Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

DNL ble støttet av University of North Carolina ved Chapel Hill (UNC) School of Medicine som en Simmons Scholar. TWR ble støttet av UNC PREP Grant R25 GM089569. Arbeid ved hjelp av UNC nevrovitenskap Center mikroskopi Core Facility ble støttet, delvis av midler fra NIH-NINDS nevrovitenskap Center support Grant P30 NS045892 og NIH-NICHD Intellectual og utviklingsmessige funksjonshemminger Research Center support Grant U54 HD079124.

Alle dyr prosedyrer ble utført med godkjennelse av University of North Carolina i Chapel Hill Animal Care and use Committee (IACUC).
1. Brain disseksjon og kultur av primær mus astrocytter
Merk: følgende protokoll ble tilpasset fra publiserte metoder, som følger den opprinnelige prosedyren utviklet av McCarthy og deVellis13,14,15. Blandet cellekulturer av McCarthy/deVelli...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+mammalian+development+and+disease.">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li><li>Allaman, I., B&#233;langer, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-neuron+metabolic+relationships:+for+better+and+for+worse.">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li><li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination.">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li><li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+Synapse+Formation,+Function,+and+Elimination.">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).</li><li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

Her beskriver vi en eksperimentell tilnærming til å uttrykke, visualisere og spore fluorescensmerkete merkede organeller og membran proteiner av interesse ved hjelp av time-lapse video mikroskopi i høy renhet primær mus kortikale MD astrocytter. Vi skisserer også en metodikk for måling av partikkel dynamikk. Direkte visualisering av protein og organelle dynamikk i primære astrocytter gir et kraftig verktøy for å studere regulering av intracellulære transport i disse cellene in vitro.
<p class="jove_content"...

Astrocytter er de mest tallrike cellene i det voksne sentralnervesystemet, hvor de utfører unike utviklings-og homøostatisk funksjoner1. Astrocytter modulere Synaptic utvikling gjennom direkte kontakt med pre-og postsynaptic terminaler som en del av Tri-partite synapse, som inneholder signalstoffer reseptorer, transportører, og celle vedheft molekyler som letter synapse formasjon og Nevron-astrocytt kommunikasjon2. I tillegg astrocytter aktivt kontrollere Synaptic overføring og hindre neuronal excitotoxicity ved raskt å fjerne eksitatoriske nevrotransmittere fra Synaptic kløft, resirkulering nevrotransmittere, og deltar i Synaptic beskjæring3 , 4 andre priser , 5 andre priser , 6. for å aktivere disse svært interaktive funksjoner, astrocytter kommunisere seg imellom, med andre gliacellene celler, og med neurons gjennom spesialiserte membran proteiner, inkludert celle vedheft molekyler, akvaporiner, ion kanaler, signal-transportører, og gap knutepunkt molekyler. Astrocytter aktivt endre overflaten nivåer av disse proteinene som svar på svingninger i deres intra-og ekstracellulære miljø7. Videre endringer i nivåer og fordeling av mitokondrier, lipid dråper, og degradative og gjenvinning organeller modulere energiforsyning, metabolitten tilgjengelighet, og cellulære clearing prosesser som er avgjørende for astrocytt funksjon og Overlevelse.
De dynamiske endringene i membran protein og organelle smugling og posisjonering i astrocytter er tilrettelagt av den felles funksjon av motor proteiner og adaptere som fremmer Last motilitet8,9. Tilsvarende er overflate nivåer av membran proteiner modulert gjennom internalisering og resirkulering hendelser10. Disse cargos transporteres via en intrikat nettverk av utgangen, mikrotubuli, og muligens mellomliggende filamenter spor8. Studier basert på immunofluorescence farging av end-binding protein 1 (EB1), som akkumuleres på den voksende mikrotubulinettverket pluss ender, tyder på at i astrocytter bunter av mikrotubuli stråle ut fra perinucleus og forlenge deres pluss ende mot periferien11. Men en omfattende undersøkelse av organiseringen og polariteten til mikrotubuli og andre cytoskjelettkomponenter elementer ved hjelp av Live-celle Imaging mangler fortsatt. Mens mange av mekanismene bak dynamikken i organeller og membran proteiner har blitt grundig studert i neurons og andre celletyper, er Last motilitet i astrocytter mindre godt forstått. De fleste av våre nåværende kunnskaper om endringer i protein og organelle distribusjon i astrocytter er basert på tradisjonell antistoff-basert merking av fast forberedelse, som utelukker presis romlig og timelig undersøkelse av Last dynamikk7, det er 12.
Her beskriver vi en metode for å merke membran proteiner og organeller for Live Imaging i høy renhet primære mus astrocytt kulturer. Ved hjelp av denne protokollen, gir vi eksempler der vi spore dynamisk lokalisering av grønne fluorescerende protein (GFP)-Tagged membran proteiner i transfekterte astrocytter, inkludert gapet krysset protein connexin 43 (Cx43-GFP) og eksitatoriske aminosyre transporter 1 (EAAT1-GFP). Vi beskriver også bruken av en fluorescerende acidotropic sonde for å visualisere Sure organeller og følge deres dynamikk i menneskehandel i live astrocytter. Til slutt viser vi hvordan du analyserer data for tidsforløp for å trekke ut og evaluere transport parametere for individuelle cargos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

Astrocytter er blant de mest tallrike celletyper i den voksne hjernen, hvor de spiller nøkkelroller i et mangfold av funksjoner. Som en sentral aktør i hjernen homeostase, astrocytter forsyne neurons med vitale metabolitter og buffer ekstracellulære vann, ioner og glutamat. En integrert del av "Tri-partite" synapse, astrocytter er også avgjørende i dannelsen, beskjæring, vedlikehold, og modulering av synapser. For å aktivere disse svært interaktive funksjoner, astrocytter kommunisere seg imellom og med andre gliacellene celler, neurons, hjernen blodkar, og ekstracellulære miljø gjennom en rekke spesialiserte membran proteiner som inkluderer celle vedheft molekyler, akvaporiner, ion kanaler, signalstoffer transportører, og gap Junction molekyler. For å støtte denne dynamiske Flux, astrocytter, som neurons, stole på tett koordinert og effektiv intracellulære transport. I motsetning til neurons, der intracellulære smugling har blitt omfattende avgrenset, mikrotubulinettverket transport i astrocytter har vært mindre studert. Likevel, EXO-og endocytic smugling av celle membran proteiner og intracellulære organelle transport appartefakter astrocytter ' normal biologi, og disse prosessene er ofte påvirket i sykdom eller som følge av skade. Her presenterer vi en grei protokoll til kultur av høy kvalitet murine astrocytter, å fluorescensmerkete etikett astrocytic proteiner og organeller av interesse, og å registrere deres intracellulære transport dynamikk ved hjelp av time-lapse konfokalmikroskopi mikroskopi. Vi viser også hvordan du kan trekke ut og kvantifisere relevante transport parametre fra ervervet filmene ved hjelp av tilgjengelig bildeanalyse programvare (dvs. ImageJ/FIJI) plugins.

Protokollen for å etablere primær mus MD astrocytter skissert ovenfor bør gi reproduserbar, høy kvalitet kulturer. Selv om kulturer i utgangspunktet inneholder en blanding av astrocytter, fibroblaster og andre gliacellene celler, inkludert mikroglia og oligodendrocytes (figur 1bi, BIV; røde pilspisser), minimerer tillegg av AraC til den blandede KULTUREN mellom DIV5-DIV7 spredning av disse miljøgifter celler. Den kombinerte AraC behandling og risting-basert rensing str...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Her beskriver vi en in vitro Live-imaging metode for å visualisere intracellulære transport av organeller og smugling av plasma membran proteiner i murine astrocytter. Denne protokollen presenterer også en bildeanalyse metodikk for å bestemme laste transport ruter og Kinetics.

Visualisere og analysere intracellulære transport av organeller og andre cargos i astrocytter

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Vår protokoll kan brukes til å undersøke motilitet og lokalisering av astrocytiske organeller eller proteiner under kontrollerte ekstracellulære miljøer og milde sykdomstilstander. I motsetning til MHA faste preparater, som gir enkle øyeblikksbilder av protein og organelle lokalisering, kan vår levende bildeteknikk brukes til å analysere partikkeldynamikk i individuelle levende astrocytter. Dagen før transfection frø astrocytter på riktig tetthet for avbildning ved 24 til 48 timer etter transfection.Fortynn leppeaveksjonsreagensen i redusert serummedium til riktig eksperimentell konsentrasjon. Fortynn fem mikrogram dna med høy renhet i 250 mikroliter med redusert serummedium og tilsett fem mikroliter av lipofection enhancer reagens til røret. Bland leppeofeksjonsreagensen med like volum av DNA-fettofeksjonsforsterkeren og inkuber oppløsningen i 15 minutter ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonen fjerner du supernatanten fra astrocyttkulturen og legger til 100 mikroliter av transfeksjonsblandingen dropwise til cellene. Etter seks timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, erstatt transfeksjonskomplekset med et passende volum av astrocyttkulturmedium og returner cellene til cellekulturinkubatoren i ytterligere 24 til 72 timer. 30 minutter før avbildningen, fortynne en passende lysosomal merking sonde i 200 mikroliter astrocytt kultur medium til en arbeidskonsentrasjon av en mikromolar og merke astrocytter med en sonde i 30 minutter ved 37 grader Celsius.Vask deretter cellene en gang med varmt astrocyttkulturmedium og erstatt vasken med bildemediet. Umiddelbart etter sondemerkingen plasserer du astrocyttkulturbeholderen i riktig adapter på mikroskopstadiet og bruker EBI fluorescenslys, finn cellene som uttrykker fluorescerende proteiner eller sonde. Bruk digitalkameraet til å justere fluorescerende prøvebelysning for å visualisere de valgte cellene og justere fokus og zoome inn i en enkelt celle.Bruk deretter Zoom- og Bestemt fokus-funksjonene til å hente én enkelt Z-stabel-tidsforløpsserie med en frekvens på ett bilde annethvert sekund for tidsintervaller mellom 300 og 500 sekunder. Lagre og eksporter tidsforløpsbildene som AVI- eller TIFF-stakkfiler. Hvis du vil analysere tidsforløpsbildene, åpner du bildesekvensen for tidsforløp i ImageJ eller Fiji og bruker verktøyet Del kanal til å dele kanalene.I det åtte bit grønne kanalbildet bruker du segmentert linje-verktøyet til å spore en linje langs partiklenes baner ved hjelp av den samme ønskede retningskonvensjonen for alle filmene, slik at polariteten er konsistent i og på tvers av alle cellene som studeres. Dobbeltklikk linjeverktøyet for å justere linjebredden slik at den samsvarer med tykkelsen på sporet, og kjør Draw Kymo-makroen i Plugin-modulen Kymo ToolBox ved hjelp av en linjebredde på 10. En melding som ber om å kalibrere bildet i tid og rom, vises.Når kalibrert, kymografer vil bli generert og kan lagres som TIFF-filer. Hvis du vil tilordne partikkelbaner, bruker du segmentert linje-verktøyet til å spore hver partikkel manuelt i kymografen i hele oppkjøpets varighet og bruke ROI-lederen til å registrere hver partikkelbane som et interesseområde. Lagre alle interesseområdene per hver time-lapse video for videre analyse og kjøre Analyser Kymo makro av Kymo ToolBox plugin.Et vindu vil åpne ber om å definere den ytre retningen av partikkelbevegelse fra kjernen av cellen av interesse fra rullegardinmenyen. Grensehastigheten bør defineres i henhold til følsomheten til programvaren for hver last av interesse, og linjebredden bør justeres for å matche tykkelsen på hver partikkelbane. Log All Data og Log Extrapolated Coordinates bør være for beregning av de ulike transportparametrene.Klikk ok. Dataene som beregnes for de enkelte sporene, vil da bli samlet per kymograf og lagret i tekstfiler som er spesifikke for hvert bilde. Kombinere cytosin arabinoside behandling med risting basert rensing strategi beriker renheten av astrocytt kulturer over tradisjonelle protokoller som inkluderer rensing trinn bare.Lipofection basert transfection tillater forbigående uttrykk for proteiner på nivåer som er optimale for live celleavbildning uten å forårsake toksisitet eller påvirker astrocytt levedyktighet. På samme måte tillater bruk av en fluorescerende sonde rask og effektiv merking av sure endolysosomale organeller for sporing av organelledynamikk og astrocytter. Tidsforløpsdataene fra bildet kan brukes til å generere kymografer som sporer lastbevegelse i tid og rom.I disse kymografene er anterograde bevegelse av den angitte lasten representert av baner med negative bakker, mens retrograd bevegelse er representert av baner med positive bakker. Stasjonære vesikler vises som vertikale baner. I denne analysen viste kvantifisering av fluksen av en bestemt last gjennom et område av astrocytten forskjeller i prosentandelen av modale partikler blant laster som sannsynligvis er representative for deres normale baselinjemotilitet i regionen av astrocytten der filmene ble kjøpt.Den nøyaktige kartleggingen av endringen i X, Y-posisjon langs fulltidsskalaen for hver partikkel hentet fra kymografen kan også brukes til å evaluere andre bevegelsesparametere, for eksempel lasthastighet og løpelengde. Siden denne protokollen krever høy kvalitet astrocytt kulturer og effektiv last merking, transfection reagens inkubasjon tid og oppkjøp tidslinjen bør justeres for hver plasmid eller last av interesse. Denne protokollen kan endres for å karakterisere transporthendelser i astrocytter som svar på celleskade, toksisitet, patogene mutasjoner, synaptisk aktivitet eller endringer i intra eller ekstracellulært miljø.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolasjon og kultur av mus Kortikale Astrocytes

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellulær Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i striatale Astrocytter fra voksne mus Bruke genetisk kodet Kalsium Indikatorer

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll for Tredimensjonal Confocal Morfometrisk Analyse av Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analysere Dendritic Morfologi i kolonner og Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering og Live bildebehandling av Oligodendrocyte Organelles i Organotypic hjernen skiver Adeno-assosiert Virus og AC Confocal mikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Analysere størrelse, form og retningen av nettverk av kombinert astrocyttene

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysere mitokondrietransport og morfologi i humant indusert pluripotente stamcelleavledede nevroner i arvelig spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonal Transport av organeller i motorneuronkulturer ved hjelp av mikrofluidiske kamre system

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Kile skive Forberedelse for å etterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...