Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

[دينل] كان ساندت بالجامعة [نورث كرولينا] في كنيسة صغيرة تل ([أونك]) مدرسة الطبّ كسيمونز طالبة. وحظيت هذه الاستجابة بدعم من المنحة المقدمة من لجنة الأمم المتحدة للاستجابة إلى البيئة R25 GM089569. تم دعم العمل باستخدام المرفق الأساسي للميكروسكوب مركز علم الأعصاب التابع لقيادة الأمم المتحدة، جزئياً، بتمويل من منحة دعم مركز العلوم العصبية التابع للمعهد الوطني للصحة الوطنية - NINDS P30 NS045892، ومنحة دعم مركز أبحاث الإعاقة الفكرية والتنموية التابع للمعهد الوطني للصحة الوطنية التابع للمعهد الوطني للصحة الوطنية HD079124.

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة جامعة كارولينا الشمالية في لجنة تشابل هيل للعناية بالحيوان واستخدامه (IACUC).
1. تشريح الدماغ وثقافة الخلايا النجمية الماوس الأولية
ملاحظة: تم تكييف البروتوكول التالي من الأساليب المنشورة، والذي يتبع الإجراء الأصلي الذ...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+mammalian+development+and+disease.">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li><li>Allaman, I., B&#233;langer, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-neuron+metabolic+relationships:+for+better+and+for+worse.">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li><li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination.">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li><li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+Synapse+Formation,+Function,+and+Elimination.">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).</li><li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

هنا، ونحن نصف نهج تجريبي للتعبير عن، تصور، وتتبع الفلورسنت الموسومة العضيات والبروتينات غشاء ذات أهمية باستخدام مجهريالفيديو الفاصل الزمني في عالية النقاء الأولية الماوس القشرية MD astrocytes. كما نحدد منهجية لقياس ديناميات الجسيمات. التصور المباشر للبروتين وديناميات الجهاز ية في الخلايا ال...

الخلايا النجمية هي الخلايا الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي للبالغين، حيث أنها تؤدي وظائف تنموية ومنزلية فريدةمننوعها 1. Astrocytes تحوير تطوير متشابك من خلال الاتصال المباشر مع محطات ما قبل وpostsynaptic كجزء من متشابك ثلاثي الأطراف، والذي يحتوي على مستقبلات الناقل العصبي، وناقلات، وجزيئات التصاق الخلايا التي تسهل تشكيل متشابك والخلايا العصبية-astrocyte الاتصالات2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا النجمية تتحكم بنشاط في انتقال متشابك ومنع السمية الطاردة للخلايا العصبية عن طريق إزالة الناقلات العصبية المحفزة بسرعة من المشقوق متشابك، وإعادة تدوير الناقلات العصبية، والمشاركة في تقليم متشابك3 , 4 , 5 , 6.لتمكين هذه الوظائف التفاعلية للغاية، والخلايا النجمية التواصل فيما بينها، مع الخلايا الدبقية الأخرى، ومع الخلايا العصبية من خلال بروتينات الغشاء المتخصصة، بما في ذلك جزيئات التصاق الخلية، aquaporins، قنوات أيون، الناقل العصبي، وجزيئات تقاطع الفجوة. الخلايا النجمية تغير بنشاط مستويات سطح هذه البروتينات استجابة للتقلبات في بيئتها داخل الخلايا وغير الخلوية7. وعلاوة على ذلك، فإن التغيرات في مستويات وتوزيع الميتوكوندريا، قطرات الدهون، والعضيات المهينة وإعادة التدوير تحوير إمدادات الطاقة، وتوافر المستقلب، وعمليات المقاصة الخلوية التي تعتبر ضرورية لوظيفة الخلايا النجمية و بقاء.
يتم تسهيل التغيرات الديناميكية في الاتجار ببروتين الغشاء وorganelle وتحديد المواقع في الخلايا النجمية من خلال وظيفة منسقة من البروتينات الحركية ومحولات التي تعزز حركة البضائع8،9. وبالمثل، يتم تعديل مستويات السطح من بروتينات الغشاء من خلال الاستيعاب وإعادة التدوير الأحداث10. يتم نقل هذه الشحنات عن طريق شبكة معقدة من الأكتين، microtubules، وربما خيوط وسيطة المسارات8. تشير الدراسات المستندة إلى تلطيخ الفلورة المناعية للبروتين النهائي الملزم 1 (EB1)، الذي يتراكم في الأنابيب الدقيقة المتنامية بالإضافة إلى النهايات، إلى أنه في حزم الخلايا النجمية من الأنابيب الدقيقة تشع من النوى المحيطية وتمتد نهايتها الزائدة نحو محيط11. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص في الفحص الشامل لتنظيم وقطبية الأنابيب الدقيقة وغيرها من العناصر الخلوية الهيكلية باستخدام التصوير بالخلايا الحية. في حين أن العديد من الآليات الكامنة وراء ديناميات العضيات والبروتينات الغشاء قد درست على نطاق واسع في الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى، وحركة البضائع في الخلايا النجمية هو أقل فهما جيدا. ويستند معظم معرفتنا الحالية حول التغيرات في توزيع البروتين والجهاز في الخلايا النجمية على وضع العلامات التقليدية المستندة إلى الأجسام المضادة من إعداد ثابت، مما يحول دون الفحص المكاني والزمني الدقيق لديناميات البضائع7، 12.
هنا، ونحن نصف طريقة لتسمية البروتينات غشاء والعضيات للتصوير الحي في الثقافات الماوس التبويض ة الأولية عالية النقاء. باستخدام هذا البروتوكول، نقدم أمثلة نتتبع فيها التوطين الديناميكي للبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) - البروتينات الغشاء الموسومة في الخلايا النجمية المنقولة، بما في ذلك تقاطع الفجوة البروتين connexin 43 (Cx43-GFP) والأحماض الأمينية المحفزة الناقل 1 (EAAT1-GFP). كما نوصف استخدام مسبار حمضي فلورسنت لتصور العضيات الحمضية واتباع ديناميات الاتجار بها في الخلايا النجمية الحية. وأخيرا، نبين كيفية تحليل بيانات الفاصل الزمني لاستخراج وتقييم بارامترات النقل لفرادى الشحنات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

الخلايا النجمية هي من بين أنواع الخلايا الأكثر وفرة في الدماغ الكبار، حيث أنها تلعب أدوارا رئيسية في تعدد الوظائف. كلاعب مركزي في التوازن الدماغي، توفر الخلايا النجمية الخلايا العصبية مع الأيض الحيوي والمياه العازلة خارج الخلية، والأيونات، والغلوتامات. جزء لا يتجزأ من متشابك "ثلاثي الأطراف"، والخلايا النجمية هي أيضا حاسمة في تشكيل، وتقليم، والصيانة، وتعديل نقاط الاشتباك العصبي. لتمكين هذه الوظائف التفاعلية للغاية، والخلايا النجمية التواصل فيما بينها ومع الخلايا الدبقية الأخرى، والخلايا العصبية، والأوعية الدموية الدماغ، والبيئة خارج الخلية من خلال العديد من البروتينات غشاء المتخصصة التي تشمل الخلية جزيئات التصاق، aquaporins، قنوات أيون، الناقلالعصبي، وجزيئات تقاطع الفجوة. لدعم هذا التدفق الديناميكي، تعتمد الخلايا النجمية، مثل الخلايا العصبية، على النقل داخل الخلايا المنسق والصارم. وعلى عكس الخلايا العصبية، حيث تم تحديد الاتجار داخل الخلايا على نطاق واسع، فإن النقل القائم على الأنابيب الدقيقة في الخلايا النجمية كان أقل دراسة. ومع ذلك، فإن الاتجار الخارجي والداخلي لبروتينات غشاء الخلية ونقل الأعضاء داخل الخلايا ينظم البيولوجيا الطبيعية للخلايا النجمية، وغالبا ً ما تتأثر هذه العمليات بالمرض أو استجابة للإصابة. هنا نقدم بروتوكول اعلام يُقدم مباشرة للثقافة ذات جودة عالية من الخلايا النجمية، لتسمية البروتينات الفلكية والعضيات ذات الأهمية، وتسجيل ديناميات النقل داخل الخلايا باستخدام الفحص المجهري البؤري الفاصل زمنياً. كما نبين كيفية استخراج وتحديد معايير النقل ذات الصلة من الأفلام المكتسبة باستخدام برامج تحليل الصور المتاحة (أي ImageJ /FIJI) الإضافات.

بروتوكول لإنشاء الماوس الأولية MD astrocytes المبينة أعلاه ينبغي أن تسفر عن استنساخ، والثقافات ذات جودة عالية. على الرغم من أن الثقافات تحتوي في البداية على مزيج من الخلايا النجمية، والخلايا الليفية، وغيرها من الخلايا الغلية، بما في ذلك microglia وoligodendrocytes (الشكل1ثنائية، بيف</st...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

هنا نقوم بوصف طريقة التصوير الحي في المختبر لتصور النقل داخل الخلايا من العضيات والاتجار ببروتينات غشاء البلازما في الخلايا النجمية المورين. ويقدم هذا البروتوكول أيضا منهجية لتحليل الصور لتحديد مسارات نقل البضائع وحركيتها.

تصور وتحليل النقل داخل الخلايا من العضيات وغيرها من الشحنات في الخلايا النجمية

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

يمكن استخدام بروتوكولنا للتحقيق في حركية وتوطين العضيات الفلكية أو البروتينات تحت البيئات الخارجة عن الخلية والدول المرضية الخفيفة. على عكس الاستعدادات الثابتة MHA ، والتي توفر لقطات واحدة من توطين البروتين والعضية ، يمكن استخدام تقنية التصوير الحي لدينا لتحليل ديناميكيات الجسيمات في الخلايا الفلكية الحية الفردية. في اليوم السابق للبذور البذور transfection astrocytes في الكثافة المناسبة للتصوير في 24 إلى 48 ساعة بعد transfection.تخفيف مُكشف الشفط في متوسطة مصل أقل إلى التركيز التجريبي المناسب. تمييع خمسة ميكروغرام من الحمض النووي عالية النقاء في 250 ميكرولترات من متوسطة المصل المخفضة وإضافة خمسة ميكرولترات من كاشف محسن الشفط إلى الأنبوب. اخلطي كاشف الشفط مع حجم متساو من مزيج محسن الشفط بالحمض النووي وحضن المحل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة، وإزالة سوبرنانت من ثقافة الفلكية وإضافة 100 ميكرولترات من المزيج transfection قطرة إلى الخلايا. بعد ست ساعات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، استبدال مجمع transfection مع حجم مناسب من ثقافة الفلكية المتوسطة وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 إلى 72 ساعة إضافية. قبل 30 دقيقة من التصوير ، تمييع مسبار وضع العلامات الليفية المناسبة في 200 ميكرولترات من ثقافة الخلايا الفلكية المتوسطة إلى تركيز عمل من ميكرومولار واحد وتسمية الخلايا الفلكية مع مسبار لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.ثم غسل الخلايا مرة واحدة مع ثقافة astrocyte الدافئة المتوسطة واستبدال الغسيل مع المتوسطة التصوير. مباشرة بعد وضع العلامات التحقيق، ووضع حاوية ثقافة الفلكية في محول المناسبة على مرحلة المجهر واستخدام ضوء الفلورسينس EBI، وتحديد الخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية أو التحقيق. استخدم الكاميرا الرقمية لضبط إضاءة عينة الفلورسنت لتصور الخلايا المحددة وضبط التركيز والتكبير إلى خلية واحدة.ثم استخدم وظائف التكبير والتركيز المحدد للحصول على سلسلة زمنية تباعد Z-مكدس مفردة في تردد إطار واحد كل ثانيتين لفواصل زمنية تتراوح بين 300 و 500 ثانية. حفظ وتصدير الصور الفاصل الزمني كملفات مكدس AVI أو TIFF. لتحليل صور الفاصل الزمني، افتح تسلسل صورة الفاصل الزمني في ImageJ أو فيجي واستخدم أداة تقسيم القنوات لتقسيم القنوات.في صورة القناة الخضراء الثمانية بت، استخدم أداة الخط المجزأ لتتبع خط على طول مسارات الجسيمات باستخدام نفس الاتفاقية الاتجاهية المطلوبة لجميع الأفلام بحيث تكون القطبية متسقة داخل وعبر جميع الخلايا التي تجري دراستها. انقر نقرا مزدوجا فوق أداة الخط لضبط عرض الخط لتتناسب مع سمك المسار وتشغيل الماكرو رسم Kymo من البرنامج المساعد Kymo ToolBox باستخدام عرض خط من 10. ستظهر مطالبة تطالب بمعايرة الصورة في الزمان والمكان.بمجرد معايرتها، سيتم إنشاء كيموغرافات ويمكن حفظها كملفات TIFF. لتعيين مسارات الجسيمات، استخدم أداة الخط المجزأ لتتبع كل جسيم يدويًا في الكيموغراف طوال المدة الكاملة للاستحواذ واستخدام مدير عائد الاستثمار لتسجيل كل مسار جسيم كمنطقة ذات أهمية. حفظ جميع المناطق ذات الاهتمام لكل فيديو الفاصل الزمني لمزيد من التحليل وتشغيل ماكرو تحليل Kymo من البرنامج المساعد Kymo ToolBox.سيتم فتح نافذة تطلب تحديد الاتجاه الخارجي للحركة الجسيمات من نواة الخلية من الفائدة من القائمة المنسدلة. وينبغي تحديد سرعة الحد وفقا لحساسية البرنامج لكل شحنة ذات فائدة، وينبغي تعديل عرض الخط لتتناسب مع سمك كل مسار الجسيمات. وينبغي أن يكون سجل جميع البيانات والإحداثيات المستقرة للسجل لحساب مختلف بارامترات نقل البضائع.انقر فوق "حسناً". ثم يتم تجميع البيانات المحسوبة للمسارات الفردية لكل kymograph وحفظها في ملفات نصية خاصة بكل صورة. الجمع بين العلاج السيتوسين أرابينزيد مع استراتيجية تنقية على أساس اهتزاز يثري نقاء الثقافات الفلكية على البروتوكولات التقليدية التي تشمل خطوة تنقية فقط.يسمح التربيص الدهني القائم على التعبير العابر للبروتينات عند المستويات المثلى للتصوير بالخلايا الحية دون التسبب في السمية أو التأثير على قابلية الحياة للبروتينات الفلكية. وبالمثل، فإن استخدام مسبار الفلورسنت يسمح بالوسم السريع والفعال للعضيات الحمضية العضية الحامضة لتتبع ديناميات العضية والمركبات الفلكية. يمكن استخدام بيانات الفاصل الزمني من التصوير لإنشاء kymographs التي تتبع حركة البضائع في الزمان والمكان.في هذه الغرافيم، يتم تمثيل حركة البضائع المشار إليها بمسارات ذات منحدرات سالبة، بينما يتم تمثيل الحركة الرجعية بمسارات ذات منحدرات إيجابية. تظهر الـ"هاتينك" على أنها مسارات عمودية. في هذا التحليل، كشف القياس الكمي لتدفق شحنة معينة عبر منطقة من البضائع الفلكية عن اختلافات في النسبة المئوية للجسيمات الناصحة بين البضائع التي من المرجح أن تمثل حركة خط الأساس العادي في منطقة الفلكيات التي تم الحصول عليها من الأفلام.ويمكن أيضاً أن يستخدم رسم الخرائط الدقيقة للتغير في وضع X، Y على طول المقياس الزمني الكامل لكل جسيم يتم الحصول عليه من الميكوغراف، لتقييم معلمات الحركة الأخرى، مثل سرعة الشحن وطول المدى. وبما أن هذا البروتوكول يتطلب ثقافات استروcyست عالية الجودة وسمات فعالة للشحن، ينبغي تعديل وقت الحضانة وإعادة بناء الحمل عبر الجسم والجدول الزمني للاكتساب لكل بلازميد أو حمولة ذات فائدة. يمكن تعديل هذا البروتوكول لتوصيف أحداث النقل في الخلايا الفلكية استجابة لتلف الخلايا، أو السمية، أو الطفرات المسببة للأمراض، أو النشاط المتشابك، أو التغيرات في البيئة داخل الخلية أو خارج الخلية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

مضان الانتعاش بعد Photobleaching (FRAP) من البروتينات المرتبطة دلاليا الإسفار في العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الحصين مثقف

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

العزلة وثقافة الخلايا النجمية الماوس القشرية

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

التصوير الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; إشارات في الجسم المخطط النجمية من الفئران الكبار باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

تحليل الجذعية الصرف في الأعمدة والطبقات

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

والتصور وتصوير مباشر من العضيات أوليجوديندروسيتي في المخ أورجانوتيبيك الشرائح باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد والفحص المجهري [كنفوكل]

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

تحليل في الحجم والشكل واتجاهية شبكات من أستروسيتيس إلى جانب

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

تحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في الخلايا العصبية الجذعية المستحثة البشرية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية في الشلل النصفي التشنجي الوراثي

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

النقل المحوري للأرغنفيات في ثقافات الخلايا العصبية الحركية باستخدام نظام غرف السوائل الدقيقة

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

في في المختبر إسفين شريحة التحضير لتقليد في اتصال الدائرة العصبية فيفو

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...