Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

DNL è stato supportato dalla University of North Carolina a Chapel Hill (UNC) School of Medicine come Simmons Scholar. TWR è stata supportata da UNC PREP Grant R25 GM089569. Il lavoro che utilizza l'UNC Neuroscience Center Microscopy Core Facility è stato sostenuto, in parte, dal finanziamento del NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P3 NS0 NS0 45892 e del NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124.

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione dell'Università della Carolina del Nord presso il Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Dissezione cerebrale e cultura dei principali astrociti del topo
NOTA: il seguente protocollo è stato adattato dai metodi pubblicati, che segue la procedura originale sviluppata da McCarthy e deVellis13,14,...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+mammalian+development+and+disease.">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li><li>Allaman, I., B&#233;langer, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-neuron+metabolic+relationships:+for+better+and+for+worse.">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li><li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination.">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li><li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+Synapse+Formation,+Function,+and+Elimination.">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).</li><li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

Qui, descriviamo un approccio sperimentale per esprimere, visualizzare e monitorare gli organelli etichettati fluorescentmente e le proteine della membrana di interesse utilizzando la microscopia video time-lapse in astrociclici corticali corticali di topo ad alta purezza. Illustreremo anche una metodologia per misurare la dinamica delle particelle. La visualizzazione diretta delle dinamiche di proteine e organelli negli astrociti primari fornisce un potente strumento per studiare la regolazione del trasporto intracellul...

Gli astrociti sono le cellule più abbondanti nel sistema nervoso centrale adulto, dove svolgono funzioni uniche di sviluppo e omeostatiche1. Gli astrociti modulano lo sviluppo sinaptico attraverso il contatto diretto con terminali pre e post-sinaptici come parte della sinapsi tri-partita, che contiene recettori del neurotrasmettitore, trasportatori e molecole di adesione cellulare che facilitano la formazione di sinapsi e comunicazione neurona-astrocito2. Inoltre, gli astrociti controllano attivamente la trasmissione sinaptica e prevengono l'eccitotossicità neuronale rimuovendo rapidamente i neurotrasmettitori eccitatori dalla fessura sinaptica, riciclando i neurotrasmettitori e partecipando alla potatura sinaptica3 , 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6.Per consentire queste funzioni altamente interattive, gli astrociti comunicano tra loro, con altre cellule gliali, e con neuroni attraverso proteine di membrana specializzate, tra cui molecole di adesione cellulare, acquaporine, canali ionici, trasportatori di neurotrasmettitori e molecole di giunzione gap. Gli astrociti cambiano attivamente i livelli superficiali di queste proteine in risposta alle fluttuazioni nel loro ambiente intra- ed extracellulare7. Inoltre, i cambiamenti nei livelli e nella distribuzione dei mitocondri, delle goccioline lipidiche e degli organelli degradanti e di riciclaggio modulano l'approvvigionamento energetico, la disponibilità di metaboliti e i processi di compensazione cellulare essenziali per la funzione astrocite e sopravvivenza.
I cambiamenti dinamici nel traffico di proteine della membrana e degli organelli e nel posizionamento negli astrociti sono facilitati dalla funzione concertata di proteine motorie e adattatori che promuovono la motilità del carico8,9. Allo stesso modo, i livelli superficiali delle proteine della membrana sono modulati attraverso eventi di internalizzazione e riciclaggio10. Questi carichi vengono trasportati attraverso un'intricata rete di actin, microtubuli, e possibilmente filamenti intermedi tracce8. Studi basati sull'colorazione immunofluorescenza della proteina di legame finale 1 (EB1), che si accumula al crescente microtubulo più estremità, suggeriscono che nei fasci di astrocicli di microtubuli si irradiano dal perinucleo ed estendono il loro periferia11. Tuttavia, manca ancora un esame completo dell'organizzazione e della polarità dei microtubuli e di altri elementi citoscheletrici che utilizzano l'imaging a cellule vive. Mentre molti dei meccanismi alla base della dinamica degli organelli e delle proteine della membrana sono stati ampiamente studiati nei neuroni e in altri tipi di cellule, la motilità del carico negli astrociti è meno ben compresa. La maggior parte delle nostre attuali conoscenze sui cambiamenti nella distribuzione di proteine e organelli negli astrociti si basa sull'etichettatura tradizionale basata sugli anticorpi della preparazione fissa, che preclude un preciso esame spaziale e temporale delle dinamiche del carico7, 12.
Qui, descriviamo un metodo per etichettare proteine e organelli di membrana per l'imaging dal vivo in colture di astrociti primari ad alta purezza. Utilizzando questo protocollo, forniamo esempi in cui monitoriamo la localizzazione dinamica delle proteine della membrana con etichettatura delle proteine fluorescenti verdi (GFP) negli astrociti trafetti, tra cui la proteina di giunzione gap connexin 43 (Cx43-GFP) e l'amminoacido eccitatorio trasporto 1 (EAAT1-GFP). Descriviamo anche l'uso di una sonda acidotropica fluorescente per visualizzare organelli acidi e seguire le loro dinamiche di traffico in astrociti vivi. Infine, dimostriamo come analizzare i dati time-lapse per estrarre e valutare i parametri di trasporto per i singoli carichi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

Gli astrociti sono tra i tipi di cellule più abbondanti nel cervello adulto, dove svolgono ruoli chiave in una molteplicità di funzioni. Come un giocatore centrale nell'omeostasi del cervello, gli astrociti forniscono ai neuroni metaboliti vitali e tamponamento di acqua extracellulare, ioni e glutammato. Componente integrante della sinapsi "tri-partite", gli astrociti sono anche critici nella formazione, potatura, manutenzione e modulazione delle sinapsi. Per consentire queste funzioni altamente interattive, gli astrociti comunicano tra di loro e con altre cellule gliali, neuroni, la vascolatura cerebrale e l'ambiente extracellulare attraverso una moltitudine di proteine della membrana specializzate che includono cellule molecole di aderenza, acquaporine, canali ionici, trasportatori di neurotrasmettitori e molecole di giunzione gap. Per supportare questo flusso dinamico, gli astrociti, come i neuroni, si basano su un trasporto intracellulare strettamente coordinato ed efficiente. A differenza dei neuroni, dove il traffico intracellulare è stato ampiamente delineato, il trasporto basato su microtubuli negli astrociti è stato meno studiato. Tuttavia, il traffico eso- ed endocitico delle proteine della membrana cellulare e del trasporto di organelli intracellulari orchestra la biologia normale degli astrociti, e questi processi sono spesso colpiti dalla malattia o in risposta a lesioni. Qui presentiamo un protocollo semplice alla coltura astrociti murini di alta qualità, per etichettare fluorescentmente proteine astrociti e organelli di interesse, e per registrare la loro dinamica di trasporto intracellulare utilizzando la microscopia con time-lapse. Dimostriamo anche come estrarre e quantificare i parametri di trasporto rilevanti dai film acquisiti utilizzando i plug-in disponibili per il software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ/FIJI).

Il protocollo per la creazione di astrociti MD topi sopra descritti dovrebbe produrre culture riproducibili e di alta qualità. Sebbene le colture contengano inizialmente un mix di astrociti, fibroblasti e altre cellule gliali, tra cui microglia e oligodendrociti (Figura1Bi,Biv; punte di freccia rosse), l'aggiunta di AraC alla coltura mista tra DIV5-DIV7 riduce al minimo la proliferazione di queste cellule contaminanti. Il trattamento combinato AraC e la strategia di purific...

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Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Qui descriviamo un metodo in vitro di imaging dal vivo per visualizzare il trasporto intracellulare di organelli e il traffico di proteine della membrana plasmatica negli astrociti murini. Questo protocollo presenta anche una metodologia di analisi delle immagini per determinare gli itinerari e la cinetica nel trasporto merci.

Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Il nostro protocollo può essere utilizzato per indagare la motilità e la localizzazione di organelli astrocitici o proteine sotto ambienti extracellulari controllati e stati di malattia lieve. A differenza dei preparati fissi MHA, che forniscono singole istantanee di localizzazione di proteine e organelli, la nostra tecnica di imaging dal vivo può essere utilizzata per analizzare la dinamica delle particelle nei singoli astrociti vivi. Il giorno prima del seme di trasfezione astrociti alla densità appropriata per l'imaging a 24-48 ore dopo la trasfezione.Diluire il reagente di lipofezione in mezzo siero ridotto alla concentrazione sperimentale appropriata. Diluire cinque microgrammi di DNA ad alta purezza in 250 microlitri di mezzo siero ridotto e aggiungere cinque microlitri di reagente esaltatore di lipofezione al tubo. Mescolare il reagente lipofection con un volume uguale del mix di esaltatore lipofezione del DNA e incubare la soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente.Alla fine dell'incubazione, rimuovere il supernatante dalla coltura di astrociti e aggiungere 100 microlitri della miscela di trasfezione dropwise alle cellule. Dopo sei ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, sostituire il complesso di trasfezione con un volume appropriato di terreno di coltura di astrociti e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare per ulteriori 24-72 ore. 30 minuti prima dell'imaging, diluire una sonda di etichettatura lisosomiale adatta in 200 microlitri di mezzo di coltura di astrociti a una concentrazione di lavoro di un micromolare ed etichettare gli astrociti con una sonda per 30 minuti a 37 gradi Celsius.Quindi lavare le cellule una volta con un mezzo di coltura di astrociti caldi e sostituire il lavaggio con un mezzo di imaging. Subito dopo l'etichettatura della sonda, posizionare il contenitore di coltura degli astrociti nell'adattatore appropriato sullo stadio del microscopio e utilizzando la luce a fluorescenza EBI, individuare le cellule che esprimono proteine fluorescenti o sonda. Utilizzare la fotocamera digitale per regolare l'illuminazione del campione fluorescente per visualizzare le celle selezionate e regolare la messa a fuoco e ingrandire una singola cella.Quindi utilizzare le funzioni Zoom e Messa a fuoco definita per acquisire una singola serie time-lapse Z-stack con una frequenza di un fotogramma ogni due secondi per intervalli di tempo compresi tra 300 e 500 secondi. Salvare ed esportare le immagini time-lapse come file dello stack AVI o TIFF. Per analizzare le immagini time-lapse, aprite la sequenza di immagini time-lapse in ImageJ o Fiji e usate lo strumento Canale diviso per dividere i canali.Nell'immagine del canale verde a otto bit, usate lo strumento Linea segmentata per tracciare una linea lungo le traiettorie delle particelle usando la stessa convenzione direzionale desiderata per tutti i filmati in modo che la polarità sia coerente all'interno e attraverso tutte le celle studiate. Fare doppio clic sull'utensile Linea per regolare la larghezza della linea in base allo spessore della traccia ed eseguire la macro Draw Kymo del plug-in Kymo ToolBox utilizzando una larghezza della linea di 10. Verrà visualizzata una richiesta di calibrazione dell'immagine nel tempo e nello spazio.Una volta calibrati, i cimografi verranno generati e possono essere salvati come file TIFF. Per assegnare traiettorie di particelle, usate lo strumento Linea segmentata (Segmented Line) per tracciare manualmente ogni particella nel kymografo per l'intera durata dell'acquisizione e utilizzate il gestore del ROI per registrare ogni traiettoria di particelle come regione di interesse. Salva tutte le regioni di interesse per ogni video time-lapse per ulteriori analisi ed esegui la macro Analyze Kymo del plug-in Kymo ToolBox.Si aprirà una finestra che chiede di definire la direzione verso l'esterno del movimento delle particelle dal nucleo della cella di interesse dal menu a discesa. La velocità limite deve essere definita in base alla sensibilità del software per ogni carico di interesse e la larghezza della linea deve essere regolata in base allo spessore di ciascuna traiettoria delle particelle. Log All Data e Log Extrapolated Coordinates devono essere per il calcolo dei vari parametri di trasporto merci.Fare clic su Ok. I dati calcolati per le singole tracce verranno quindi raggruppati per kymograph e salvati in file di testo specifici di ogni immagine. La combinazione del trattamento della citosina arabinoside con la strategia di purificazione basata sullo scuotimento arricchisce la purezza delle colture di astrociti rispetto ai protocolli tradizionali che includono solo la fase di purificazione.La trasfezione a base di lipofezione consente l'espressione transitoria delle proteine a livelli ottimali per l'imaging di cellule vive senza causare tossicità o influire sulla vitalità degli astrociti. Allo stesso modo, l'uso di una sonda fluorescente consente l'etichettatura rapida ed efficiente di organelli endolisosomiali acidi per il tracciamento della dinamica degli organelli e degli astrociti. I dati time-lapse dell'imaging possono essere utilizzati per generare cimografi che tracciano il movimento del carico nel tempo e nello spazio.In questi cimografi, il movimento anterogrado del carico indicato è rappresentato da traiettorie con pendenze negative, mentre il movimento retrogrado è rappresentato da traiettorie con pendenze positive. Le vescicole stazionarie appaiono come traiettorie verticali. In questa analisi, la quantificazione del flusso di un carico specifico attraverso un'area dell'astrocita ha rivelato differenze nella percentuale di particelle modali tra i carichi che sono probabilmente rappresentative della loro normale motilità della linea di base nella regione dell'astrocita all'interno della quale sono stati acquisiti i film.La mappatura precisa del cambiamento nella posizione X, Y lungo la scala di tempo completa per ogni particella ottenuta dal cimografo può anche essere usata per valutare altri parametri di movimento, come la velocità di carico e la lunghezza di corsa. Poiché questo protocollo richiede colture di astrociti di alta qualità ed efficiente etichettatura del carico, il tempo di incubazione del reagente di trasfezione e la tempistica di acquisizione dovrebbero essere regolati per ogni plasmide o carico di interesse. Questo protocollo può essere modificato per caratterizzare gli eventi di trasporto negli astrociti in risposta a danni cellulari, tossicità, mutazioni patogene, attività sinaptica o cambiamenti nell'ambiente intra o extracellulare.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine ​​Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Ricerca

Neuroscienze

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging intracellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali di striatale astrociti da topi adulti utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificate

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analizzando dendritiche Morfologia in colonne e strati

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualizzazione e Live Imaging del Oligodendrocyte organelli in fettine di cervello Organotypic utilizzando Virus Adeno-associati e microscopia confocale

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Analizzando le dimensioni, la forma e la direzionalità delle reti dei Astrocytes accoppiato

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analisi del trasporto mitocondriale e della morfologia nei neuroni derivati dalle cellule staminali indotte dall'uomo in paraplegia ereditaria

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Trasporto assonale di Organanelle nelle colture del motoneurone utilizzando il sistema di camere microfluidiche

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...