Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

DNL נתמך על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בבית הספר לרפואה בצ היל (UNC) בתור מלומד סימונס. TWR נתמך על ידי UNC הכנה גרנט ראשי 25 GM089569. העבודה באמצעות מרכז מיקרוסקופ הליבה UNC המרכז היה נתמך, בין השאר, על ידי מימון של NIH-NINDS מרכז המחקר תמיכה מענק P30 NS045892 ו NIH-מוגבלות התפתחותית מרכז מחקר התפתחותי תמיכה מענק U54 HD079124.

כל ההליכים בעלי החיים בוצעו עם אישור של אוניברסיטת צפון קרוליינה בבית התפילה לטיפול בעלי חיים ועדת השימוש (IACUC).
1. המוח ניתוח ותרבות של אסטרוציטים העכבר הראשי
הערה: הפרוטוקול הבא הותאם משיטות שפורסמו, אשר בעקבות ההליך המקורי שפותחה על ידי מקארתי ו devellis<sup class="xref...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+mammalian+development+and+disease.">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li><li>Allaman, I., B&#233;langer, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-neuron+metabolic+relationships:+for+better+and+for+worse.">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li><li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination.">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li><li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+Synapse+Formation,+Function,+and+Elimination.">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).</li><li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

כאן, אנו מתארים גישה ניסיונית לבטא, להמחיש, ולעקוב אחר מתויג fluorescently וחלבונים ממברנה של עניין באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות ב-high-טוהר העכבר הראשי בקליפת המין הראשונית MD. אנו גם מתווה מתודולוגיה למדידת דינמיקת חלקיקים. ויזואליזציה ישירה של חלבון ו אורגונל דינמיקה ב אסטרוציטים הראשי מספ...

Astrocytes הם התאים השופעים ביותר במערכת העצבים המרכזית למבוגרים, שם הם מבצעים ייחודי התפתחותית פונקציות הומסטטיות1. Astrocytes לווסת את ההתפתחות הסינפטית באמצעות מגע ישיר עם מסופים טרום ו פוסט סינפטית במסגרת סינפטה משולש, אשר מכיל קולטני הנוירוטרנסמיטר, מובילים, תא מולקולות הדבקה המקלים על היווצרות סינפסה והתקשורת האסטרוציטותא2. בנוסף, האסטרוציטים באופן פעיל לשלוט שידור סינפטית ולמנוע מפני הזדקנות העצבים העצבית על ידי הסרה מהירה של נוירוטרנסמיטרים מתוך שסוע סינפטית, מיחזור נוירוטרנסמיטורים, והשתתפות בגיזום סינפטית3 , ד , מיכל 5 , 6. כדי לאפשר אלה פונקציות אינטראקטיביות מאוד, האסטרוציטים לתקשר בינם לבין עצמם, עם תאים גליה אחרים, עם נוירונים באמצעות חלבונים ממברנה מיוחדים, כולל מולקולות הדבקה התא, aquפורטל, ערוצי יונים, מובילי הנוירוטרנסמיטר ומולקולות של צומת הפער. Astrocytes פעיל לשנות את רמות פני השטח של חלבונים אלה בתגובה תנודות בסביבה הפנים והחילוץ שלהם7. יתר על כן, שינויים ברמות והפצה של המיטו, טיפות ליפיד, ו degradative ומיחזור אורגלים לווסת את אספקת האנרגיה, זמינות מטבוליט, ותהליכי סליקה סלולריים החיוניים לפונקציה אסטרוציט ו ישרדות.
השינויים הדינאמיים בחלבון ממברנה ובסחר בנשים ומיצוב באסטרוציטים מקדמים את הפונקציה מתואמת של חלבונים ומתאמים מוטוריים המעודדים תנועתיות מטענים8,9. באופן דומה, רמות פני השטח של חלבונים ממברנה מאופנן דרך הפנמה ומיחזור אירועים10. אלה מטענים מועברים באמצעות רשת מורכבת של actin, microtubules, ואולי ביניים רצועות שירים8. מחקרים המבוססים על כתמים immunofluorescence של הקצה מחייב חלבון 1 (EB1), אשר מצטבר על מיקרוכדורית הגוברת ומסתיים, מציע כי בצרורות אסטרוציטים של microtubules מקרין החוצה מתוך החוצה ולהאריך את קצה הפלוס שלהם לכיוון מפריפריה11. עם זאת, בדיקה מקיפה של הארגון וקוטביות של microtubules ואלמנטים ציטולדים אחרים באמצעות הדמיה תא חי עדיין חסר. בעוד רבים של המנגנונים המשמשים את הדינמיקה של אורגלים וחלבונים ממברנה נחקרו בהרחבה בנוירונים וסוגי תאים אחרים, תנועתיות מטענים ב אסטרוציטים הוא פחות טוב מובן. רוב הידע הנוכחי שלנו על שינויים חלבון ו אורגונל התפלגות ב אסטרוציטים מבוסס על מסורתי נוגדן מבוסס תיוג של הכנה קבועה, אשר מונע בדיקה מרחבית וזמני מדויק של דינמיקה מטענים7, . שתיים עשרה
כאן, אנו מתארים שיטה לתייג חלבונים הממברנה ואורגלים עבור הדמיה חיה בתרבויות גבוהה העכבר הראשי אסטרוציט הטוהר. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מספקים דוגמאות שבו אנו מעקב אחר הלוקליזציה הדינמי של חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-מתויגים חלבונים ממברנה ב astrocytes הטרנסתאי, כולל הפער הפערים חלבון קונשין 43 (Cx43-GFP) ואת חומצת האמינו המתומנת טרנספורטר 1 (EAAT1-GFP). אנו גם לתאר את השימוש של החללית הניאון ac, בדיקה כדי להמחיש אורגלות חומצי ולעקוב אחר הדינמיקה שלהם הסחר בחיים astrocytes. בסופו של דבר, אנו להדגים כיצד לנתח את הנתונים לשגות זמן כדי לחלץ ולהעריך את הפרמטרים התחבורה עבור cargos בודדים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

Astrocytes הם בין סוגי התאים הנפוצים ביותר במוח המבוגר, שם הם משחקים תפקידים מרכזיים בריבוי של פונקציות. כשחקן מרכזי בהומאוסטזיס המוח, האסטרוציטים לספק נוירונים עם מטבוליטים חיוניים מאגר המים, יונים, ו גלוטמט. מרכיב אינטגרלי של "tri-פרטיטה" סינפט, אסטרוציטים הם גם קריטיים היווצרות, גיזום, תחזוקה, ואפנון של הסינפסות. כדי להפעיל פונקציות אינטראקטיביות מאוד אלה, אסטרוציטים לתקשר בינם לבין עצמם עם תאים גליה אחרים, נוירונים, המוח ולוח הסביבה באמצעות המון חלבונים ממברנה מיוחדים הכוללים תא מולקולות הדבקה, אקואפונס, ערוצי יונים, מובילי נוירוטרנסמיטר ומולקולות של צומת הפער. כדי לתמוך השטף הדינמי הזה, astrocytes, כמו נוירונים, להסתמך על תחבורה מתואמת היטב ויעיל הובלה תאיים. בניגוד לנוירונים, שם הסחר התאיים היתה מבוססת בהרחבה, הובלה microtubule דורית מבוסס אסטרוציטים כבר נחקרו פחות. עם זאת, הסחר exo-ו endocytic של ממברנות התא חלבונים והתחבורה התאיים ארגונית הובלה בביולוגיה נורמלית, תהליכים אלה מושפעים לעתים קרובות במחלה או בתגובה לפציעה. כאן אנו מציגים פרוטוקול ישיר לתרבות האסטרוציטים באיכות גבוהה, כדי לסמן חלבונים אסטרוציטוטיים התווית והאורגלים של עניין, ולהקליט את הדינמיקה התחבורה התאיים שלהם באמצעות הזמן לשגות במיקרוסקופ קונפוקלית. כמו כן, אנו מדגימים כיצד לחלץ ולכמת את פרמטרי התחבורה הרלוונטיים מהסרטים הנרכשים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה (כגון, ImageJ/פיג'י) תוספים.

הפרוטוקול להקמת העכבר הראשי MD אסטרוציטים המתואר לעיל צריך להניב התשואה, תרבויות באיכות גבוהה. למרות שתרבויות מכילות בתחילה שילוב של אסטרוציטים, פיברותקיעות, ותאים גליאל אחרים, כולל מיקרוגלייה ו oligodendrocytes הפוך (איור 1Bi,בוולוף; ראשי חץ אדומים), תוספת arac אל התרבות המע?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

כאן אנו מתארים בשיטת הדמיה לחיות מחוץ לתמונה כדי להמחיש הובלה תאיים של אורגלים וסחר של חלבונים קרום פלזמה ב astrocytes מורטין. פרוטוקול זה מציג גם מתודולוגיה לניתוח תמונה כדי לקבוע מסלולים להובלת מטענים וקינטיקה.

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לחקור את תנועתיות לוקליזציה של organelles אסטרוציטים או חלבונים תחת סביבות חוץ תאיות מבוקרות מצבי מחלה קלה. שלא כמו ההכנות הקבועות של MHA, המספקות תמונות בודדות של לוקליזציה של חלבונים ואברונים, טכניקת ההדמיה החיה שלנו יכולה לשמש לניתוח דינמיקת חלקיקים באסטרוציטים חיים בודדים. יום לפני אסטרוציטים זרעי transfection בצפיפות המתאימה להדמיה ב 24 עד 48 שעות לאחר transfection.מדללים את רגנט ליפוקציה במדיום סרום מופחת לריכוז הניסוי המתאים. לדלל חמישה מיקרוגרם של DNA טוהר גבוה ב 250 microliters של מדיום סרום מופחת ולהוסיף חמישה microliters של reagent משפר lipofection לצינור. מערבבים את רגנט lipofection עם נפח שווה של תערובת משפר lipofection DNA להדגיר את הפתרון במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, להסיר את supernatant מתרבות האסטרוציטים ולהוסיף 100 microliters של תערובת transfection dropwise לתאים. לאחר שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, להחליף את קומפלקס transfection עם נפח מתאים של תרבות אסטרוציטים בינוני ולהחזיר את התאים החממה תרבות התא במשך 24 עד 72 שעות נוספות. 30 דקות לפני ההדמיה, לדלל בדיקה תיוג lysosomal מתאים ב 200 microliters של מדיום תרבות אסטרוציטים לריכוז עבודה של micromolar אחד ולתייג את האסטרוציטים עם בדיקה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם בינוני תרבות אסטרוציטים חם ולהחליף את לשטוף עם מדיום הדמיה. מיד לאחר תיוג הגשוש, מניחים את מיכל תרבות האסטרוציטים במתאם המתאים בשלב המיקרוסקופ ובשימוש באור פלואורסצנטי של EBI, מאתרים את התאים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים או בדיקה. השתמש במצלמה הדיגיטלית כדי לכוונן את תאורת הדגימה הפלואורסצננטית כדי להמחיש את התאים הנבחרים ולהתאים את המוקד ולהגדיל את התצוגה לתא בודד.לאחר מכן השתמש בפונקציות זום והתמקדות מוגדרת כדי להשיג סידרת זמן-lapse אחת של מחסנית Z בתדירות של מסגרת אחת כל שתי שניות עבור מרווחי זמן הנעים בין 300 ל- 500 שניות. שמור וייצא את התמונות לשגות בזמן כקבצי מחסנית AVI או TIFF. כדי לנתח את התמונות לשגות בזמן, פתחו את רצף התמונות של זמן ההפוגה ב- ImageJ או בפיג'י ולהשתמש בכלי פיצול ערוץ כדי לפצל את הערוצים.בתדמית הערוץ הירוק של שמונה סיביות, השתמש בכלי קו מקופל כדי לעקוב אחר קו לאורך מסלולי החלקיקים באמצעות אותה מוסכמה כיוונית רצויה עבור כל הסרטים, כך שהקוטביות עקבית בתוך כל התאים הנחקרים. לחץ פעמיים על הכלי קו כדי להתאים את רוחב הקו כדי להתאים את עובי המסלול ולהפעיל את המאקרו צייר Kymo של תוסף תיבת כלים Kymo באמצעות רוחב קו של 10. תופיע בקשה המבקשת לכייל את התמונה בזמן ובמקום.לאחר כיול, קימוגרפים ייווצרו ו ניתן לשמור אותם כקבצי TIFF. כדי להקצות מסלולי חלקיקים, השתמש בכלי קו מקופל כדי לעקוב באופן ידני אחר כל חלקיק בקימוגרף למשך כל תקופת הרכישה ולהשתמש במנהל החזר ההשקעות כדי לתעד כל מסלול חלקיקים כאזור מעניין. שמור את כל אזורי העניין לכל וידאו לשגות זמן לניתוח נוסף ולהפעיל את המאקרו לנתח Kymo של תוסף תיבת כלים Kymo.ייפתח חלון המבקש להגדיר את הכיוון החיצוני של תנועת החלקיקים מגרעין תא העניין מהתפריט הנפתח. יש להגדיר את מהירות המגבלה בהתאם לרגישות התוכנה לכל מטען מעניין ויש להתאים את רוחב הקו כך שיתאימו לעובי של כל מסלול חלקיקי. רשום את כל הנתונים ואת יומן קואורדינטות אקסטרפולציה צריך להיות לחישוב של הפרמטרים השונים הובלת מטען.לחץ על אישור. הנתונים המחושבים עבור הרצועות הבודדות יאגרו לאחר מכן לכל קימוגרף ויישמרו בקבצי טקסט הספציפיים לכל תמונה. שילוב טיפול ציטוצינוס ערבינוסייד עם אסטרטגיית טיהור מבוססת טלטול מעשיר את טוהר תרבויות האסטרוציטים על פני פרוטוקולים מסורתיים הכוללים את צעד הטיהור בלבד.transfection מבוסס Lipofection מאפשר ביטוי חולף של חלבונים ברמות אופטימליות עבור הדמיה של תאים חיים מבלי לגרום רעילות או להשפיע על הכדאיות אסטרוציטים. באופן דומה, השימוש בבדיקה פלואורסצנטית מאפשר תיוג מהיר ויעיל של אורגנים אנדוליזומליים חומציים למעקב אחר דינמיקת אורגנל ואסטרוציטים. ניתן להשתמש בנתונים של זמן לשגות מההדמיה כדי ליצור קימוגרפים העקובים אחר תנועת המטען בזמן ו בחלל.בקימוגרף אלה, תנועת אנטרוגרד של המטען המצוין מיוצגת על ידי מסלולים עם מדרונות שליליים, בעוד תנועה מדרדרת מיוצגת על ידי מסלולים עם מדרונות חיוביים. מעולםים נייחים מופיעים כמסלולים אנכיים. בניתוח זה, כימות השטף של מטען מסוים דרך אזור של האסטרוציטים חשף הבדלים באחוז החלקיקים המודאליים בקרב מטענים אשר עשויים להיות מייצגים את תנועתיות קו הבסיס הרגיל שלהם באזור האסטרוציטים שבתוכם נרכשו הסרטים.המיפוי המדויק של השינוי במיקום X, Y לאורך ציר הזמן המלא עבור כל חלקיק המתקבל מהקימוגרף יכול לשמש גם להערכת פרמטרי תנועה אחרים, כגון מהירות מטען ואורך ריצה. מכיוון שפרוטוקול זה דורש תרבויות אסטרוציטים באיכות גבוהה ותיוג מטען יעיל, יש להתאים את זמן הדגירה והרכישה של ה-transfection עבור כל פלסמיד או מטען של עניין. פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לאפיין אירועי תחבורה אסטרוציטים בתגובה לנזק לתאים, רעילות, מוטציות פתוגניות, פעילות סינפטית, או שינויים בסביבה החוץ תאית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) של החלבונים המתויגים הקרינה הקוצים הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

ההדמיה תאית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בstriatal האסטרוציטים מעכברים בוגרים באמצעות אינדיקטורים סידן מבחינה גנטית מקודדים

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

ניתוח מורפולוגיה דנדריטים ב עמודות שכבות

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

ויזואליזציה והדמיה בשידור חי של Organelles אוליגודנדרוציטים בפרוסות Organotypic המוח באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

ניתוח של גודל, צורה, כיוון של רשתות של האסטרוציטים בשילוב

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

הובלה אקונלית של אורגלות בתרביות תאי עצב מוטוריים באמצעות מערכת צ'יימברס מיקרופלואידיג

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...