters של חיץ RW1 וצנטריפוגה לפחות את המהירות של 10, 000 פעמים g במשך 30 שניות. אם ביצוע אפשרות DNAse עיכול, 350 microliters של RW1 מתווסף לפני טיפול DNAse. ולאחר טיפול DNAse, 350 microliters נוספים של RW1 מתווסף.לאחר מכן לשטוף את העמודה פעמיים על ידי הוספת 500 microliters של חיץ RPE וצנטריפוגה במהירות של לפחות 10, 000 פעמים g במשך 30 שניות הקפדה להשליך את הזרימה דרך בכל פעם. לאחר מכן, לייבש את הטור על ידי צנטריפוגה אותו במהירות של לפחות 10, 000 פעמים g במשך שתי דקות. אלוט RNA על ידי הוספת 50 microliters של מים צנטריפוגה במהירות של לפחות 10, 000 פעמים g במשך שתי דקות.לאסוף את הזרימה דרך ולהעביר אותו לצינור חדש 1.5 מיליליטר. לקבוע את כמות RNA באמצעות שיטת הבחירה של החוקר ולאחסן ב שלילי 80 מעלות צלזיוס לפני ניתוח נוסף. לדלל את פתרון מלאי תות התא 10X לפתרון מלאי תזה תא 1X עם מים כיתה תרבות התא.מחדש את קוקטייל מעכב פרוטאז להגדיר אחד עם מיליליטר אחד של מים כדי להפוך את מלאי מעכבי פרוטאז 100X. הוסף 100 מיליליטר של מעכב פרוטאז ל 9.9 מיליליטר של מאגר תות שדה תא 1X כדי להשיג פתרון מלאי סופי 1X. הוסף ארבעה microliters של חיץ תות שדה קר קרח עבור כל מיליגרם של אבקת רקמות ולהוסיף אחד חמישה מילימטר נירוסטה חרוז לצינור.מערבולת הצינור ב 3, 000 סל"ד במשך 60 שניות. מעבירים את הצינור לקרח רטוב וממשיכים לדגימה הבאה. בנוסף, החוקרים עשויים למצוא כי הצבת התיבה אנכית יכול להקל טוב יותר ערבוב עם חרוז.לאחר שעה אחת, צנטריפוגה הצינורות ב 10, 000 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מעבירים את העל-טבעיים לצינור טרי ומוודאים להימנע משכבת השומן בחלק העליון. לקבוע את ריכוז החלבון הכולל.Aliquot כל מדגם לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולאחסן אותם שלילי 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לבצע ניתוח נוסף. במחקר זה, שיטת עיסת קריוגניים משמשת לעיבוד כפות מורין על מנת לשפר את התשואה והאיכות של RNA או חלבון המופקים מהרקמות ולאפשר ניתוח של פרופילים מולקולריים הקשורים לתגובות דלקתיות. הדמיה ייצוגית של תמונת ג'ל מראה את ה-RNA המופק מכפות קדמיות של עכברי CIA.28S rRNA ו 18S rRNA להקות עולה כי כל הדגימות יש כמות מספקת של RNA שלם. חלקת פיזור מייצגת של ריכוזי החלבון הכוללים המבוססים על ניתוח חלבון BCA מוצגת כאן. ריכוזי החלבון הכוללים מעכברים נאיביים, עכברי CIA או עכברי CIA תחת טיפולים שונים דומים בין קבוצות.ניתוחי Luminex נערכים לאחר מכן כדי לקבוע את הריכוזים של ציטוקיני דלקתיים כימוקין בתמצית החלבון. חלקת פיזור מייצגת של ריכוזי ציטוקינות וכמוקינות מנורמלות מגלה כי בהשוואה לעכברים נאיביים, מספר ציטוקינות מוגבהות בעכברי CIA וטיפול בנוגדן אנטי IL17A מעכב באופן משמעותי את הייצור של מספר ציטוקינות. ניתוח Microarray מבוצע כדי להעריך שינויים transcriptome ב-CIA ואפקטים הקשורים לטיפול.עלילה מייצגת של מפת חום של גנים גדלה באופן משמעותי בעכברים של ה-CIA בהשוואה לעכברים נאיביים מוצגת כאן. בעת ביצוע הליך זה, זה קריטי עבור החוקרים כדי למזער את הזמן כי הצינור והאבקה נשמרים מתוך קרח יבש. זה עוזר למנוע הפשרה של האבקה ובעיות הבאות RNA מושפל וחלבון.האיכות הגבוהה של החתימות המולקולריות הנוצרות על ידי טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את הפרופיל הייחודי שהטיפולי מקנה ומאפשרת עוד יותר את הבידול של מנגנונים שניתן להשתמש בהם לטיפול במצבים דלקתיים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחלץ מספר רקמות צפופות כמו אוזניים ועצמות כדי להעריך עוד יותר חתימות מולקולריות ברקמות אלה של עניין. הבנת האופן שבו טיפולית לווסת את החתימות המולקולריות של המחלה מאפשרת לנו להעריך טוב יותר אילו מסלולי איתות ספציפיים מווסתים.ואולי אפילו יותר חשוב, מה המסלולים אינם מוסדרים עם המנגנון הטיפולי להיות מוערך. כאשר עובדים עם חנקן נוזלי וקרח יבש, חובה להשתמש בציוד מגן אישי כולל כפפות מדורגות כראוי ומגני פנים. חשיפה של העור במשך יותר מכמה שניות עלולה לגרום לכוויות חמורות.כאשר עובדים עם כמויות גדולות של קרח יבש, חשוב לעבוד באזור מאוורר היטב כמו קרח יבש משחרר פחמן דו חמצני.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

לבחון את תפקידה של רקמות האף והלוע הקשורים Lymphoreticular (NALT) בתגובות עכבר לחיסונים

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

מודל של עכברים של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים ומערכתיים

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

מנהל Intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר Airway דלקת

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...