Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

DNL wurde von der University of North Carolina at Chapel Hill (UNC) School of Medicine als Simmons Scholar unterstützt. TWR wurde von UNC PREP Grant R25 GM089569 unterstützt. Die Arbeit mit der Kerneinrichtung des UNC Neuroscience Center Microscopy wurde teilweise durch Fördermittel des NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 und des NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 unterstützt. HD079124.

Alle tierischen Eingriffe wurden mit Genehmigung der University of North Carolina im Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt.
1. Hirnsektion und Kultur der primären Mausastrozyten
HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von veröffentlichten Methoden angepasst, die dem ursprünglichen Verfahren folgen, das von McCarthy und deVellis13,14,15entwickelt wur...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+mammalian+development+and+disease.">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li><li>Allaman, I., B&#233;langer, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-neuron+metabolic+relationships:+for+better+and+for+worse.">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li><li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination.">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li><li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+Synapse+Formation,+Function,+and+Elimination.">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).</li><li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

Hier beschreiben wir einen experimentellen Ansatz, um fluoreszierend markierte Organellen und Membranproteine von Interesse mithilfe der Zeitraffer-Videomikroskopie in hochreinen primären Maus-Kortikus-Astrozyten auszudrücken, zu visualisieren und zu verfolgen. Wir skizzieren auch eine Methodik zur Messung der Partikeldynamik. Die direkte Visualisierung der Protein- und Organellendynamik in primären Astrozyten bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Regulierung des intrazellulären Transports in diesen Zellen in...

Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Zellen im erwachsenen Zentralnervensystem, wo sie einzigartige entwicklungs- und heimostatische Funktionen ausführen1. Astrozyten modulieren synaptische Entwicklung durch direkten Kontakt mit prä- und postsynaptischen Terminals als Teil der Tripartit-Synapse, die Neurotransmitter-Rezeptoren, Transporter und Zelladhäsionsmoleküle enthält, die die Synapsenbildung erleichtern und Neuron-Astrozyten-Kommunikation2. Darüber hinaus steuern Astrozyten aktiv die synaptische Übertragung und verhindern neuronale Exzitotoxizität, indem sie exzitatorische Neurotransmitter schnell aus dem synaptischen Spalten entfernen, Neurotransmitter recyceln und an synaptischem Schnitt teilnehmen3 , 4 , 5 , 6. Um diese hochinteraktiven Funktionen zu ermöglichen, kommunizieren Astrozyten untereinander, mit anderen Gliazellen und mit Neuronen durch spezialisierte Membranproteine, einschließlich Zelladhäsionsmoleküle, Aquaporine, Ionenkanäle, Neurotransmitter-Transporter und Lückenknotenmoleküle. Astrozyten verändern aktiv die Oberflächenniveaus dieser Proteine als Reaktion auf Schwankungen in ihrer intra- und extrazellulären Umgebung7. Darüber hinaus modulieren Veränderungen in den Konzentrationen und der Verteilung von Mitochondrien, Lipidtröpfchen und abbauenden und recycelnden Organellen die Energieversorgung, die Verfügbarkeit von Metaboliten und zelluläre Clearingprozesse, die für die Astrozytenfunktion und überleben.
Die dynamischen Veränderungen des Membranprotein- und Organellenhandels und der Positionierung in Astrozyten werden durch die konzertierte Funktion von motorischen Proteinen und Adaptern erleichtert, die die BeweglichkeitderLadung 8,9fördern. In ähnlicher Weise werden die Oberflächenniveaus von Membranproteinen durch Internalisierung simonieren und Recyceln10moduliert. Diese Ladungen werden über ein kompliziertes Netz von Actin, Mikrotubuliund möglicherweise Zwischenfilamenten 8 transportiert. Studien auf der Grundlage der Immunfluoreszenzfärbung des Endbindungsproteins 1 (EB1), das sich an den wachsenden Mikrotubuli plus Enden ansammelt, deuten darauf hin, dass in Astrozyten Bündel von Mikrotubuli aus dem Perinucleus ausstrahlen und ihr Plus-Ende in Richtung Peripherie11. Eine umfassende Untersuchung der Organisation und Polarität von Mikrotubuli und anderen zytoskelettalen Elementen mittels Live-Zell-Bildgebung fehlt jedoch noch. Während viele der Mechanismen, die der Dynamik von Organellen und Membranproteinen zugrunde liegen, ausgiebig in Neuronen und anderen Zelltypen untersucht wurden, ist die Beweglichkeit der Ladung in Astrozyten weniger gut verstanden. Der größte Teil unseres derzeitigen Wissens über Veränderungen der Protein- und Organellenverteilung in Astrozyten basiert auf der traditionellen Antikörper-basierten Kennzeichnung fester Zubereitung, die eine genaue räumliche und zeitliche Untersuchung der Ladungsdynamik ausschließt7, 12.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung von Membranproteinen und Organellen für live-Bildgebung in hochreinen primären Maus-Astrozytenkulturen. Anhand dieses Protokolls liefern wir Beispiele, in denen wir die dynamische Lokalisierung von grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP) verfolgen, die mit Membranproteinen in transfizierten Astrozyten getaggt sind, einschließlich des Spaltknotenproteins Connexin 43 (Cx43-GFP) und der exzitatorischen Aminosäure Transporter 1 (EAAT1-GFP). Wir beschreiben auch die Verwendung einer fluoreszierenden säureotropen Sonde, um saure Organellen zu visualisieren und deren Handelsdynamik in lebenden Astrozyten zu verfolgen. Abschließend zeigen wir, wie die Zeitrafferdaten analysiert werden, um Transportparameter für einzelne Ladungen zu extrahieren und auszuwerten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

Astrozyten gehören zu den häufigsten Zelltypen im erwachsenen Gehirn, wo sie eine Schlüsselrolle in einer Vielzahl von Funktionen spielen. Als zentraler Akteur bei der Homöostase des Gehirns versorgen Astrozyten Neuronen mit lebenswichtigen Metaboliten und puffern extrazelluläres Wasser, Ionen und Glutamat. Astrozyten sind ein integraler Bestandteil der "Tripartiten"-Synapse und sind auch entscheidend für die Bildung, Beschnitt, Wartung und Modulation von Synapsen. Um diese hochinteraktiven Funktionen zu ermöglichen, kommunizieren Astrozyten untereinander und mit anderen Gliazellen, Neuronen, der Gehirnvaskulatur und der extrazellulären Umgebung durch eine Vielzahl von spezialisierten Membranproteinen, die Zell Adhäsionsmoleküle, Aquaporine, Ionenkanäle, Neurotransmitter-Transporter und Spaltknotenmoleküle. Um diesen dynamischen Fluss zu unterstützen, verlassen sich Astrozyten, wie Neuronen, auf eng koordinierten und effizienten intrazellulären Transport. Im Gegensatz zu Neuronen, wo der intrazelluläre Handel umfassend abgegrenzt wurde, wurde der mikrotubulierbasierte Transport in Astrozyten weniger untersucht. Nichtsdestotrotz orchestriert der exo- und endozytische Handel mit Zellmembranproteinen und intrazellulären Organellentransporten die normale Biologie von Astrozyten, und diese Prozesse sind oft bei Krankheiten oder als Reaktion auf Verletzungen betroffen. Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll zur Kultur hochwertiger muriner Astrozyten, zur fluoreszierenden Kennzeichnung von astrozytären Proteinen und Organellen von Interesse und zur Aufzeichnung ihrer intrazellulären Transportdynamik mittels zeitrafferkonfokaler Mikroskopie. Wir zeigen auch, wie man relevante Transportparameter aus den aufgenommenen Filmen mit verfügbaren Bildanalyse-Software (d.h. ImageJ/FIJI) Plugins extrahiert und quantifiziert.

Das oben beschriebene Protokoll zur Etablierung primärer Maus-MD-Astrozyten sollte reproduzierbare, hochwertige Kulturen liefern. Obwohl Kulturen zunächst eine Mischung aus Astrozyten, Fibroblasten und anderen Gliazellen, einschließlich Mikroglia und Oligodendrozyten enthalten (Abbildung 1Bi,Biv; rote Pfeilspitzen), minimiert die Zugabe von AraC zur Mischkultur zwischen DIV5-DIV7 die Proliferation dieser Schadstoffzellen. Die kombinierte AraC-Behandlungs- und Schüttelrei...

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Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Hier beschreiben wir eine In-vitro-Live-Imaging-Methode zur Visualisierung des intrazellulären Transports von Organellen und des Handels mit Plasmamembranproteinen in murinen Astrozyten. Dieses Protokoll stellt auch eine Bildanalysemethodik zur Bestimmung von Frachttransportrouten und Kinetik dar.

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Unser Protokoll kann verwendet werden, um die Beweglichkeit und Lokalisation von astrozytischen Organellen oder Proteinen unter kontrollierten extrazellulären Umgebungen und leichten Krankheitszuständen zu untersuchen. Im Gegensatz zu den MHA-Festpräparaten, die einzelne Momentaufnahmen der Protein- und Organellenlokalisierung liefern, kann unsere Live-Bildgebungstechnik zur Analyse der Partikeldynamik in einzelnen lebenden Astrozyten eingesetzt werden. Am Tag vor der Transfektion saat astrozyten mit der entsprechenden Dichte für die Bildgebung bei 24 bis 48 Stunden nach der Transfektion.Verdünnen Sie das Lipofektionsreagenz in reduziertem Serummedium auf die entsprechende experimentelle Konzentration. Verdünnen Sie fünf Mikrogramm hochreine DNA in 250 Mikroliter reduziertem Serummedium und fügen Sie fünf Mikroliter Lipofection Enhancer Reagenz in die Röhre. Mischen Sie das Lipofection-Reagenz mit einem gleichen Volumen der DNA Lipofection Enhancer Mischung und inkubieren Sie die Lösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur.Am Ende der Inkubation entfernen Sie den Überstand aus der Astrozytenkultur und fügen Sie 100 Mikroliter des Transfektionsmixes tropfenweise zu den Zellen hinzu. Ersetzen Sie nach sechs Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid den Transfektionskomplex durch ein entsprechendes Volumen an Astrozytenkulturmedium und geben sie die Zellen für weitere 24 bis 72 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurück. 30 Minuten vor der Bildgebung eine geeignete lysosomale Etikettiersonde in 200 Mikroliter n. Astrozytenkultur medium auf eine Arbeitskonzentration von einem Mikromolaren verdünnen und die Astrozyten 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit einer Sonde kennzeichnen.Dann waschen Sie die Zellen einmal mit warmen Astrozytenkulturmedium und ersetzen Sie die Wäsche mit Bildnismedium. Legen Sie unmittelbar nach der Sondenbeschriftung den Astrozytenkulturbehälter in den entsprechenden Adapter auf der Mikroskopstufe und lokalisieren Sie mit EBI-Fluoreszenzlicht die Zellen, die fluoreszierende Proteine oder Sonden exprimieren. Verwenden Sie die Digitalkamera, um die fluoreszierende Probenbeleuchtung anzupassen, um die ausgewählten Zellen zu visualisieren und den Fokus anzupassen und auf eine einzelne Zelle zu zoomen.Verwenden Sie dann die Zoom- und Definite Focus-Funktionen, um eine einzelne Z-Stack-Zeitrafferserie mit einer Frequenz von einem Frame alle zwei Sekunden für Zeitintervalle zwischen 300 und 500 Sekunden zu erfassen. Speichern und exportieren Sie die Zeitrafferbilder als AVI- oder TIFF-Stack-Dateien. Um die Zeitrafferbilder zu analysieren, öffnen Sie die Zeitraffer-Bildsequenz in ImageJ oder Fidschi und verwenden Sie das Werkzeug Split Channel, um die Kanäle aufzuteilen.Verwenden Sie im Acht-Bit-Grünkanalbild das Werkzeug Segmentierte Linie, um eine Linie entlang der Flugbahnen der Partikel zu verfolgen, wobei die gleiche gewünschte Richtungskonvention für alle Filme verwendet wird, sodass die Polarität innerhalb und über alle untersuchten Zellen konsistent ist. Doppelklicken Sie auf das Linienwerkzeug, um die Linienbreite an die Dicke der Spur anzupassen, und führen Sie das Draw Kymo-Makro des Kymo ToolBox-Plugins mit einer Linienbreite von 10 aus. Es wird eine Aufforderung angezeigt, das Bild in Zeit und Raum zu kalibrieren.Nach der Kalibrierung werden Kymographen generiert und können als TIFF-Dateien gespeichert werden. Um Partikelbahnen zuzuweisen, verwenden Sie das Werkzeug Segmentierte Linie, um jedes Partikel im Kymographen für die gesamte Dauer der Erfassung manuell zu verfolgen, und verwenden Sie den ROI-Manager, um jede Partikelbahn als Interessenbereich aufzuzeichnen. Speichern Sie alle Interessensgebiete pro Zeitraffer-Video für die weitere Analyse und führen Sie das Analyze Kymo-Makro des Kymo ToolBox Plugins aus.Es öffnet sich ein Fenster, in dem die äußere Richtung der Partikelbewegung aus dem Kern der zelle von Interesse aus dem Dropdown-Menü definiert wird. Die Grenzgeschwindigkeit sollte entsprechend der Empfindlichkeit der Software für jede Ladung von Interesse definiert werden und die Linienbreite sollte an die Dicke jeder Partikelbahn angepasst werden. Die Log All Data und Log Extrapolated Coordinates sollten für die Berechnung der verschiedenen Ladungstransportparameter sein.Klicken Sie auf Okay. Die für die einzelnen Spuren berechneten Daten werden dann per Kymograph gepoolt und in textdateien gespeichert, die für jedes Bild spezifisch sind. Die Kombination von Cytosin-Arabinoside-Behandlung mit der schüttelbasierten Reinigungsstrategie bereichert die Reinheit der Astrozytenkulturen gegenüber traditionellen Protokollen, die nur den Reinigungsschritt beinhalten.Lipofection-basierte Transfektion ermöglicht die transiente Expression von Proteinen auf Ebenen, die für die Bildgebung von lebenden Zellen optimal sind, ohne Toxizität zu verursachen oder die Astrozytenlebensfähigkeit zu beeinträchtigen. In ähnlicher Weise ermöglicht der Einsatz einer fluoreszierenden Sonde die schnelle und effiziente Kennzeichnung saurer endolysosomaler Organellen zur Verfolgung von Organellendynamik und Astrozyten. Die Zeitrafferdaten aus der Bildgebung können verwendet werden, um Kymographen zu erzeugen, die Ladungsbewegungen in Zeit und Raum verfolgen.In diesen Kymographen wird die anterograde Bewegung der angegebenen Ladung durch Flugbahnen mit negativen Steigungen dargestellt, während retrograde Bewegung durch Flugbahnen mit positiven Steigungen dargestellt wird. Stationäre Vesikel erscheinen als vertikale Bahnen. In dieser Analyse ergab die Quantifizierung des Flusses einer bestimmten Ladung durch einen Bereich der Astrozyten Unterschiede im Prozentsatz der Modalteilchen zwischen ladungen, die wahrscheinlich repräsentativ für ihre normale Grundlinienmotilität in der Region der Astrozyten, in der die Filme erworben wurden, repräsentativ sind.Die genaue Abbildung der Änderung der X-, Y-Position entlang der vollen Zeitskala für jedes aus dem Kymograph erhaltene Teilchen kann auch zur Auswertung anderer Bewegungsparameter wie Frachtgeschwindigkeit und Lauflänge verwendet werden. Da dieses Protokoll qualitativ hochwertige Astrozytenkulturen und eine effiziente Frachtkennzeichnung erfordert, sollten die Inkubationszeit und die Erfassungszeitzeit für jedes Plasmid oder jede Ladung von Interesse angepasst werden. Dieses Protokoll kann geändert werden, um Transportereignisse in Astrozyten als Reaktion auf Zellschäden, Toxizität, pathogene Mutationen, synaptische Aktivität oder Veränderungen in der intra- oder extrazellulären Umgebung zu charakterisieren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolation und Kultur von Maus Kortikale Astrozyten

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Abbildungsintrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse von mitochondrialem Transport und Morphologie bei humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen bei erblicher spastischer Paraplegie

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonaler Transport von Organellen in Motorneuronenkulturen mit Mikrofluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...