Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

DNL एक Simmons विद्वान के रूप में चैपल हिल (यूएनसी) चिकित्सा के स्कूल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था. TWR UNC PREP अनुदान R25 GM089569 द्वारा समर्थित किया गया था. UNC तंत्रिका विज्ञान केंद्र माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा का उपयोग कर काम का समर्थन किया गया था, भाग में, NIH-NINDS तंत्रिका विज्ञान केंद्र सहायता अनुदान P30 NS045892 और NIH-NICHD बौद्धिक और विकासात्मक विकलांगता अनुसंधान केंद्र सहायता अनुदान U54 से वित्त पोषण द्वारा HD079124.

सभी पशु प्रक्रियाओं चैपल हिल पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) में उत्तरी केरोलिना विश्वविद्यालय के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया.
1. मस्तिष्क विच्छेदन और प्राथमिक माउस एस्ट्रोसाइट्स की संस्?...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. 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H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

यहाँ, हम व्यक्त करने के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन, कल्पना, और ट्रैक फ्लोरोसेंट टैग organelles और ब्याज की झिल्ली प्रोटीन उच्च शुद्धता प्राथमिक माउस cortical एमडी astrocytes में समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी ?...

Astrocytes वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं, जहां वे अद्वितीय विकास और homeostatic कार्यों 1प्रदर्शन कर रहे हैं. एस्ट्रोसाइट्स त्रि-पक्षीय synapse के भाग के रूप में पूर्व और पदों के साथ सीधे संपर्क के माध्यम से synaptic विकास modulate, जो न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स, ट्रांसपोर्टरों, और सेल आसंजन अणुओं है कि synapse गठन की सुविधा शामिल और न्यूरॉन-एस्ट्रोसाइट संचार2| इसके अलावा, astrocytes सक्रिय रूप से synaptic संचरण को नियंत्रित करने और तेजी से synaptic फांक से उत्तेजक न्यूरोट्रांसमीटर को हटाने के द्वारा न्यूरॉन excitotoxicity को रोकने, रीसाइक्लिंग न्यूरोट्रांसमीटर, और synaptic pruning में भाग लेने3 , 4 , 5 , 6. इन अत्यधिक इंटरैक्टिव कार्यों को सक्षम करने के लिए, एस्ट्रोसाइट्स अन्य ग्लिल कोशिकाओं के साथ, और कोशिका आसंजन अणुओं, एक्वापोरिन, आयन चैनलों सहित विशेष झिल्ली प्रोटीन के माध्यम से न्यूरॉन्स के साथ आपस में संवाद करते हैं, न्यूरोट्रांसमीटर ट्रांसपोर्टर, और अंतराल जंक्शन अणुओं. एस्ट्रोसाइट्स अपने अंतर और बाह्यवातावरण7 में उतार-चढ़ाव के जवाब में इन प्रोटीनों के सतह के स्तर को सक्रिय रूप से बदल ते हैं। इसके अलावा, mitochondria के स्तर और वितरण में परिवर्तन, लिपिड बूंदों, और अपमानजनक और रीसाइक्लिंग organelles modulate ऊर्जा की आपूर्ति, चयापचय उपलब्धता, और सेलुलर समाशोधन प्रक्रियाओं है कि एस्ट्रोसाइट समारोह के लिए आवश्यक हैं और अस्तित्व बचाना.
झिल्ली प्रोटीन और ऑर्गेनेल तस्करी और एस्ट्रोसाइट्स में स्थिति में गतिशील परिवर्तन मोटर प्रोटीन और अनुकूलकों के सम्मिलित कार्य द्वारा मदद करते हैं जो कार्गो गतिशीलताकोबढ़ावा देते हैं8 ,9. इसी प्रकार, झिल्ली प्रोटीन की सतह के स्तर internalization और रीसाइक्लिंग घटनाओं10के माध्यम से संग्राहक रहे हैं. इन कार्गोओं को actin, microtubules, और संभवतः मध्यवर्ती फिलामेंट पटरियों8के एक जटिल नेटवर्क के माध्यम से ले जाया जाता है। अंत बाध्यकारी प्रोटीन 1 (EB1) के इम्यूनोफ्लोरेस धुंधला पर आधारित अध्ययन, जो बढ़ते माइक्रोट्युबल प्लस सिरों पर जमा होता है, सुझाव है कि माइक्रोट्यूबेट्स के बंडलों में पेरिनुक्लियस से बाहर निकलने और उनके प्लस अंत का विस्तार करने के लिए परिधि11| हालांकि, संगठन की एक व्यापक परीक्षा और microtubules और अन्य cytoskeletal तत्वों की ध्रुवता लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग कर अभी भी कमी है. जबकि organelles और झिल्ली प्रोटीन की गतिशीलता अंतर्निहित तंत्र के कई बड़े पैमाने पर न्यूरॉन्स और अन्य कोशिका प्रकार में अध्ययन किया गया है, astrocytes में कार्गो गतिशीलता कम अच्छी तरह से समझा जाता है. एस्ट्रोसाइट्स में प्रोटीन और ऑर्गेनेल वितरण में परिवर्तन के बारे में हमारे वर्तमान ज्ञान के अधिकांश निश्चित तैयारी के पारंपरिक एंटीबॉडी आधारित लेबलिंग पर आधारित है, जो कार्गो गतिशीलता7के सटीक स्थानिक और लौकिक परीक्षा precludes, 12.
यहाँ, हम उच्च शुद्धता प्राथमिक माउस एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों में लाइव इमेजिंग के लिए झिल्ली प्रोटीन और organelles लेबल करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम उदाहरण प्रदान करते हैं जिसमें हम ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) टैग किए गए झिल्ली प्रोटीन के गतिशील स्थानीयकरण को ट्रांसफेक्टेड एस्ट्रोसाइट्स में ट्रैक करते हैं, जिसमें अंतराल जंक्शन प्रोटीन कोनेसिन 43 (Cx43-GFP) और उत्तेजक एमिनो एसिड शामिल हैं ट्रांसपोर्टर 1 (EAAT1-GFP). हम अम्लीय organelles कल्पना और लाइव एस्ट्रोसाइट्स में उनकी तस्करी गतिशीलता का पालन करने के लिए एक फ्लोरोसेंट acidotropic जांच के उपयोग का भी वर्णन. अंत में, हम अलग-अलग कार्गो के लिए परिवहन मापदंडों को निकालने और मूल्यांकन करने के लिए समय चूक डेटा का विश्लेषण करने का तरीका प्रदर्शित करते हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

Astrocytes वयस्क मस्तिष्क में सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार के बीच हैं, जहां वे कार्यों की एक बहुतायत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. मस्तिष्क homeostasis में एक केंद्रीय खिलाड़ी के रूप में, astrocytes महत्वपूर्ण चयापचयों और बफर extracellular पानी, आयनों, और ग्लूटामेट के साथ न्यूरॉन्स की आपूर्ति. "त्रि-पक्षीय" synapse का एक अभिन्न घटक, astrocytes भी गठन में महत्वपूर्ण हैं, pruning, रखरखाव, और synapses के मॉडुलन. इन अत्यधिक इंटरैक्टिव कार्यों को सक्षम करने के लिए, astrocytes आपस में और अन्य glial कोशिकाओं के साथ संवाद, न्यूरॉन्स, मस्तिष्क vascuature, और विशेष झिल्ली प्रोटीन की एक भीड़ के माध्यम से extracellular पर्यावरण है कि सेल शामिल आसंजन अणुओं, एक्वापोरिन, आयन चैनल, न्यूरोट्रांसमीटर ट्रांसपोर्टर, और अंतराल जंक्शन अणुओं. इस गतिशील प्रवाह का समर्थन करने के लिए, astrocytes, न्यूरॉन्स की तरह, कसकर समन्वित और कुशल intracellular परिवहन पर भरोसा करते हैं. न्यूरॉन्स के विपरीत, जहां intracellular तस्करी बड़े पैमाने पर रेखांकित किया गया है, astrocytes में microtubule आधारित परिवहन कम अध्ययन किया गया है. फिर भी, कोशिका झिल्ली प्रोटीन और इंट्रासेल्यूलर आर्गेनेल ट्रांसपोर्ट के एक्सो और एंडोसाइटिक तस्करी एस्ट्रोसाइट्स के सामान्य जीव विज्ञान का आयोजन करती है, और ये प्रक्रियाएं अक्सर बीमारी में या चोट के जवाब में प्रभावित होती हैं। यहाँ हम संस्कृति उच्च गुणवत्ता murine astrocytes के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल प्रस्तुत, फ्लोरोसेंट लेबल astrocytic प्रोटीन और ब्याज के organelles के लिए, और समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर उनके intracellular परिवहन गतिशीलता रिकॉर्ड करने के लिए. हम यह भी प्रदर्शित कैसे निकालने के लिए और उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (यानी, ImageJ/FIJI) plugins का उपयोग कर प्राप्त फिल्मों से प्रासंगिक परिवहन मापदंडों की मात्रा निर्धारित करने के लिए.

ऊपर उल्लिखित प्राथमिक माउस एमडी एस्ट्रोसाइट्स की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल reproduible, उच्च गुणवत्ता संस्कृतियों उपज चाहिए. हालांकि संस्कृतियों में शुरू में एस्ट्रोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स, और अन्य ग्लि?...

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Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

यहाँ हम organelles के intracellular परिवहन और murine astrocytes में प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की तस्करी कल्पना करने के लिए एक इन विट्रो लाइव-इमेजिंग विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल भी कार्गो परिवहन itineraries और गतिकी का निर्धारण करने के लिए एक छवि विश्लेषण पद्धति प्रस्तुत करता है।

एस्ट्रोसाइट्स में ऑर्गेनेल्स और अन्य कार्गो के इंट्रासेल्यूलर ट्रांसपोर्ट का दृश्य और विश्लेषण करना

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग नियंत्रित बाह्राश वातावरण और हल्के रोग राज्यों के तहत एस्ट्रोसाइटिक ऑर्गेनेल्स या प्रोटीन की गतिशीलता और स्थानीयकरण की जांच करने के लिए किया जा सकता है। गृह मंत्रालय की निश्चित तैयारी के विपरीत, जो प्रोटीन और ऑर्गेनेल स्थानीयकरण के एकल स्नैपशॉट प्रदान करते हैं, हमारी लाइव इमेजिंग तकनीक का उपयोग व्यक्तिगत लाइव एस्ट्रोसाइट्स में कण गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। ट्रांसफैक्शन के बाद 24 से 48 घंटे पर इमेजिंग के लिए उपयुक्त घनत्व पर ट्रांसफैक्शन बीज एस्ट्रोसाइट्स से पहले दिन।कम सीरम माध्यम में लिपोफेक्शन रीएजेंट को उचित प्रयोगात्मक एकाग्रता तक पतला करें। कम सीरम माध्यम के २५० माइक्रोलीटर में उच्च शुद्धता डीएनए के पांच माइक्रोग्राम पतला और ट्यूब के लिए लिपिखंड बढ़ाने वर्धक अभिकर्ण के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें । लिपोफेक्शन रीएजेंट को डीएनए लिपोफेक्शन वर्धक मिक्स की बराबर मात्रा के साथ मिलाएं और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए समाधान को इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के अंत में एस्ट्रोसाइट कल्चर से सुपरनेट निकालें और कोशिकाओं में ट्रांसफेक्शन मिक्स ड्रॉपवाइज के 100 माइक्रोलीटर डालें। ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर छह घंटे के बाद, एस्ट्रोसाइट संस्कृति माध्यम की एक उपयुक्त मात्रा के साथ ट्रांसफेक्शन परिसर की जगह और एक अतिरिक्त 24 से ७२ घंटे के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए कोशिकाओं को वापस । इमेजिंग से 30 मिनट पहले एस्ट्रोसाइट कल्चर मीडियम के 200 माइक्रोलीटर में एक उपयुक्त लिसोसोमल लेबलिंग जांच को एक माइक्रोमोलर की वर्किंग कंसंट्रेशन के लिए पतला करें और एस्ट्रोसाइट्स को 30 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर जांच के साथ लेबल करें।फिर कोशिकाओं को एक बार गर्म एस्ट्रोसाइट संस्कृति माध्यम से धोएं और वॉश को इमेजिंग माध्यम से बदलें। जांच लेबलिंग के तुरंत बाद, एस्ट्रोसाइट कल्चर कंटेनर को माइक्रोस्कोप चरण पर उपयुक्त एडाप्टर में रखें और ईबीआई फ्लोरेसेंस लाइट का उपयोग करके, फ्लोरोसेंट प्रोटीन या जांच व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का पता लगाएं। चयनित कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंट नमूना रोशनी को समायोजित करने के लिए डिजिटल कैमरे का उपयोग करें और ध्यान को समायोजित करें और एक ही सेल में ज़ूम करें।फिर 300 और 500 सेकंड के बीच के समय अंतराल के लिए हर दो सेकंड में एक फ्रेम की आवृत्ति पर एक जेड-स्टैक टाइम-लैप्स श्रृंखला प्राप्त करने के लिए ज़ूम और निश्चित फोकस कार्यों का उपयोग करें। AVI या झगड़ा ढेर फ़ाइलों के रूप में समय चूक छवियों को सहेजें और निर्यात करें। समय-चूक छवियों का विश्लेषण करने के लिए, इमेजजे या फिजी में समय-चूक छवि अनुक्रम खोलें और चैनलों को विभाजित करने के लिए स्प्लिट चैनल टूल का उपयोग करें।आठ बिट ग्रीन चैनल छवि में, सभी फिल्मों के लिए एक ही वांछित दिशात्मक सम्मेलन का उपयोग करके कणों के प्रक्षेप-पथ के साथ एक लाइन का पता लगाने के लिए खंडित लाइन टूल का उपयोग करें ताकि ध्रुवता अध्ययन की जा रही सभी कोशिकाओं के भीतर और पार सुसंगत हो। ट्रैक की मोटाई से मेल खाने के लिए लाइन की चौड़ाई को समायोजित करने के लिए लाइन टूल पर डबल क्लिक करें और 10 की लाइन चौड़ाई का उपयोग करके Kymo टूलबॉक्स प्लगइन के ड्रा काइमो मैक्रो को चलाएं। समय और स्थान में छवि को जांचने के लिए एक संकेत दिखाई देगा।एक बार कैलिब्रेट होने के बाद, काइमोग्राफ उत्पन्न हो जाएंगे और झगड़ा फ़ाइलों के रूप में सहेजे जा सकते हैं। कण प्रक्षेप पथ आवंटित करने के लिए, अधिग्रहण की पूरी अवधि के लिए केमोग्राफ में प्रत्येक कण को मैन्युअल रूप से ट्रैक करने के लिए खंडित लाइन टूल का उपयोग करें और प्रत्येक कण प्रक्षेपवक्र को रुचि के क्षेत्र के रूप में रिकॉर्ड करने के लिए आरओआई प्रबंधक का उपयोग करें। आगे के विश्लेषण के लिए हर बार-चूक वीडियो के अनुसार ब्याज के सभी क्षेत्रों को बचाएं और काइमो टूलबॉक्स प्लगइन के विश्लेषण काइमो मैक्रो को चलाएं।एक खिड़की ड्रॉपडाउन मेनू से ब्याज की कोशिका के नाभिक से कण गति की जावक दिशा को परिभाषित करने के लिए पूछ खोलेगी। सीमा गति ब्याज के प्रत्येक कार्गो के लिए सॉफ्टवेयर की संवेदनशीलता के अनुसार परिभाषित किया जाना चाहिए और लाइन चौड़ाई प्रत्येक कण प्रक्षेपवक्र की मोटाई मैच के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । लॉग ऑल डेटा और लॉग एक्सट्रपलेटेड निर्देशांक विभिन्न कार्गो परिवहन मापदंडों की गणना के लिए होना चाहिए।ठीक है क्लिक करें। इसके बाद व्यक्तिगत पटरियों के लिए गणना किए गए डेटा को प्रति किमोग्राफ जमा किया जाएगा और प्रत्येक छवि के लिए विशिष्ट टेक्स्ट फाइलों में सेव किया जाएगा। मिलाते हुए आधारित शुद्धिकरण रणनीति के साथ साइटोसाइन अरबिनोसाइड उपचार का संयोजन पारंपरिक प्रोटोकॉल पर एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों की शुद्धता को समृद्ध करता है जिसमें केवल शुद्धिकरण कदम शामिल है।लिपोफेक्शन आधारित ट्रांसफैक्शन उन स्तरों पर प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति की अनुमति देता है जो विषाक्तता पैदा किए बिना या एस्ट्रोसाइट व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना लाइव सेल इमेजिंग के लिए इष्टतम हैं। इसी तरह, फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग ऑर्गेनेल गतिशीलता और एस्ट्रोसाइट्स की ट्रैकिंग के लिए अम्लीय एंडोलिसोसोमल ऑर्गेनेल्स की तेजी से और कुशल लेबलिंग की अनुमति देता है। इमेजिंग से समय-चूक डेटा का उपयोग समय और स्थान में कार्गो गति को ट्रैक करने वाले का्योग्राफ उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।इन केमोग्राफ में, इंगित कार्गो के एंटेरोग्रेड आंदोलन को नकारात्मक ढलानों के साथ प्रक्षेप पथ द्वारा दर्शाया जाता है, जबकि प्रतिगामी आंदोलन का प्रतिनिधित्व सकारात्मक ढलानों के साथ प्रक्षेप पथ द्वारा किया जाता है। स्थिर वेसिकल्स ऊर्ध्वाधर प्रक्षेप पथ के रूप में दिखाई देते हैं। इस विश्लेषण में, एस्ट्रोसाइट के एक क्षेत्र के माध्यम से एक विशिष्ट कार्गो के प्रवाह की मात्रा में कार्गो के बीच मोडल कणों के प्रतिशत में अंतर का पता चला है जो एस्ट्रोसाइट के क्षेत्र में उनके सामान्य आधार रेखा गतिशीलता के संभावित प्रतिनिधि हैं, जिसके भीतर फिल्में प्राप्त की गई थीं।कामोग्राफ से प्राप्त प्रत्येक कण के लिए पूर्ण टाइमस्केल के साथ एक्स, वाई स्थिति में परिवर्तन की सटीक मानचित्रण का उपयोग कार्गो वेग और रन लेंथ जैसे अन्य गति मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है। चूंकि इस प्रोटोकॉल में उच्च गुणवत्ता वाली एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों और कुशल कार्गो लेबलिंग की आवश्यकता होती है, इसलिए ट्रांसफैक्शन रिएजेंट इनक्यूबेशन समय और अधिग्रहण समय को प्रत्येक प्लाज्मिड या ब्याज के कार्गो के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल को कोशिका क्षति, विषाक्तता, रोगजनक उत्परिवर्तन, सिनैप्टिक गतिविधि, या अंतर या बाह्य पर्यावरण में परिवर्तन के जवाब में एस्ट्रोसाइट्स में परिवहन घटनाओं की विशेषता के लिए संशोधित किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति रिकवरी (FRAP) संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines में प्रतिदीप्ति प्रोटीन के टैग की गईं

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

अलगाव और माउस Cortical Astrocytes की संस्कृति

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

इमेजिंग Intracellular सीए<sup&gt; 2 +</sup&gt; आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों का उपयोग वयस्क चूहों से Striatal astrocytes में सिग्नल

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes की तीन आयामी Confocal morphometric विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

कॉलम और परतों में वृक्ष के समान आकृति विज्ञान का विश्लेषण

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

दृश्य और Organotypic मस्तिष्क Adeno-जुड़े वायरस और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग स्लाइस में Oligodendrocyte Organelles के लाइव इमेजिंग

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

आकार, आकार, और युग्मित Astrocytes के नेटवर्क के दिशात्मकता का विश्लेषण

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

मानव प्रेरित प्लीस्ट्रेटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में मानव प्रेरित प्लुरिटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में मिटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान का विश्लेषण वंशानुगत स्पास्टिक पैराप्लेजिया

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

माइक्रोफ्लूइडिक चैम्बर्स सिस्टम का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों में ऑर्गेनेल्स का एक्सोनल परिवहन

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

विवो न्यूरोनल सर्किट कनेक्टिविटी में नकल करने के लिए इन विट्रो वेज स्लाइस तैयारी

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...