Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

DNL blev støttet af University of North Carolina på Chapel Hill (UNC) School of Medicine som en Simmons-forsker. TWR blev understøttet af UNC PREP Grant R25 GM089569. Arbejde ved hjælp af UNC Neuroscience Center Microscopy Core facilitet blev støttet, delvis, ved at støtte fra NIH-NINDS Neuroscience Center support Grant P30 NS045892 og NIH-NICHD intellektuelle og udviklingsmæssige handicap Research Center støtte Grant U54 HD079124.

Alle dyr procedurer blev udført med godkendelse af University of North Carolina på Chapel Hill Animal Care og use Committee (IACUC).
1. Brain dissektion og kultur af primære mus astrocytter
NB: følgende protokol er blevet tilpasset fra offentliggjorte metoder, som følger den oprindelige procedure, der er udviklet af McCarthy og devellis13,14,15. Blandede cellekulturer af...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+mammalian+development+and+disease.">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li><li>Allaman, I., B&#233;langer, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-neuron+metabolic+relationships:+for+better+and+for+worse.">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li><li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination.">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li><li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+Synapse+Formation,+Function,+and+Elimination.">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).</li><li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

Her beskriver vi en eksperimentel tilgang til at udtrykke, visualisere og spore fluorescently mærkede organeller og membran proteiner af interesse ved hjælp af time-lapse video mikroskopi i høj renhed primær mus kortikale MD astrocytter. Vi skitserer også en metode til måling af partikel dynamik. Direkte visualisering af protein og organelle dynamik i primære astrocytter giver et kraftfuldt værktøj til at studere reguleringen af intracellulær transport i disse celler in vitro.
Metode...

Astrocytter er de mest rigelige celler i den voksne centrale nervesystem, hvor de udfører unikke udviklingsmæssige og homeostatiske funktioner1. Astrocytter moduter synaptisk udvikling gennem direkte kontakt med præ-og postsynaptiske terminaler som en del af Tri-Arts synapse, som indeholder neurotransmitter receptorer, transportører, og celle adhæsion molekyler, der letter synapse dannelse og neuron-astrocyt kommunikation2. Desuden, astrocytter aktivt kontrollere synaptisk transmission og forhindre neuronal excitotoksicitet ved hurtigt at fjerne excitatoriske neurotransmittere fra den synaptiske kløft, genbrug neurotransmittere, og deltager i synaptisk beskæring3 , 4 , 5 , 6. for at aktivere disse meget interaktive funktioner kommunikerer astrocytter indbyrdes, med andre gliale celler og med neuroner gennem specialiserede membran proteiner, herunder celle vedhæftnings molekyler, aquaporiner, ionkanaler, neurotransmitter transportører og Gap Junction molekyler. Astrocytter ændrer aktivt overflade niveauerne af disse proteiner som reaktion på udsving i deres intra-og ekstracellulære miljø7. Endvidere, ændringer i niveauer og fordeling af mitokondrier, lipid dråber, og nedbrydelse og genanvendelse organeller modutere energiforsyningen, metabolismen tilgængelighed, og cellulære clearing processer, der er afgørende for astrocyt funktion og Overlevelse.
De dynamiske ændringer i membran protein og organelle handel og positionering i astrocytter lettes ved den samordnede funktion af motor proteiner og adaptere, der fremmer lasten motilitet8,9. Tilsvarende er overflade niveauer af membran proteiner moduleret gennem internalisering og genbrug begivenheder10. Disse Cargos transporteres via et indviklet netværk af actin, microtubuler, og eventuelt mellemliggende filamenter spor8. Undersøgelser baseret på immunofluorescens farvning af bindende protein 1 (EB1), som akkumuleres ved den voksende mikrotubule plus ender, tyder på, at i astrocytter bundter af microtubuli udstråler ud fra perinucleus og udvide deres plus ende mod periferi11. Men, en omfattende undersøgelse af organisation og polaritet af microtubuler og andre cytoskelet elementer ved hjælp af Live-Cell Imaging er stadig mangler. Mens mange af de mekanismer, der ligger til grund for dynamikken i organeller og membran proteiner er blevet grundigt undersøgt i neuroner og andre celletyper, er Cargo motilitet i astrocytter mindre godt forstået. De fleste af vores nuværende viden om ændringer i protein og organelle fordeling i astrocytter er baseret på traditionelle antistof-baserede mærkning af fast præparat, som udelukker præcis rumlig og tidsmæssig undersøgelse af lasten Dynamics7, 12.
Her beskriver vi en metode til at mærke membran proteiner og organeller til levende billeddannelse i høj renhed primær mus astrocyt kulturer. Ved hjælp af denne protokol giver vi eksempler, hvor vi sporer den dynamiske lokalisering af grønt fluorescerende protein (gfp)-mærkede membran proteiner i transficeret astrocytter, herunder Gap Junction protein connexin 43 (Cx43-gfp) og excitatoriske aminosyre transporter 1 (EAAT1-GFP). Vi beskriver også brugen af en fluorescerende acidotropic sonde til at visualisere sure organeller og følge deres handel dynamik i levende astrocytter. Endelig viser vi, hvordan man analyserer tidsforskudt data for at udtrække og evaluere transport parametre for individuelle Cargos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

Astrocytter er blandt de mest udbredte celletyper i den voksne hjerne, hvor de spiller nøgleroller i en mangfoldighed af funktioner. Som en central aktør i hjernens homøostase leverer astrocytter neuroner med vitale metabolitter og buffer ekstracellulært vand, ioner og glutamat. En integreret del af "Tri-Arts" synapse, astrocytter er også afgørende i dannelsen, beskæring, vedligeholdelse, og graduering af synapser. For at aktivere disse meget interaktive funktioner kommunikerer astrocytter indbyrdes og med andre gliale celler, neuroner, hjernens vaskulatur og det ekstracellulære miljø gennem et væld af specialiserede membran proteiner, der omfatter celle adhæsionsmolekyler, aquaporiner, ionkanaler, neurotransmitter transportører og Gap Junction molekyler. For at støtte denne dynamiske flux, astrocytter, ligesom neuroner, stole på stramt koordineret og effektiv intracellulær transport. I modsætning til neuroner, hvor intracellulær handel er blevet udførligt afgrænset, microtubule-baserede transport i astrocytter har været mindre undersøgt. Ikke desto mindre, EXO-og endocytisk handel med celle membran proteiner og intracellulære organelle transport orkestrere astrocytter ' normale biologi, og disse processer er ofte påvirket i sygdom eller som reaktion på skade. Her præsenterer vi en ligetil protokol til kultur høj kvalitet murine astrocytter, at fluorescently label astrocytiske proteiner og organeller af interesse, og at registrere deres intracellulære transport dynamik ved hjælp af time-lapse confokale mikroskopi. Vi demonstrerer også, hvordan man udtrækker og kvantificerer relevante transport parametre fra de erhvervede film ved hjælp af tilgængelige billedanalyse software (dvs., ImageJ/FIJI) plugins.

Protokollen til oprettelse af primær mus MD astrocytter skitseret ovenfor bør give reproducerbare, høj kvalitet kulturer. Selv om kulturer oprindeligt indeholder en blanding af astrocytter, fibroblaster, og andre gliaceller celler, herunder microglia og oligodendrocytter (figur 1bi, BIV; røde pilespidser), tilsætning af Arac til den blandede kultur mellem DIV5-DIV7 minimerer spredningen af disse kontaminerende celler. Den kombinerede Arac behandling og ryste-baseret ren...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Her beskriver vi en in vitro-Live-imaging metode til at visualisere intracellulær transport af organeller og handel med plasma membran proteiner i murine astrocytter. Denne protokol præsenterer også en billedanalyse metode til at bestemme fragttransport ruter og kinetik.

Visualisering og analyse af intracellulær transport af organelles og andre Cargos i astrocytter

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Vores protokol kan bruges til at undersøge motilitet og lokalisering af astrocytiske organeller eller proteiner under kontrollerede ekstracellulære miljøer og milde sygdomsstater. I modsætning til MHA faste præparater, som giver enkelte snapshots af protein og organelle lokalisering, kan vores levende billeddannelse teknik bruges til at analysere partikeldynamik i de enkelte levende astrocytter. Dagen før transfektionsfrøet astrocytter ved den relevante tæthed til billeddannelse ved 24 til 48 timer efter transfektion.Lipofection reagens fortyndes i reduceret serummedium til den relevante eksperimentelle koncentration. Fortynde fem mikrogram høj renhed DNA i 250 mikroliter af reduceret serum medium og tilsæt fem mikroliter af lipofection forstærker reagens til røret. Bland lipofection reagens med et tilsvarende volumen af DNA lipofection forstærker mix og inkubere opløsningen i 15 minutter ved stuetemperatur.I slutningen af inkubationen fjernes supernatanten fra astrocytkulturen og der tilsættes 100 mikroliter af transfektionsblandingen dropwise til cellerne. Efter seks timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, erstatte transfektion kompleks med en passende mængde af astrocyt kultur medium og returnere cellerne til cellekultur inkubatoren i yderligere 24 til 72 timer. 30 minutter før billeddannelsen fortyndes en egnet lysosomal mærkningssonde i 200 mikroliter af astrocytkulturmedium til en fungerende koncentration af en mikromolar, og anset astrocytterne med en sonde i 30 minutter ved 37 grader Celsius.Vask derefter cellerne én gang med varm astrocyt kultur medium og erstatte vask med billedbehandling medium. Umiddelbart efter sondemærkningen skal astrocytkulturbeholderen ind i den relevante adapter på mikroskopstadiet og bruge EBI-fluorescenslys finde de celler, der udtrykker fluorescerende proteiner eller sonde. Brug det digitale kamera til at justere lysstofrøret for at visualisere de markerede celler og justere fokus og zoome ind på en enkelt celle.Brug derefter zoom- og bestemt fokusfunktioner til at anskaffe en enkelt Z-stack time-lapse-serie med en frekvens på en ramme hvert andet sekund for tidsintervaller på mellem 300 og 500 sekunder. Gem og eksportér time-lapse-billederne som AVI- eller TIFF-stakfiler. Hvis du vil analysere time-lapse-billederne, skal du åbne time-lapse-billedsekvensen i ImageJ eller Fiji og bruge splitkanalværktøjet til at opdele kanalerne.I billedet med otte bit grøn kanal skal du bruge værktøjet Segmenteret linje til at spore en linje langs partiklernes baner ved hjælp af den samme ønskede retningsbestemte konvention for alle film, så polariteten er ensartet i og på tværs af alle de celler, der undersøges. Dobbeltklik på stregværktøjet for at justere stregbredden, så den svarer til sporets tykkelse, og kør knappen Tegn Kymo på Kymo ToolBox-plugin'en ved hjælp af en stregbredde på 10. Der vises en meddelelse, hvor du bliver bedt om at kalibrere billedet i tid og rum.Når kymographs er kalibreret, genereres de og kan gemmes som TIFF-filer. Hvis du vil tildele partikelforløb, skal du bruge værktøjet Segmenteret linje til manuelt at spore hver partikel i kymographen i hele anskaffelsesperioden og bruge roi-lederen til at registrere hver partikelbane som et område af interesse. Gem alle de regioner af interesse pr hver time-lapse video til yderligere analyse og køre Analyze Kymo makro af Kymo ToolBox plugin.Et vindue åbnes og beder om at definere partikelbevægelsens udadgående retning fra kernen af den celle, der interesserer sig, fra rullemenuen. Grænsehastigheden skal defineres i henhold til softwarens følsomhed for hver af interesselast, og strækningens bredde skal justeres, så den svarer til tykkelsen af hver partikelbane. Log alle data og log ekstrapolerede koordinater skal være til beregning af de forskellige lasttransportparametre.Klik på Okay. De data, der beregnes for de enkelte spor, vil derefter blive samlet pr. kymograph og gemt i tekstfiler, der er specifikke for hvert billede. Ved at kombinere cytosin arabinoside behandling med rystende baseret rensning strategi beriger renheden af astrocyt kulturer over traditionelle protokoller, der omfatter rensning trin alene.Lipofection baseret transfection tillader forbigående udtryk for proteiner på niveauer, der er optimale for levende celle billeddannelse uden at forårsage toksicitet eller påvirker astrocyt levedygtighed. På samme måde gør brugen af en fluorescerende sonde det muligt hurtigt og effektivt at mærke sure endolysosomale organeller til sporing af organelledynamik og astrocytter. Time-lapse data fra billeddannelse kan bruges til at generere kymographs, der sporer last bevægelse i tid og rum.I disse kymographs repræsenteres den angivne lasts anterograde-bevægelse af baner med negative skråninger, mens tilbageskridtsbevægelsen repræsenteres af baner med positive skråninger. Stationære vesikler fremstår som lodrette baner. I denne analyse afslørede kvantificering af flux af en bestemt last gennem et område af astrocytet forskelle i procentdelen af modale partikler blandt laster, der sandsynligvis er repræsentative for deres normale base linje motilitet i den region af astrocyt, hvor filmene blev erhvervet.Den præcise kortlægning af ændringen i X, Y position langs fuld tidsskala for hver partikel fremstillet af kymograph kan også bruges til at evaluere andre bevægelsesparametre, såsom last hastighed og kørelængde. Da denne protokol kræver astrocytkulturer af høj kvalitet og effektiv lastmærkning, bør transfektionsreageindskuvningstiden og anskaffelsestidspunktet justeres for hver plasmid eller last af interesse. Denne protokol kan ændres til at karakterisere transport begivenheder i astrocytter som reaktion på celleskader, toksicitet, patogene mutationer, synaptisk aktivitet, eller ændringer i intra eller ekstracellulære miljø.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolering og Kultur Mouse Cortikale Astrocytes

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellulært Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i Striatal Astrocyter fra voksne mus ved hjælp af genetisk kodede Calcium Indikatorer

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokol til tredimensionel Konfokal Morfometrisk Analyse af Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse Dendritiske Morfologi i Kolonner og Lag

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering og Live Imaging af Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjerne skiver ved hjælp af Adeno-associeret Virus og konfokal mikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Analysere størrelse, form og retning for indtastning af netværk af koblede astrocytter

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse mitokondriel transport og morfologi i Human Induceret pluripotente stamceller-afledte neuroner i arvelige spastiske paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonal transport af organeller i motorneuronkulturer ved hjælp af microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Forberedelse til efterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...