Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

DNL werd gesteund door de University of North Carolina op Chapel Hill (UNC) school of Medicine als Simmons-geleerde. TWR werd ondersteund door UNC PREP Grant R25 GM089569. Werk met behulp van de UNC Neuroscience Center microscopie kern faciliteit werd ondersteund, gedeeltelijk, door financiering van de NIH-NINDS Neuroscience Center ondersteuning Grant P30 NS045892 en de NIH-NICHD intellectuele en ontwikkelingsstoornissen Research Center ondersteuning subsidie U54 HD079124.

Alle dier procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Universiteit van North Carolina bij Chapel Hill Animal Care and use Committee (IACUC).
1. hersen dissectie en cultuur van primaire muis astrocyten
Opmerking: het volgende protocol is aangepast aan de gepubliceerde methoden, die de oorspronkelijke procedure volgt die is ontwikkeld door McCarthy en devellis13,14,15</sup...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+mammalian+development+and+disease.">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li><li>Allaman, I., B&#233;langer, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-neuron+metabolic+relationships:+for+better+and+for+worse.">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li><li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination.">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li><li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+Synapse+Formation,+Function,+and+Elimination.">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).</li><li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

Hier beschrijven we een experimentele aanpak om fluorescently gelabelde organellen en membraan eiwitten van belang te uiten, visualiseren en volgen met behulp van time-lapse video microscopie in hoge zuiverheid primaire muis corticale MD astrocyten. We schetsen ook een methodologie voor het meten van de deeltjes dynamiek. Directe visualisatie van eiwitten en organel dynamica in primaire astrocyten biedt een krachtig hulpmiddel om de regulering van intracellulair transport in deze cellen in vitro te bestuderen.
<p cla...

Astrocyten zijn de meest voorkomende cellen in het centrale zenuwstelsel van de volwassene, waar ze unieke ontwikkelings-en homeostatische functies uitvoeren1. Astrocyten moduleren synaptische ontwikkeling door direct contact met pre-en postsynaptisch terminals als onderdeel van de Tri-partite Synapse, die bevat neurotransmitter receptoren, transporters, en celadhesie moleculen die Synapse vorming vergemakkelijken en neuron-astrocyten communicatie2. Bovendien, astrocyten actief controle synaptische transmissie en voorkomen neuronale excitotoxicity door het snel verwijderen van excitatory neurotransmitters uit de synaptische gespleten, recycling neurotransmitters, en deelnemen aan synaptische snoeien3 , 4 , 5 , 6. om deze zeer interactieve functies mogelijk te maken, communiceren astrocyten onderling, met andere gliacellen en met neuronen via gespecialiseerde membraan proteïnen, waaronder celadhesie moleculen, aquaporinen, ionenkanalen, neurotransmitter transporteurs, en gap junction moleculen. Astrocyten veranderen actief de oppervlakte niveaus van deze eiwitten in reactie op schommelingen in hun intra-en extracellulaire omgeving7. Bovendien, veranderingen in de niveaus en de verdeling van de mitochondriën, lipide druppeltjes, en degradatieve en recycling organellen moduleren energietoevoer, metaboliet beschikbaarheid, en cellulaire clearing processen die essentieel zijn voor de functie van de astrocyten en Overleving.
De dynamische veranderingen in membraan proteïne en organel-handel en positionering in astrocyten worden vergemakkelijkt door de gezamenlijke functie van motor eiwitten en adapters die de beweeglijkheid van de lading bevorderen8,9. Evenzo worden de oppervlakte niveaus van membraan proteïnen gemoduleerd door middel van internalisatie en recycling evenementen10. Deze cargo's worden getransporteerd via een ingewikkeld netwerk van actin, microtubuli, en eventueel tussenliggende filamenten tracks8. Studies op basis van immunofluorescentie kleuring van end-binding proteïne 1 (EB1), die zich ophogt bij de groeiende microtubulus plus uiteinden, suggereren dat in astrocyten bundels van microtubuli uit de perinucleons uitstralen en hun plus einde uitbreiden naar de periferie11. Echter, een uitgebreid onderzoek van de organisatie en de polariteit van microtubuli en andere cytoskelet elementen met behulp van Live-celbeeldvorming ontbreekt nog. Hoewel veel van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de dynamiek van organellen en membraan eiwitten uitvoerig zijn bestudeerd in neuronen en andere celtypen, is de beweeglijkheid van de lading in astrocyten minder goed begrepen. De meeste van onze huidige kennis over veranderingen in de eiwit-en organel verdeling in astrocyten is gebaseerd op traditionele etikettering van vaste stoffen op basis van antilichamen, die het precieze ruimtelijke en temporele onderzoek van Cargo Dynamics7uitsluit, 12.
Hier beschrijven we een methode om membraan eiwitten en organellen te labelen voor Live beeldvorming in primaire muis astrocyten culturen. Met behulp van dit protocol, bieden we voorbeelden waarin we de dynamische lokalisatie van groene fluorescerende eiwitten (GFP)-gelabelde membraan eiwitten in getransfunteerde astrocyten, waaronder de gap junction Protein connexin 43 (Cx43-GFP) en het excitatory aminozuur Transporter 1 (EAAT1-GFP). We beschrijven ook het gebruik van een fluorescerende acidotrope sonde om zure organellen te visualiseren en de dynamiek van hun handel in levende astrocyten te volgen. Ten slotte laten we zien hoe u de timelapse-gegevens analyseert om transport parameters voor individuele ladingen te extraheren en te evalueren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

Astrocyten behoren tot de meest overvloedige celtypen in het volwassen brein, waar ze belangrijke rollen spelen in een veelheid van functies. Als een centrale speler in de hersenen homeostase, astrocyten leveren neuronen met vitale metabolieten en buffer extracellulaire water, ionen, en glutamaat. Een integraal onderdeel van de "Tri-partite" Synapse, astrocyten zijn ook kritisch in de vorming, snoeien, onderhoud, en modulatie van synapsen. Om deze zeer interactieve functies mogelijk te maken, communiceren astrocyten onderling en met andere gliacellen, neuronen, de hersen-vasculatuur en de extracellulaire omgeving door een veelheid aan gespecialiseerde membraan eiwitten die cel bevatten adhesiemoleculen, aquaporinen, ionenkanalen, neurotransmitter transporters, en gap-junction moleculen. Ter ondersteuning van deze dynamische flux, zijn astrocyten, net als neuronen, afhankelijk van strak gecoördineerd en efficiënt intracellulair transport. In tegenstelling tot neuronen, waar intracellulaire handel uitgebreid is afgebakend, is het op microtubulus gebaseerde transport in astrocyten minder bestudeerd. Niettemin, Exo-en endocytaire handel in celmembraan eiwitten en intracellulaire organel transport regelt de normale biologie van astrocyten, en deze processen worden vaak aangetast door ziekte of als reactie op letsel. Hier presenteren we een eenvoudig protocol om hoge kwaliteit Murine astrocyten te kweken, om astrocytische eiwitten en organellen van belang fluorescentisch te labelen en om hun intracellulaire transport dynamiek op te nemen met behulp van time-lapse confocale microscopie. We laten ook zien hoe relevante transport parameters uit de gekochte films kunnen worden uitgepakt en gekwantificeren met behulp van de beschikbare software voorbeeld analyse (d.w.z. ImageJ/FIJI) plugins.

Het protocol voor het instellen van de hierboven beschreven primaire muis-MD-astrocyten moet reproduceerbare, kwalitatief hoogstaande culturen opleveren. Hoewel culturen in eerste instantie een mengsel van astrocyten, fibroblasten en andere gliacellen bevatten, waaronder Microglia en oligodendrocyten (Figuur 1bi, BIV; rode pijlpunten), wordt de toevoeging van araC aan de gemengde cultuur tussen DIV5-DIV7 geminimaliseerd de proliferatie van deze contaminerende cellen. De geco...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Ons protocol kan worden gebruikt om de beweeglijkheid en lokalisatie van astrocytische organellen of eiwitten te onderzoeken onder gecontroleerde extracellulaire omgevingen en milde ziektetoestanden. In tegenstelling tot de vaste mha-preparaten, die enkele momentopnamen van eiwit- en organellelokalisatie bieden, kan onze live beeldvormingstechniek worden gebruikt om de deeltjesdynamica in individuele levende astrocyten te analyseren. De dag voor de transfectie zaad astrocyten op de juiste dichtheid voor beeldvorming op 24 tot 48 uur na de transfectie.Verdun het lipofectionreagens in een verlaagd serummedium tot de juiste experimentele concentratie. Verdun vijf microgram hoge zuiverheid DNA in 250 microliters van verminderd serummedium en voeg vijf microliters lipofection enhancer reagens toe aan de buis. Meng het lipofection reagens met een gelijk volume van de DNA lipofection enhancer mix en ontcubeer de oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder aan het einde van de incubatie het supernatant uit de astrocytencultuur en voeg 100 microliter van de transfectiemix dropwise toe aan de cellen. Na zes uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, vervang het transfectiecomplex door een passend volume astrocytencultuurmedium en breng de cellen nog 24 tot 72 uur terug naar de celkweek incubator. 30 minuten voor de beeldvorming verdun een geschikte lysosomale labelingsonde in 200 microliters van astrocytencultuurmedium tot een werkconcentratie van één micromolar en label de astrocyten 30 minuten met een sonde bij 37 graden Celsius.Was vervolgens de cellen een keer met warme astrocyten cultuur medium en vervang de was met imaging medium. Onmiddellijk na de sonde etikettering, plaats de astrocyten cultuur container in de juiste adapter op de microscoop stadium en met behulp van EBI fluorescentie licht, lokaliseren van de cellen die fluorescerende eiwitten of sonde uit te drukken. Gebruik de digitale camera om de fluorescerende voorbeeldverlichting aan te passen om de geselecteerde cellen te visualiseren en de focus aan te passen en in te zoomen op één cel.Gebruik vervolgens de zoom- en definitefocusfuncties om één Z-stack time-lapse-serie te verkrijgen met een frequentie van één frame om de twee seconden voor tijdintervallen variërend van 300 tot 500 seconden. Sla de timelapse-afbeeldingen op en exporteer deze als AVI- of TIFF-stackbestanden. Als u de time-lapse-afbeeldingen wilt analyseren, opent u de time-lapse-afbeeldingsreeks in ImageJ of Fiji en gebruikt u het gereedschap Gesplitst kanaal om de kanalen te splitsen.Gebruik in het acht-bits groene kanaalbeeld het gereedschap Gesegmenteerde lijn om een lijn te traceren langs de trajecten van de deeltjes met dezelfde gewenste richtingsconventie voor alle films, zodat de polariteit consistent is binnen en over alle cellen die worden bestudeerd. Dubbelklik op het gereedschap Lijn om de lijnbreedte aan te passen aan de dikte van het spoor en voer de Kymo-macro tekenen van de Kymo ToolBox-plug-in uit met een lijnbreedte van 10. Er verschijnt een prompt waarin wordt gevraagd om de afbeelding in tijd en ruimte te kalibreren.Eenmaal gekalibreerd, kymographs zal worden gegenereerd en kan worden opgeslagen als TIFF-bestanden. Als u deeltjestrajecten wilt toewijzen, gebruikt u het gereedschap Gesegmenteerde lijn om elk deeltje in de kymograaf handmatig te volgen voor de volledige duur van de acquisitie en de ROI-manager te gebruiken om elke deeltjestraject op te nemen als een gebied van belang. Sla alle regio's van belang per elke time-lapse video voor verdere analyse en voer de Analyse Kymo macro van de Kymo ToolBox plugin.Er wordt een venster geopend waarin wordt gevraagd om de uitgaande richting van deeltjesbeweging te definiëren vanuit de kern van de cel van belang in het vervolgkeuzemenu. De maximumsnelheid moet worden bepaald aan de hand van de gevoeligheid van de software voor elke lading van belang en de lijnbreedte moet worden aangepast aan de dikte van elk deeltjestraject. De Log All Data en Log Extrapolated Coördinaten moeten worden berekend voor de berekening van de verschillende parameters voor vrachtvervoer.Klik op Oke. De gegevens die voor de afzonderlijke tracks worden berekend, worden vervolgens per kymograaf samengevoegd en opgeslagen in tekstbestanden die specifiek zijn voor elke afbeelding. Het combineren van cytosine arabinoside behandeling met het schudden gebaseerde zuiveringsstrategie verrijkt de zuiverheid van de astrocyten culturen over traditionele protocollen die de zuiveringsstap slechts omvatten.Lipofection gebaseerde transfectie maakt de voorbijgaande expressie van eiwitten op niveaus die optimaal zijn voor levende cel beeldvorming zonder dat toxiciteit of invloed astrocyten levensvatbaarheid. Op dezelfde manier maakt het gebruik van een fluorescerende sonde het mogelijk om zure endolysosomale organellen snel en efficiënt te etiketteren voor het volgen van organelledynamica en astrocyten. De time-lapse gegevens van de beeldvorming kunnen worden gebruikt om kymografen te genereren die vrachtbeweging in tijd en ruimte volgen.In deze kymografen wordt anterogradebeweging van de aangegeven lading vertegenwoordigd door trajecten met negatieve hellingen, terwijl retrograde beweging wordt vertegenwoordigd door trajecten met positieve hellingen. Stationaire vikjes verschijnen als verticale trajecten. In deze analyse, kwantificering van de flux van een specifieke lading door middel van een gebied van de astrocyt bleek verschillen in het percentage van de modale deeltjes tussen ladingen die waarschijnlijk representatief zijn voor hun normale basislijn beweeglijkheid in het gebied van de astrocyt waarbinnen de films werden verworven.De nauwkeurige mapping van de verandering in de X, Y positie langs de full timescale voor elk deeltje verkregen uit de kymograaf kan ook worden gebruikt om andere bewegingsparameters te evalueren, zoals ladingsnelheid en looplengte. Aangezien dit protocol astrocytenculturen van hoge kwaliteit en efficiënte ladinglabeling vereist, moet de transfection reagent incubatietijd en verwervingstijdlijn worden aangepast voor elke plasmide of lading van belang. Dit protocol kan worden gewijzigd om transportgebeurtenissen in astrocyten te karakteriseren in reactie op celschade, toxiciteit, pathogene mutaties, synaptische activiteit of veranderingen in de intra- of extracellulaire omgeving.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) van de fluorescentie gemerkte eiwitten in Dendritische stekels van Cultured hippocampus Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolatie en Cultuur van de Muis Corticale Astrocyten

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signalen in Striatale Astrocyten van volwassen muizen met behulp van genetisch gecodeerd Calcium Indicatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Het analyseren van dendrietmorfologie in Kolommen en Lagen

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Analyseren van de grootte, de vorm en de directionaliteit van netwerken van gekoppelde astrocyten

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonal Transport van Organellen in Motor Neuron Culturen met behulp van Microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...