Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

DNL은 채플 힐 (UNC) 의학 대학에서 시몬스 학자로 노스 캐롤라이나 대학에 의해 지원되었다. TWR은 UNC 준비 그랜트 R25 GM089569에 의해 지원되었다. UNC 신경과학 센터 현미경 코어 시설을 이용한 작업은 NIH-NINDS 신경과학 센터 지원 보조금 P30 NS045892 및 NIH-NICHD 지적 발달 장애 연구 센터 지원 보조금 U54의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다. HD079124.

모든 동물 절차는 채플 힐 동물 관리 및 사용위원회에서 노스 캐롤라이나 대학의 승인으로 수행되었다 (IACUC).
1. 뇌 해부 및 기본 마우스 성상 세포의 문화
참고 : 다음 프로토콜은 맥카시와 deVellis13,14,15에의해 개발 된 원래 절차를 다음과 출판 된 방법에서 적응되었다 . 맥카시/데벨리스...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination.">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li><li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+Synapse+Formation,+Function,+and+Elimination.">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).</li><li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

여기에서, 우리는 고순도 1 차적인 마우스 피질 MD 성상 세포에 있는 시간 경과 비디오 현미경 검사법을 사용하여 관심있는 형광성 으로 표를 붙인 세포기관 및 막 단백질을 표현하고, 구상하고, 추적하는 실험적인 접근을 기술합니다. 또한 입자 역학을 측정하는 방법론도 간략하게 설명합니다. 1 차 적인 성상 세포에 있는 단백질과 세포기관 역학의 직접적인 시각화는 시험관내 이 세포에 있는 세?...

성상 세포는 성인 중추 신경계에서 가장 풍부한 세포로 독특한 발달 및적시 성 기능을 수행합니다 1. 성상 세포는 시냅스 형성을 용이하게 하는 신경 전달 물질 수용체, 수송기 및 세포 접착 분자를 포함하는 트라이 파르트 족속 시냅스의 일환으로 전과 후 발착 단자와직접 접촉을 통해 시냅스 발달을 조절합니다. 및 뉴런-성상세포 통신2. 또한, 성상세포는 시냅스 전달을 능동적으로 제어하고 시냅스 갈라진 자로부터 흥분성 신경 전달 물질을 신속하게 제거하고 신경 전달 물질을 재활용하며 시냅스 가지치기에 참여함으로써 신경 흥분성 물질을 방지합니다3 , 4개 , 5개 , 6. 이러한 고도로 상호 작용 기능을 가능하게하기 위해 성상 세포는 다른 신경교 세포와 세포 접착 분자, 아쿠아 포린, 이온 채널을 포함한 특수 막 단백질을 통해 뉴런과 통신합니다. 신경 전달 물질 수송기, 및 갭 접합 분자. 성상 세포는 적극적으로 그들의 세포 내 및 세포 외 환경에서 변동에 응하여이 단백질의 표면 수준을 변경합니다 7. 또한, 미토콘드리아, 지질 방울, 분해 및 재활용 소기관의 수준 과 분포의 변화는 성상 세포 기능에 필수적인 에너지 공급, 대사 산물 가용성 및 세포 정화 과정을 조절하고, 생존.
막 단백질 및 세포세포 인신 매매 및 성상 세포에서의 위치의 동적 변화는 화물 운동성을 촉진하는 모터 단백질및 어댑터의 공동 기능에 의해 촉진된다 8,9. 유사하게, 막 단백질의 표면 수준은 내재화 및 재활용 이벤트10을통해 변조된다. 이 화물은 액틴, 미세 관 및 아마도 중간 필라멘트 트랙8의복잡한 네트워크를 통해 수송됩니다. 성장하는 미세소관 플러스 끝에 축적되는 말단 결합 단백질 1 (EB1)의 면역 형광 염색에 기초한 연구 결과는, 미세소관의 성상 세포 번들이 회중에서 방사하고 그들의 플러스 끝을 향해 확장한다는 것을 건의합니다 주변11. 그러나, 살아있는 세포 화상 진찰을 사용하여 microtubules 및 그밖 cytoskeletal 요소의 조직 그리고 극성의 포괄적인 검사는 아직도 부족합니다. 세포기관과 막 단백질의 역학의 근본적인 기계장치의 많은 것이 신경세포 및 그밖 세포 모형에서 광범위하게 공부되는 동안, 성상 세포에 있는 화물 운동성은 보다 적게 잘 이해됩니다. 성상 세포에서 단백질 과 세포세포 분포의 변화에 대한 우리의 현재 지식의 대부분은화물 역학의 정확한 공간 및 시간 적 검사를 배제 고정 제제의 전통적인 항체 기반 라벨링에 기초7, 12.
여기서, 우리는 고순도 원발성 마우스 성상 세포 배양에서 살아있는 이미징을 위한 막 단백질 및 소기관표지 방법을 기술한다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 갭 접합 단백질 코넥신 43 (Cx43-GFP) 및 흥분성 아미노산을 포함하여 형질 감염 된 성상 세포에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 막 단백질의 동적 국소화를 추적하는 예를 제공합니다. 수송기 1 (EAAT1-GFP). 우리는 또한 산성 세포기관을 시각화하고 살아있는 성상 세포에서 그들의 인신 매매 역학을 따르기 위해 형광 산성 종자 프로브의 사용을 설명합니다. 마지막으로, 시간 경과 데이터를 분석하여 개별 화물에 대한 운송 매개 변수를 추출하고 평가하는 방법을 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

성상 세포는 성인 두뇌에 있는 가장 풍부한 세포 모형 중 입니다, 기능의 복합성에서 중요한 역할을 하는 곳에. 뇌 항상성의 중심 플레이어로서, 성상 세포는 중요한 대사 산물과 세포 외 물, 이온, 및 글루타민산염과 뉴런을 공급합니다. "삼중 분" 시냅스의 필수적인 구성 요소인 성상 세포는 시냅스의 형성, 가지 치기, 유지 보수 및 변조에도 중요합니다. 이러한 고도의 상호 작용 기능을 가능하게하기 위해, 성상 세포는 자신과 다른 신경교 세포와 통신, 뉴런, 뇌 혈관, 세포 세포를 포함하는 전문 막 단백질의 무리를 통해 세포 외 환경 접착 분자, 아쿠아포린, 이온 채널, 신경 전달 물질 수송기 및 갭 접합 분자. 이 동적 플럭스를 지원하기 위해, 성상 세포, 뉴런처럼, 밀접하게 조정하고 효율적인 세포 내 수송에 의존. 세포 내 인신 매매가 광범위하게 묘사 된 뉴런과 는 달리, 성상 세포에서 미세 관 기반 의 수송은 덜 연구되었습니다. 그럼에도 불구하고, 세포막 단백질과 세포내 세포기관 수송의 엑소좀 및 내분비 인신 매매는 성상 세포의 정상적인 생물학을 조율하고, 이 프로세스는 수시로 질병에서 또는 상해에 응하여 영향을 받습니다. 여기에서 우리는 고품질 뮤린 점성체를 배양하고, 형광성 성상 세포 단백질 및 관심 있는 세포기관에 표시하고, 시간 경과 공초점 현미경 을 사용하여 세포내 수송 역학을 기록하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다. 또한 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ/FIJI) 플러그인을 사용하여 획득한 영화에서 관련 전송 매개 변수를 추출하고 정량화하는 방법을 시연합니다.

위에서 설명한 기본 마우스 MD 성상 세포를 확립하기 위한 프로토콜은 재현 가능한 고품질 문화를 생성해야 합니다. 배양체는 처음에 성상세포, 섬유아세포 및 마이크로글리아 및 올리고엔드로시트를 포함한 다른 신경교 세포의 혼합을 포함하지만(그림1Bi, Biv;적색 화살촉), DIV5-DIV7 사이의 혼합 배양에 AraC를 첨가하는 것은 최소화한다. 이러한 오염 세포의 증식. ...

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Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

여기에서 우리는 세포기관의 세포내 수송 및 뮤린 성상 세포에 있는 혈장 막 단백질의 인신 매매를 구상하는 시험관 내 살아있는 화상 진찰 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 또한 화물 운송 일정 및 역학을 결정하는 이미지 분석 방법론을 제시합니다.

성상 세포에서 세포기관 및 기타 화물의 세포내 운송 시각화 및 분석

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

우리의 프로토콜은 통제된 세포외 환경 및 온화한 질병 상태에서 성상세포 세포기관 또는 단백질의 운동성 그리고 현지화를 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 단백질과 세포기관 국소화의 단일 스냅샷을 제공하는 MHA 고정 제제와 는 달리, 우리의 라이브 이미징 기술은 개별 살아있는 성상 세포에서 입자 역학을 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 24~48시간 후 의 이미징을 위한 적절한 밀도에서 형질 전환 종자 성상세포가 성상세포에 이른다.적절한 실험 농도로 감소된 혈청 배지에서 리포페션 시약을 희석시. 감소된 혈청 매체의 250 마이크로리터에 고순도 DNA5마이크로그램을 희석하고 5마이크로리터의 리포페션 강화 제분시 시약을 튜브에 첨가한다. 리포페션 시약을 DNA 리포션 증강제 믹스의 동일한 부피와 혼합하고 실온에서 15분 동안 용액을 배양합니다.인큐베이션의 끝에서, 성상 세포 배양에서 상체를 제거하고 세포에 드롭 방향으로 형질 혼합물의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 6시간 후, 성상세포 배양 배지의 적절한 부피로 트랜스포팅 복합체를 교체하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 24~72시간 더 되돌려 한다. 이미징 30분 전에, 성상세포 배양 배지의 200 마이크로리터에 적합한 리소말 라벨링 프로브를 희석시키고 1개의 마이크로몰러의 작동 농도로 희석하고 37°C에서 30분 동안 프로브로 성상세포에 라벨을 붙입니다.그런 다음 따뜻한 성상세포 배양 배지로 세포를 한 번 씻고 세척을 이미징 매체로 대체하십시오. 프로브 라벨링 직후, 성상세포 배양 용기를 현미경 단계의 적절한 어댑터에 넣고 EBI 형광광을 사용하여 형광 단백질 또는 프로브를 발현하는 세포를 찾습니다. 디지털 카메라를 사용하여 형광 시료 조명을 조정하여 선택한 셀을 시각화하고 초점을 조정하고 단일 셀로 확대합니다.그런 다음 줌 및 서정 초점 기능을 사용하여 300초에서 500초 사이의 시간 간격을 위해 2초마다 한 프레임의 주파수에서 단일 Z 스택 타임랩스 시리즈를 획득합니다. AVI 또는 TIFF 스택 파일로 시간 경과 이미지를 저장하고 내보냅니다. 시간 경과 이미지를 분석하려면 ImageJ 또는 Fiji에서 시간 경과 이미지 시퀀스를 열고 분할 채널 도구를 사용하여 채널을 분할합니다.8비트 녹색 채널 이미지에서 세그먼트 된 선 도구를 사용하여 모든 영화에 대해 동일한 원하는 방향 규칙을 사용하여 입자의 궤적을 따라 선을 추적하여 극성이 연구되는 모든 세포 안팎에서 일관되도록합니다. 라인 도구를 두 번 클릭하여 선 너비를 조정하여 트랙의 두께에 맞게 조정하고 10의 라인 너비를 사용하여 Kymo ToolBox 플러그인의 그리기 키모 매크로를 실행합니다. 시간과 공간에서 이미지를 보정하라는 메시지가 나타납니다.보정되면 kymograph가 생성되고 TIFF 파일로 저장할 수 있습니다. 파티클 궤적을 할당하려면 분할 된 선 도구를 사용하여 수집 기간 내내 kymograph의 각 입자를 수동으로 추적하고 ROI 관리자를 사용하여 각 입자 궤적을 관심 영역으로 기록합니다. 추가 분석을 위해 각 시간 경과 비디오당 관심 영역을 모두 저장하고 Kymo ToolBox 플러그인의 키모 분석 매크로를 실행합니다.드롭다운 메뉴에서 관심 셀의 핵에서 파티클 모션의 바깥쪽 방향을 정의하라는 요청창이 열립니다. 제한 속도는 관심있는 각화물에 대한 소프트웨어의 감도에 따라 정의되어야하며 라인 폭은 각 입자 궤적의 두께에 맞게 조정되어야합니다. 로그 모든 데이터 및 로그 추정 좌표는 다양한 화물 운송 매개 변수를 계산하기 위한 것이어야 합니다.확인을 클릭합니다. 개별 트랙에 대해 계산된 데이터는 kymograph당 풀을 만들고 각 이미지에 특정한 텍스트 파일에 저장됩니다. 시토신 아라비노사이드 처리와 흔들림 기반 정화 전략을 결합하면 정화 단계만 포함하는 전통적인 프로토콜에 비해 성상세포 배양의 순도가 강화됩니다.Lipofection 기반 의 트랜스페션은 독성을 유발하거나 성상 세포 생존가능성에 영향을 미치지 않으면서 살아있는 세포 이미징에 최적수준에서 단백질의 일시적인 발현을 허용합니다. 마찬가지로, 형광 프로브의 사용은 세포역학 및 성상 세포의 추적을 위한 산성 내피 소기관기관의 신속하고 효율적인 라벨링을 허용합니다. 이미징의 시간 경과 데이터는 시간과 공간에서 화물 움직임을 추적하는 kymographs를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.이러한 kymographs에서, 표시된 화물의 전방 이동은 부정적인 경사면이있는 궤적으로 표현되며 역행 운동은 긍정적 인 경사면이있는 궤적으로 표현됩니다. 고정 된 소포는 수직 궤적으로 나타납니다. 이 분석에서, 성상세포 영역을 통해 특정 화물의 플럭스의 정량화는 영화가 획득한 성상세포 영역에서 정상 기저선 운동성을 대표할 가능성이 있는 화물 중 모달 입자의 비율에 차이가 있음을 밝혔다.kymograph에서 얻은 각 입자에 대한 풀 타임 스케일을 따라 X, Y 위치의 변화의 정확한 매핑은 또한 화물 속도 및 실행 길이와 같은 다른 모션 매개 변수를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 고품질 성상세포 문화와 효율적인 화물 라벨링을 필요로 하므로, 경질 시약 잠복 기 및 획득 일정은 관심있는 각 플라스미드 또는 화물에 맞게 조정되어야 합니다. 이 프로토콜은 세포 손상, 독성, 병원성 돌연변이, 시냅스 활동 또는 세포 내 또는 세포 외 환경의 변화에 대한 응답으로 성상세포에서 의한 운송 이벤트를 특성화하도록 수정될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

연구

신경과학

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

이미징 세포 내 칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt; 유전자 인코딩 된 칼슘 표시기를 사용하여 성인 마우스의 선조체 성상의 신호

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

시각화 및 Adeno 관련 바이러스 및 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 Organotypic 뇌 조각에서 Oligodendrocyte 세포의 라이브 영상

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

크기, 모양, 및 결합 된 이다의 네트워크의 방향 분석

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

미세 유체 챔버 시스템을 사용하여 모터 뉴런 배양에서 세포기관의 축축한 수송

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...