Name: a cryo-pulverization protocol for processing mouse paws to evaluate molecular pathways of tissue inflammation in a collagen induced arthritis model
Uploaded: 2019-10-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model at JoVE.co

Yazarlar edith Janssen el yazması ve Navin Rao ve Jennifer Towne eleştirel inceleme için bu makalenin yayınlanmasına destek için teşekkür etmek istiyorum.

Tüm hayvan deneyleri Janssen Ar-Ge Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) politikaları doğrultusunda yapılmıştır.
1. Kriyojenik Dondurucu Değirmen bazlı Pulverizasyon Yöntemi
<ol><li>CIA çalışmasının sona ermesiyle, %1.5 isofluran ile kurban fareleri ve ardından servikal çıkış lar devam eder.</li>
	<li>Doku işleme gününde, en az 10 dakika boyunca kuru buz üzerinde tüm aletleri (spatulalar, öğütme şişeleri, vb.) önceden soğutun.</li>
	<li><strong ...

<ol>
	<li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis.">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).</li><li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis.">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).</li><li>Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+animal+models+in+predicting+genetic+susceptibility+to+complex+diseases+such+as+rheumatoid+arthritis.">The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).</li><li>David, C. S., Taneja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+major+histocompatibility+complex+genes+in+murine+collagen-induced+arthritis:+a+model+for+human+rheumatoid+arthritis.">Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis.</a> American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).</li><li>Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheumatoid+factors+in+mice.">Rheumatoid factors in mice.</a> Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).</li><li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis:+focus+on+interferon-gamma.">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).</li><li>Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticytokine+treatment+of+established+type+II+collagen-induced+arthritis+in+DBA/1+mice.+A+comparative+study+using+anti-TNF+alpha+anti-IL-1+alpha/beta,+and+IL-1Ra.">Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 39, 797-809 (1996).</li><li>Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+rheumatoid+arthritis.">Animal models of rheumatoid arthritis.</a> European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).</li><li>Williams, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-induced+arthritis+as+a+model+for+rheumatoid+arthritis.">Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis.</a> Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Blockade+of+TNF-alpha+and+IL-17A+Alleviates+Progression+of+Collagen-Induced+Arthritis+without+Causing+Serious+Infections+in+Mice.">Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice.</a> Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).</li></ol>

Sinovyal dokularda moleküler yolları değerlendirmek için güçlü bir bilimsel mantık olmasına rağmen, murine CIA modelinin immün profilleme birçok rapor periferik kan üzerinde duruldu, iltihaplı pençeleri protein ve RNA analiz verileri oldukça sınırlıdır iken. Bu önyargı için birkaç olası nedeni vardır: murine ayak bileği eklemleri ~ 2 cm daha büyüktür; etkilenen alanlar genellikle doku öğütücüler, havaneli ve harç, silika boncuk bozulması, triturasyon veya enzimatik sindirim gibi gelen...

Romatoid artrit (RA) eklemlerde kalıcı simetrik sinovit ve deri, kalp, akciğer ve göz gibi organların ekstra eklem tutulumu ile kronik sistemik inflamatuar bir hastalıktır1. Bağışıklık yanıtının sistemik bulguları insan hastalarda belirgin olmakla birlikte, RA patolojisinin özelliklerinden biri sinovyal dokuda immün hücrelerin infiltrasyonu ve sinovyal fibroblast hücrelerinin çoğalmasıdır2.
Insan RA benzer, fare kollajen indüklenen artrit (CIA) modeli sinovyal dokular ve sistemik bölmelerde aktif bağışıklık yanıtları ile güçlü doku iltihabı ortaya çıkarır. Cia modeline farklı fare suşlarının duyarlılığı Majör Histokompatibilite Kompleksi (MHC) haplotip ve antijen spesifik T hücresi ve B hücre etkileşimleri3,4bağlantılar . Buna ek olarak, otoantikor üretimi, immün kompleks birikimi, miyeloid hücre aktivasyonu, poliartiküler bulgular ve sinovyal immün infiltrasyon ile pannus oluşumu da dahil olmak üzere insan RA birçok patojenik yollar da bu modelde belirgindir 5,6. Müfettişler anti-inflamatuar sitokin tedavileri etkilerini araştırmak için bu köklü CIA modeli istihdam var7. Anti-TNFα ve anti-IL-6 gibi otoimmün veya inflamatuar hastalıklar için onaylanmış birçok biyolojik, CIA modeli nde etkili olduğu bulunmuştur8,9.
Sinovyal dokuda bağışıklık sisteminin etkileşimlerinin profilini ra patogenezi ile ilişkili moleküler mekanizmaları açıklamak için çok önemlidir. İnsan klinik ortamında, yaygın bir uygulama ultrason görüntüleme gözetiminde iğne sinovyal biyopsi yapmaktır. Preklinik ortamlarda, murine eklemlerin küçük mimarisi imkansız olmasa bile biyopsi prosedürleriçok daha zor hale getirir. Son zamanlarda, farklı uç noktaları etkilemek ve bir kombinatoryal yaklaşım10hastalığı çözmek için ilaçların kombinasyonları değerlendirmek için murine CIA modelinin kullanımını gösterdi. Bir kriyojenik dondurucu değirmen tabanlı pulverizasyon yöntemi homojen ince tozlar içine iltihaplı murine pençeleri işlemek için kullanılan ve RNA ve proteinleri ayıklamak için aşağı süreçleri kuruldu. Bu yöntem, RNA ve proteini enzimatik ve kimyasal degratif proseslerden korur ve tek bir homojenize örnek kaynağına birden fazla analitik yöntem uygulamamızı sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mm stainless steel bead</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>RNA qualification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CI</td>
			<td>Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis stock solution</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>Microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube centrifuge box</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5055</td>
			<td>Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Everlast 247 Variable Speed Rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BR5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>6875</td>
			<td>Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Vial</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>6801</td>
			<td>Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td>Kit for Total Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail set 1</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539131</td>
			<td>Protease Inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein BCA Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantigene Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>QP1013</td>
			<td>bDNA analysis Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>RNA extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BR5000</td>
			<td>Rocker/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-412</td>
			<td>Spatula for powder transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Bead</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>Bead for mixing during protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Extractor</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>6884</td>
			<td>Extractor for removing the top of grinding vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cryo-pulverization protocol for processing mouse paws to evaluate molecular pathways of tissue inflammation in a collagen induced arthritis model

Lokal dokularda moleküler değişikliklerin profilini çıkarmak, terapötik adayların in vivo eylem mekanizmasını anlamak için çok önemlidir. Artrit araştırma alanında, birçok çalışma kemik, kıkırdak, kas, stromal hücreleri ve bağışıklık hücrelerinin karmaşık bir karışımından oluşan iltihaplı eklemler üzerinde durulmuştur. Burada, iltihaplı fare patilerini kriyojenik kontrollü bir ortamda homojen toz haline getirmek için güvenilir ve sağlam bir mekanik yöntem oluşturduk. Proteomik ve transkripsiyonel uç noktaları ve lokal dokudaki ilgili hastalık yollarının moleküler karakterizasyonu için protein ve RNA lysates işlendi.

Burada, Şekil 2A'daCIA farelerinin ön pençelerinden çıkarılan RNA'nın temsili bir jel görüntü görselleştirmesini gösteriyoruz. 28S rRNA ve 18S rRNA bandı tüm numunelerin yeterli miktarda sağlam RNA'ya sahip olduğunu göstermektedir. Daha sonra Şekil 2B'deprotein BCA analizine dayalı toplam protein konsantrasyonlarının temsili bir dağılım çizimi gösteriş. Çeşitli tedav...

Watch this Scientific Journal Video about A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model at JoVE.co

A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model

Dokulardan çıkarılan RNA veya proteinin verimini ve kalitesini artırmak ve inflamatuar profillerle ilişkili moleküler profillerin analizini sağlamak için sıvı nitrojen dondurucu değirmeni kullanarak murine patilerini işlemek için kriyojenik pulverizasyon yöntemi geliştirilmiştir. Yanıt.

Kollajen Kaynaklı Artrit Modelinde Doku İltihabının Moleküler Yollarını Değerlendirmek Için Fare Patilerinin İşlenmesi için Kriyo-pulverizasyon Protokolü

Profiling molecular changes in local tissues is crucial to understand the mechanism(s) of action of therapeutic candidates in vivo. In the field of ...

Lokal dokularda moleküler profillerin değerlendirilmesi, hastalıkla ilgili preklinik modellerde değerlendirilen aktif ilaçların etki mekanizmasını anlamak için kritik bir adımdır. Artrit araştırma alanında, ilgi yerel doku ortamı kemik karmaşık bir karışımı oluşur küçük ağırlık taşıyan eklemler, kıkırdak, kas, ve bağışıklık hücreleri. Burada kriyojenik kontrollü bir ortamda bu karmaşık doku ortamının mekanik bozulması ve/veya pulverizasyonu için güvenilir ve sağlam bir yöntem tanımlıyoruz.Bu yöntem daha sonra tek bir tek tip örnek kaynaktan hastalığın moleküler imzaları oluşturmak için aşağı proteomik ve transkripsiyonel profil oluşturma çabaları oluşturmak için kullanılabilir. Bu yöntem diğer birçok eski tekniklerin aksine homojen bir toz oluşturur. Ayrıca, eski sıcaklık yalıtım prosedürü yüksek kaliteli RNA izolasyon sağlar.Bu yöntem daha sonra ilgili hastalık yollarının moleküler karakterizasyonu sağlayan downstream proteomik ve transkripsiyonel profil oluşturma için kullanılabilir. Bu yöntem dokulardan moleküler imza elde eden herhangi bir araştırma alanına anlayışlar sağlayabilir. Bu yöntem, yoğun ve bileşenleri ayırması zor olan karmaşık doku sistemine genişletilebilir.Bu noktaya kadar değerlendirmemiş olsak da, kulak veya kemik gibi yoğun kıkırdak dokularına potansiyel uygulama görebiliriz. Tozutartım için tüplere aktarmanın zaman açısından kritik doğası pratik gerektiren bir şeydir. Çok fazla zaman alınırsa, toz çözülmeye başlar ve amorf olur.İşlemi rahat edene kadar örnek sayısını 10 ile 15 arasında sınırlamak önemlidir. Doku işleme gününde, en az 10 dakika boyunca kuru buz üzerinde gerekli tüm aletleri önceden soğutun. Aşırı soğuktan zarar görmemek için termal eldiven giyin.Daha sonra, hazırlanan fare pençesinin her birini ayrı bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hemen sıvı nitrojende dondurun. Donmuş pençeleri 80 santigrat derecede saklayın. Devam etmeye hazır olduğunuzda, sıvı nitrojen ile bir dondurucu değirmen doldurun ve en az 10 dakika boyunca denge sağlar.İşlenmemiş numuneyi kuru buzüzerine yerleştirin ve donma/çözülme döngülerini önlemek için orada tutun. Sonra bir alt çelik fiş ile önceden soğutulmuş büyük polikarbonat taşlama şişe içine bir arka pençe aktarın. Önceden soğutulmuş çelik darbeciyi takın ve polikarbonat öğütme şişesini önceden soğutulmuş üst çelik fiş ile kapatın.Numuneler ile birlikte büyük polikarbonat öğütme şişelerini önceden doldurulmuş dondurucu değirmenine aktarın ve kapağı enstrümanın önünde bulunan kauçuk tokayla kapatın. Numuneler bir dakika sıvı nitrojen içinde soğumaya bırakın. Daha sonra, dondurucu değirmenini saniyede 10 döngü ile bir dakikalık programa ayarlayın.Çalıştır düğmesine basın ve dondurucu değirmeninin döngüsünü tamamlamasını bekleyin. Bundan sonra, dondurucu değirmenkapağını açın ve büyük polikarbonat taşlama şişesini çıkarın. Taşlama şişesini bir çıkarıcıya yerleştirin ve çelik fiş polikarbonat tüpten kayana kadar siyah sapa aşağı doğru basınç koyarak üst çelik fişi çıkarın.Açılan taşlama şişesini kuru buzüzerine aktarın ve çelik darbeciyi çıkarmak için önceden soğutulmuş çalgıları kullanın. Dondurulmuş tozu önceden soğutulmuş 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. RNA ekstraksiyonu için 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 30 ila 50 miligram ve protein ekstraksiyonu için 100 ila 200 miligram arasında tartın.Toz haline getirilmiş numuneleri negatif 80 santigrat derecede saklayın ve 24 saat içinde RNA ve protein izolasyonlarına ilerleyin. İlk olarak, RLT tampon her mililitre için beta-mercaptoethanol 10 mikrolitre ekleyin. Doku miligramı başına 23,3 mililitrelik bir orana karşılık gelen RLT tampon hacmini hesaplayın ve dondurulmuş toz ile tüpe beta-merkaptoetanol ile UYGUN RLT tampon hacmini ekleyin.10 saniye boyunca 3, 000 RPM'de numuneyi girdaplayın. Bir mililitrelik pipetter kullanarak 10 kez yukarı ve aşağı inip, numuneyi 20 saniye boyunca 3.000 RPM'de tekrar girdaplayın. Santrifüj 13, 000 kez iki dakika için g ve yeni bir tüp için supernatant 700 mikrolitre aktarın.Bu tüpe 700 mikrolitre etanol ekleyin ve numunenin 700 mikrolitresini bir RNA arıtma sütununa yükleyin. Tüpü en az 10,000 kez g hızda 30 saniye santrifüj edin. Akış boyunca atın ve rneasy sütun üzerine numunenin kalan kısmını yükleyin ve 30 saniye boyunca en az 10,000 kez g hızda tekrar tüp santrifüj.Akış tan atın ve 700 mikrolitre RW1 tamponu ekleyerek ve en az 10, 000 kez g hızını 30 saniye boyunca santrifüj ederek kolonu yıkayın. DNAse sindirim seçeneği gerçekleştirilmesi durumunda, DNAse tedavisinden önce 350 mikrolitre RW1 eklenir. Ve DNAse tedavisinden sonra, rw1 ek bir 350 mikrolitre eklenir.Daha sonra en az 10,000 kez g hızında 500 mikrolitre RPE tampon ve santrifüj ekleyerek sütunu iki kez yıkayın ve her seferinde akışı atmasını önleyin. Bundan sonra, iki dakika boyunca en az 10,000 kez g hızda santrifüj ederek sütun kuru. RNA'yı 50 mikrolitre su ekleyerek ve en az 10,000 kez g hızında iki dakika santrifüj ederek eute.Akış toplamak ve yeni bir 1.5 mililitrelik tüp aktarın. Daha fazla analiz den önce araştırmacının seçim yöntemini kullanarak RNA miktarını belirleyin ve negatif 80 santigrat derecede depolayın. Hücre kültürü sınıf su ile 1X hücre lisis stok çözeltisi 1X hücre lisis stok çözeltisi seyreltin.100X proteaz inhibitör stok yapmak için su bir mililitre ile proteaz inhibitör kokteyl seti yeniden. 1X son stok çözeltisi elde etmek için 1X hücreli lysis tampon9.9 mililitre proteaz inhibitörü 100 mililitre ekleyin. Doku tozu her miligram için buz gibi hücre lisis tampon dört mikrolitre ekleyin ve tüp için bir beş milimetre paslanmaz çelik boncuk ekleyin.Tüpü 3,000 RPM'de 60 saniye boyunca girdaplayın. Tüpü ıslak buza aktarın ve bir sonraki örneğe devam edin. Ayrıca, araştırmacılar kutudikey yerleştirerek boncuk ile daha iyi karıştırma kolaylaştırabilir bulabilirsiniz.Bir saat sonra tüpleri 10,000 kez g ve 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüj edin. Üst teki yağ tabakasından kaçınmak için süpernatantları taze bir tüpe aktarın. Toplam protein konsantrasyonu belirleyin.Aliquot her örnek 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpler içine ve negatif 80 santigrat derece daha fazla analiz gerçekleştirmek için hazır olana kadar saklayın. Bu çalışmada, dokulardan çıkarılan RNA veya proteinin verimini ve kalitesini artırmak ve inflamatuar yanıtlarla ilişkili moleküler profillerin analizini sağlamak için rinpatilerin işlenmesi nde kriyojenik pulverizasyon yöntemi kullanılmıştır. Temsili bir jel görüntü görselleştirme CIA farelerin ön pençeleri çıkarılan RNA gösterir.28S rRNA ve 18S rRNA bantları tüm örneklerin yeterli miktarda sağlam RNA'ya sahip olduğunu gösterir. Protein BCA analizine dayalı toplam protein konsantrasyonlarının temsili dağılım konusu burada gösterilmiştir. Çeşitli tedaviler altında naif fareler, CIA fareler veya CIA fareler toplam protein konsantrasyonları gruplar arasında karşılaştırılabilir.Luminex analizleri daha sonra protein ekstresindeki inflamatuar sitokin ve kemokin konsantrasyonlarını belirlemek için yapılır. Normalleştirilmiş sitokin ve kemokin konsantrasyonlarının temsili bir dağılım arsa naif fareler ile karşılaştırıldığında, birkaç sitokinler CIA farelerde yüksek ve anti-IL17A antikor ile tedavi önemli ölçüde çeşitli sitokinlerin üretimini inhibe ortaya koymaktadır. CIA'deki transkripsiyon değişikliklerini ve tedaviye bağlı etkileri değerlendirmek için mikrodizi analizi yapılır.Burada, CIA farelerinde saf farelere kıyasla önemli ölçüde artmış genlerin temsili bir ısı haritası çizimi gösterilmiştir. Bu işlemi gerçekleştirirken, araştırmacıların tüp ve tozun kuru buzdan uzak tutulduğu süreyi en aza indirmeleri çok önemlidir. Bu, tozun erimesini ve bozulmuş RNA ve proteine karşı sonraki sorunları önlemeye yardımcı olur.Bu teknik tarafından üretilen moleküler imzaların yüksek kalitesi araştırmacıların bir terapötik verecek benzersiz profili sorgulamak için izin verir ve daha artritik koşulları tedavi etmek için kullanılabilecek mekanizmaların farklılaşması için izin verir. Bu teknik daha fazla ilgi bu dokularda moleküler imzaları değerlendirmek için kulak ve kemik gibi yoğun dokuların bir dizi ayıklamak için kullanılabilir. Tedavinin hastalığın moleküler izlerini nasıl modüle ettiğini anlamak, hangi özel sinyal yollarının modüle edilir olduğunu daha iyi değerlendirmemizi sağlar.Ve belki de daha da önemlisi, hangi yollar değerlendirilmekte olan terapötik mekanizma ile düzenlenir değildir. Sıvı nitrojen ve kuru buz ile çalışırken, uygun derecelendirilmiş eldiven ler ve yüz kalkanları da dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman kullanmak zorunludur. Birkaç saniyeden fazla cilt maruz kalma ciddi yanıklara neden olabilir.Kuru buz büyük miktarlarda çalışırken, kuru buz karbondioksit bültenleri gibi iyi havalandırılan bir alanda çalışmak önemlidir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Aşılar Fare yanıtlar içinde Nazofaringeal ilişkili lenforetiküler Doku (NALT) Rolü incelenmesi

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Lokal ve sistemik Yer de patojen kaynaklı kronik enflamasyon Fare Modeli

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

intra-trakeal İdaresi<em&gt; Haemophilus influenza</em&gt; Fare Modelleri Havayolu inflamasyonu Eğitim için

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Tükürük bezi işlevi farelerde ölçülmesi için bir yöntem

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...