Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

DNL a été soutenu par l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (UNC) School of Medicine en tant que boursier Simmons. TWR a reçu le soutien de la subvention PREP R25 GM089569 de l'UNC. Les travaux utilisant le Centre de microscopie de l'UNC Microscopy Core Facility ont été soutenus, en partie, par le financement de la subvention de soutien du NIH-NINDS Neuroscience Center P30 NS045892 et du NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Center Support Grant U54 HD079124.

Toutes les procédures animales ont été effectuées avec l'approbation de l'Université de Caroline du Nord au Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Dissection de cerveau et culture des astrocytes primaires de souris
REMARQUE: Le protocole suivant a été adapté à partir de méthodes publiées, qui suit la procédure originale développée par McCarthy et deVellis13,14,<sup class...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+mammalian+development+and+disease.">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li><li>Allaman, I., B&#233;langer, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-neuron+metabolic+relationships:+for+better+and+for+worse.">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li><li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination.">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li><li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+Synapse+Formation,+Function,+and+Elimination.">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).</li><li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

Ici, nous décrivons une approche expérimentale pour exprimer, visualiser, et suivre les organites fluorescents marqués et les protéines de membrane d'intérêt utilisant la microscopie vidéo time-lapse dans les astrocytes corticales corticaux primaires de souris de haute pureté de MD. Nous énoncions également une méthodologie de mesure de la dynamique des particules. La visualisation directe de la dynamique des protéines et des organites dans les astrocytes primaires fournit un outil puissant pour étudier la r...

Les astrocytes sont les cellules les plus abondantes dans le système nerveux central adulte, où ils exécutent des fonctions développementales et homéostatiques uniques1. Les astrocytes modulent le développement synaptique par le contact direct avec les terminaux pré- et postsynaptiques dans le cadre de la synapse tri-partite, qui contient des récepteurs de neurotransmetteur, des transporteurs, et des molécules d'adhérence de cellules qui facilitent la formation de synapse et la communication neuronale-astrocyte2. En outre, les astrocytes contrôlent activement la transmission synaptique et empêchent l'excitotoxicité neuronale en supprimant rapidement les neurotransmetteurs excitatifs de la fente synaptique, en recyclant les neurotransmetteurs et en participant à l'élagage synaptique3 , 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6.Pour activer ces fonctions hautement interactives, les astrocytes communiquent entre eux, avec d'autres cellules gliales, et avec les neurones par le biais de protéines membranaires spécialisées, y compris les molécules d'adhérence cellulaire, les aquaporines, les canaux ioniques, les transporteurs de neurotransmetteurs et les molécules de jonction d'écart. Les astrocytes modifient activement les niveaux de surface de ces protéines en réponse aux fluctuations de leur environnement intra- et extracellulaire7. En outre, les changements dans les niveaux et la distribution des mitochondries, des gouttelettes lipidiques et des organites dégradatifs et de recyclage modulent l'approvisionnement énergétique, la disponibilité des métabolites et les processus de compensation cellulaire qui sont essentiels à la fonction des astrocytes et survie.
Les changements dynamiques dans le trafic de protéines membranaires et d'organelle et le positionnement dans les astrocytes sont facilités par la fonction concertée des protéines motrices et des adaptateurs qui favorisent la motilité de la cargaison8,9. De même, les niveaux de surface des protéines membranaires sont modulés par l'internalisation et le recyclage des événements10. Ces cargaisons sont transportées par un réseau complexe d'actine, de microtubules et peut-être de filaments intermédiaires8. Les études basées sur la coloration d'immunofluorescence de la protéine de liaison final 1 (EB1), qui s'accumule au microtubule croissant plus extrémités, suggèrent que dans les faisceaux d'astrocytes des microtubules rayonnent hors du périnucleus et d'étendre leur extrémité plus vers le périphérie11. Cependant, un examen complet de l'organisation et de la polarité des microtubules et d'autres éléments cytosquelettiques utilisant la formation image de cellules vivantes manque toujours. Tandis que beaucoup des mécanismes sous-jacents à la dynamique des organelles et des protéines membranaires ont été intensivement étudiés dans les neurones et d'autres types de cellules, la motilité de cargaison dans les astrocytes est moins bien comprise. La plupart de nos connaissances actuelles sur les changements dans la distribution des protéines et des organites dans les astrocytes est basée sur l'étiquetage traditionnel à base d'anticorps de la préparation fixe, ce qui empêche l'examen spatial et temporel précis de la dynamique du fret7, 12.
Ici, nous décrivons une méthode pour étiqueter des protéines de membrane et des organites pour l'imagerie vivante dans les cultures primaires d'astrocyte de souris de haute pureté. À l'aide de ce protocole, nous fournissons des exemples dans lesquels nous suivons la localisation dynamique des protéines de membrane fluorescentes vertes (GFP) dans les astrocytes transfectés, y compris la connexine de protéine de jonction d'écart 43 (Cx43-GFP) et l'acide aminé excitateur transporteur 1 (EAAT1-GFP). Nous décrivons également l'utilisation d'une sonde acidotrope fluorescente pour visualiser les organites acides et suivre leur dynamique de trafic dans les astrocytes vivants. Enfin, nous démontrons comment analyser les données time-lapse pour extraire et évaluer les paramètres de transport des cargaisons individuelles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

Les astrocytes sont parmi les types de cellules les plus abondants dans le cerveau adulte, où ils jouent des rôles clés dans une multiplicité de fonctions. En tant qu'acteur central de l'homéostasie cérébrale, les astrocytes fournissent aux neurones des métabolites vitaux et tamponnent l'eau extracellulaire, les ions et le glutamate. Composante intégrale de la synapse tri-partite, les astrocytes sont également essentiels à la formation, à l'élagage, à l'entretien et à la modulation des synapses. Pour permettre ces fonctions hautement interactives, les astrocytes communiquent entre eux et avec d'autres cellules gliales, neurones, vascularisation du cerveau et environnement extracellulaire à travers une multitude de protéines membranaires spécialisées qui incluent des cellules molécules d'adhérence, d'aquaporines, de canaux ioniques, de transporteurs de neurotransmetteurs et de molécules de jonction d'écart. Pour soutenir ce flux dynamique, les astrocytes, comme les neurones, s'appuient sur un transport intracellulaire étroitement coordonné et efficace. Contrairement aux neurones, où le trafic intracellulaire a été largement délimité, le transport à base de microtubules dans les astrocytes a été moins étudié. Néanmoins, le trafic exo- et endocytic des protéines de membrane cellulaire et du transport intracellulaire d'organelle orchestre la biologie normale des astrocytes, et ces processus sont souvent affectés dans la maladie ou en réponse aux dommages. Ici, nous présentons un protocole simple à la culture de haute qualité astrocytes murine, à fluorescentétique des protéines astrocytiques et des organites d'intérêt, et d'enregistrer leur dynamique de transport intracellulaire en utilisant la microscopie confocale time-lapse. Nous démontrons également comment extraire et quantifier les paramètres de transport pertinents des films acquis à l'aide du logiciel d'analyse d'image disponible (c.-à-d. ImageJ/FIJI).

Le protocole pour établir les astrocytes mD primaires de souris décrits ci-dessus devrait produire des cultures reproductibles et de haute qualité. Bien que les cultures contiennent initialement un mélange d'astrocytes, de fibroblastes et d'autres cellules gliales, y compris les microglies et les oligodendrocytes (figure1Bi,Biv; pointes de flèches rouges), l'ajout d'AraC à la culture mixte entre DIV5-DIV7 minimise la prolifération de ces cellules contaminantes. Le tra...

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Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Ici nous décrivons une méthode in vitro de live-imaging pour visualiser le transport intracellulaire des organelles et le trafic des protéines de membrane de plasma dans les astrocytes murines. Ce protocole présente également une méthodologie d'analyse d'image pour déterminer les itinéraires et la cinétique du transport de marchandises.

Visualisation et analyse du transport intracellulaire d'organites et d'autres cargaisons dans les astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Notre protocole peut être utilisé pour étudier la motilité et la localisation des organites ou des protéines astrocytiques dans des environnements extracellulaires contrôlés et des états de maladies bénignes. Contrairement aux préparations fixes MHA, qui fournissent des instantanés simples de la localisation des protéines et des organelles, notre technique d’imagerie en direct peut être utilisée pour analyser la dynamique des particules chez les astrocytes vivants individuels. La veille des astrocytes de graines de transfection à la densité appropriée pour l’imagerie à 24 à 48 heures après transfection.Diluer le reagent de lipofection dans le milieu réduit de sérum à la concentration expérimentale appropriée. Diluer cinq microgrammes d’ADN de haute pureté dans 250 microlitres de sérum réduit moyen et ajouter cinq microlitres de réamétrage exhausteur de lipofection au tube. Mélanger le réaccente de lipofection avec un volume égal du mélange exhausteur de lipofection d’ADN et incuber la solution pendant 15 minutes à température ambiante.À la fin de l’incubation, retirer le supernatant de la culture des astrocytes et ajouter 100 microlitres du mélange de transfection dropwise aux cellules. Après six heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, remplacer le complexe de transfection par un volume approprié de milieu de culture des astrocytes et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pour un supplément de 24 à 72 heures. 30 minutes avant l’imagerie, diluer une sonde d’étiquetage lysosomal appropriée dans 200 microlitres de milieu de culture des astrocytes à une concentration de travail d’un micromolaire et étiqueter les astrocytes avec une sonde pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.Lavez ensuite les cellules une fois avec le milieu chaud de culture d’astrocyte et remplacez le lavage par le milieu d’imagerie. Immédiatement après l’étiquetage de la sonde, placez le récipient de culture des astrocytes dans l’adaptateur approprié au stade du microscope et à l’aide de la lumière de fluorescence EBI, localisez les cellules qui expriment des protéines fluorescentes ou sondent. Utilisez l’appareil photo numérique pour ajuster l’éclairage de l’échantillon fluorescent pour visualiser les cellules sélectionnées et ajuster la mise au point et zoomer sur une seule cellule.Utilisez ensuite les fonctions Zoom et Definite Focus pour acquérir une seule série z-stack time-lapse à une fréquence d’un cadre toutes les deux secondes pour des intervalles de temps allant de 300 à 500 secondes. Enregistrez et exportez les images en time-lapse sous forme de fichiers piles AVI ou TIFF. Pour analyser les images time-lapse, ouvrez la séquence d’image time-lapse dans ImageJ ou Fidji et utilisez l’outil Split Channel pour diviser les canaux.Dans l’image du canal vert huit bits, utilisez l’outil Segmenté Line pour tracer une ligne le long des trajectoires des particules en utilisant la même convention directionnelle souhaitée pour tous les films afin que la polarité soit cohérente à l’intérieur et à travers toutes les cellules étudiées. Double cliquez sur l’outil Ligne pour ajuster la largeur de la ligne pour correspondre à l’épaisseur de la piste et exécuter la macro Draw Kymo du plugin Kymo ToolBox en utilisant une largeur de ligne de 10. Une invite demandant de calibrer l’image dans le temps et l’espace apparaîtra.Une fois calibrés, les kymographes seront générés et peuvent être enregistrés sous forme de fichiers TIFF. Pour assigner des trajectoires de particules, utilisez l’outil Segmenté Line pour suivre manuellement chaque particule dans le kymograph pendant toute la durée de l’acquisition et utilisez le gestionnaire de retour sur investissement pour enregistrer chaque trajectoire de particule comme région d’intérêt. Enregistrez toutes les régions d’intérêt par chaque vidéo time-lapse pour une analyse plus approfondie et exécutez la macro Analyze Kymo du plugin Kymo ToolBox.Une fenêtre s’ouvrira demandant de définir la direction extérieure du mouvement des particules à partir du noyau de la cellule d’intérêt du menu dropdown. La vitesse limite doit être définie en fonction de la sensibilité du logiciel pour chaque cargaison d’intérêt et la largeur de la ligne doit être ajustée pour correspondre à l’épaisseur de chaque trajectoire de particule. Le journal toutes les données et les coordonnées extrapolées journal devrait être pour le calcul des différents paramètres de transport de fret.Cliquez sur Ok. Les données calculées pour les pistes individuelles seront ensuite mis en commun par kymograph et enregistrées dans des fichiers texte spécifiques à chaque image. La combinaison du traitement de cytosine arabinoside avec la stratégie de purification basée sur la secousse enrichit la pureté des cultures d’astrocytes par rapport aux protocoles traditionnels qui incluent l’étape de purification seulement.La transfection basée sur la lipoféction permet l’expression transitoire de protéines à des niveaux optimaux pour l’imagerie cellulaire vivante sans causer de toxicité ou affecter la viabilité des astrocytes. De même, l’utilisation d’une sonde fluorescente permet l’étiquetage rapide et efficace des organites endolysosomaux acides pour le suivi de la dynamique des organites et des astrocytes. Les données en accéléré de l’imagerie peuvent être utilisées pour générer des kymographes qui suivent le mouvement de la cargaison dans le temps et l’espace.Dans ces kymographes, le mouvement antéograde de la cargaison indiquée est représenté par des trajectoires avec des pentes négatives, tandis que le mouvement rétrograde est représenté par des trajectoires avec des pentes positives. Les vésicules stationnaires apparaissent sous forme de trajectoires verticales. Dans cette analyse, la quantification du flux d’une cargaison spécifique à travers une zone de l’astrocyte a révélé des différences dans le pourcentage de particules modales parmi les cargaisons qui sont probablement représentatives de leur motilité normale de la ligne de base dans la région de l’astrocyte dans lequel les films ont été acquis.La cartographie précise du changement dans la position X et Y le long de l’échelle de temps complète pour chaque particule obtenue à partir du kymograph peut également être utilisée pour évaluer d’autres paramètres de mouvement, tels que la vitesse de chargement et la longueur de course. Comme ce protocole exige des cultures d’astrocytes de haute qualité et un étiquetage efficace des cargaisons, le temps d’incubation et le calendrier d’acquisition du réaccfection transfection devraient être ajustés pour chaque plasmide ou cargaison d’intérêt. Ce protocole peut être modifié pour caractériser les événements de transport dans les astrocytes en réponse aux dommages cellulaires, à la toxicité, aux mutations pathogènes, à l’activité synaptique ou aux changements dans l’environnement intra ou extracellulaire.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

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Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) de fluorescence protéines marquées dans les épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de culture

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Recherche

Neurosciences

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolement et culture des astrocytes corticaux de souris

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux dans Striatale astrocytes de souris adultes utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocole pour tridimensionnelle confocale Analyse morphométrique des astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse dendritique Morphologie dans les colonnes et les couches

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes Organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant Virus Adeno-associé et microscopie confocale

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Analyser la taille, la forme et la directionnalité des réseaux des Astrocytes induits

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans la paraplégie spastique héréditaire

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Transport axonal des Organlles dans les cultures de neurones moteurs à l’aide du système de chambres microfluidiques

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Préparation in vitro en tranches compensées pour imiter la connectivité du circuit neuronal In Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...