Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

DNL была поддержана Университетом Северной Каролины в Чапел-Хилл (UNC) Школа медицины в качестве стипендиата Симмонса. TWR была поддержана КООН PREP Грант R25 GM089569. Работа с использованием КООН Центр нейронауки Центр Микроскоп Микроскоп Основные фонд был поддержан, в частности, за счет финансирования со стороны NIH-NINDS Неврология центр поддержки Грант P30 NS045892 и NIH-NICHD интеллектуальных и развития инвалидов научно-исследовательский центр Поддержка Грант U54 HD079124.

Все процедуры для животных были выполнены с одобрения Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл комитет по уходу за животными и использованию (IACUC).
1. Рассечение мозга и культура первичных астроцитов мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был адаптирован из...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+mammalian+development+and+disease.">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li><li>Allaman, I., B&#233;langer, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-neuron+metabolic+relationships:+for+better+and+for+worse.">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li><li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination.">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li><li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+Synapse+Formation,+Function,+and+Elimination.">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).</li><li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

Здесь мы описываем экспериментальный подход к выражению, визуализации и отслеживанию флуоресцентно помеченных органелл и мембранных белков, представляющих интерес, используя видеомикроскопию замедленного времени в высокой чистоте первичных корковых астроцитов MD мыши. Мы также изла...

Астроциты являются наиболее распространенными клетками в центральной нервной системе взрослого человека, где они выполняют уникальные функции развития и гомеостатических1. Астроциты модулируют синаптической развитие через прямой контакт с до- и постсинаптическими терминалами как часть трехпартитного синапса, который содержит нейромедиаторные рецепторы, транспортеры и молекулы клеточной адгезии, которые способствуют формированию синапса и нейрон-астроцитов связи2. Кроме того, астроциты активно контролируют синаптической передачи и предотвратить возневнищее экситотоксичность путем быстрого удаления возбуждающих нейротрансмиттеров из синаптической расщелины, рециркуляции нейротрансмиттеров, и участие в синаптической обрезкой3 , 4 , 5 , 6. Для того чтобы включить эти высоки взаимодействуючие функции, астроциты связывают между собой, с другими глиальными клетками, и с нейронами через специализированные протеины мембраны, включая молекулы стегезии клетки, aquaporins, каналы иона, нейромедиатор транспортеров, и разрыв узел молекул. Астроциты активно меняют поверхностные уровни этих белков в ответ на колебанияих внутри- и внеклеточной среды 7. Кроме того, изменения в уровнях и распределении митохондрий, липидных капель, а также деградативных и рециркуляционных органелл модулировать энергоснабжение, наличие метаболита и клеточных процессов очистки, которые имеют важное значение для астроцитов функции и Выживания.
Динамические изменения в мембранном белке и торговле органеллами и позиционировании в астроцитах способствуют согласованной функции моторных белков и адаптеров, которые способствуют подвижности грузов8,9. Аналогичным образом, поверхностные уровни мембранных белков модулируются через интернализацию и переработку событий10. Эти грузы перевозятся через сложную сеть актина, микротрубочки и, возможно, промежуточные нити треков8. Исследования, основанные на иммунофлуоресценции окрашивания конечной связывания белка 1 (EB1), который накапливается на растущей микротрубочки плюс концы, показывают, что в астроцитах пучки микротрубок излучают из периноклея и расширяют их плюс конец к периферии11. Тем не менее, комплексное изучение организации и полярности микротрубок и других цитоскелетных элементов с использованием живой клетки изображения по-прежнему отсутствует. В то время как многие из механизмов, лежащих в основе динамики органелл и мембранных белков, были широко изучены в нейронах и других типах клеток, подвижность груза в астроцитах менее хорошо понята. Большинство наших современных знаний об изменениях в распределении белков и органелл в астроцитах основано на традиционной маркировке фиксированной препаратом на основе антител, что исключает точное пространственное и временное изучение динамики груза7, 12.
Здесь мы описываем метод маркировки мембранных белков и органелл для живой визуализации в культурах астроцитов высокой чистоты. Используя этот протокол, мы приведиваем примеры, в которых мы отслеживаем динамическую локализацию зеленого флуоресцентного белка (GFP) помеченных мембранных белков в трансинфицированных астроцитах, включая разрыв соединения белка connexin 43 (Cx43-GFP) и возбуждающей аминокислоты транспортер 1 (EAAT1-GFP). Мы также описываем использование флуоресцентного ацидотропного зонда для визуализации кислых органелл и следованизаих их динамике торговли живыми астроцитами. Наконец, мы демонстрируем, как анализировать данные замедленного управления для извлечения и оценки транспортных параметров для отдельных грузов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

Астроциты являются одними из наиболее распространенных типов клеток во взрослом мозге, где они играют ключевую роль в множественности функций. Как центральный игрок в гомеостаз мозга, астроциты питания нейронов с жизненно важными метаболитами и буфервой внеклеточной воды, ионов и глутамата. Неотъемлемый компонент синапса «трипартита», астроциты также имеют решающее значение в формировании, обрезке, обслуживании и модуляции синапсов. Для того чтобы позволить эти высоки взаимодействуюные функции, астроциты связывают между собой и с другими глиальными клетками, невронами, сосудом мозга, и внеклеточной окружающей средой через множество специализированных протеинов мембраны которые включают клетки молекулы адгезии, аквапорины, ионные каналы, нейромедиаторные транспортеры и молекулы разрывных узлов. Для поддержки этого динамического потока астроциты, как и нейроны, полагаются на тесно скоординированный и эффективный внутриклеточный транспорт. В отличие от нейронов, где внутриклеточный оборот был широко разграничен, микротубулы на основе транспорта в астроцитах были менее изучены. Тем не менее, экзо- и эндоцитарный оборот клеточных мембранных белков и внутриклеточного транспортировки органеллы организует нормальную биологию астроцитов, и эти процессы часто страдают при болезни или в ответ на травму. Здесь мы представляем простой протокол для культуры высокого качества муринааааа, чтобы флуоресцентно маркировать астроцитические белки и органеллы, представляющие интерес, и записывать их внутриклеточной динамики транспорта с помощью замедленной конфокальной микроскопии. Мы также демонстрируем, как извлечь и количественно определить соответствующие параметры транспортировки из приобретенных фильмов с помощью доступных плагинов анализа изображений (т.е. ImageJ/FIJI).

Протокол для создания первичной мыши MD астроцитов, изложенных выше должны дать воспроизводимые, высокое качество культур. Хотя культуры первоначально содержат смесь астроцитов, фибробластов и других глиальных клеток, включая микроглии и олигодендроциты(рисунок 1B...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Здесь мы описываем метод живой визуализации in vitro для визуализации внутриклеточного переноса органелл и оборота плазменных мембранных белков в murine astrocytes. В этом протоколе также представлена методология анализа изображений для определения маршрутов грузовых перевозок и кинетики.

Визуализация и анализ внутриклеточного переноса органелл и других грузов в астроцитах

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Наш протокол может быть использован для исследования подвижности и локализации астроцитических органелл или белков под контролируемой внеклеточной средой и легкими состояниями заболеваний. В отличие от фиксированных препаратов MHA, которые обеспечивают одиночные снимки локализации белка и органеллы, наш метод живой визуализации может быть использован для анализа динамики частиц в отдельных живых астроцитах. За день до трансфекции семян астроцитов при соответствующей плотности для визуализации на 24 до 48 часов после трансфекции.Разбавить реагент липофеции в уменьшенной среде сыворотки до соответствующей экспериментальной концентрации. Разбавить пять микрограммов ДНК высокой чистоты в 250 микролитров уменьшенной среды сыворотки и добавить пять микролитров реагента липофека в трубку. Смешайте реагент липофекции с равным объемом смеси усилителя липофекции ДНК и инкубировать раствор в течение 15 минут при комнатной температуре.В конце инкубации удалите супернатант из культуры астроцитов и добавьте в клетки 100 микролитров трансинфекционные смеси. После шести часов при 37 градусах По Цельсию и 5%углеродного диоксида, замените трансфектный комплекс соответствующим объемом среды культуры астроцитов и верните клетки в инкубатор клеточной культуры еще на 24-72 часа. За 30 минут до визуализации разбавляют подходящий лизосомальный зонд маркировки в 200 микролитров астроцитов культуры среды до рабочей концентрации одного микромолара и маркировать астроциты с зондом в течение 30 минут при 37 градусах цельсия.Затем мыть клетки один раз с теплой астроцитов культуры среды и заменить мыть с изображением среды. Сразу же после маркировки зонда поместите контейнер культуры астроцитов в соответствующий адаптер на стадии микроскопа и с помощью EBI флуоресцентного света, найдите клетки, которые выражают флуоресцентные белки или зонд. Используйте цифровую камеру, чтобы настроить флуоресцентное освещение образца, чтобы визуализировать выбранные ячейки и настроить фокус и увеличить до одной ячейки.Затем используйте функции увеличить и определенного фокуса, чтобы приобрести одну серию промежуток времени с частотой одного кадра каждые две секунды для временных интервалов от 300 до 500 секунд. Сохранить и экспортировать покадровые изображения в качестве файлов стека AVI или TIFF. Для анализа изображений замедленного действия откройте последовательность изображений замедленного действия в ImageJ или Fiji и используйте инструмент Split Channel для разделения каналов.В восьми битном зеленом изображении канала используйте инструмент Segmented Line, чтобы проследить линию по траекториям частиц, используя ту же желаемую направленную конвенцию для всех фильмов, чтобы полярность была последовательной внутри и во всех изучаемых клетках. Дважды нажмите на инструмент Line, чтобы настроить ширину линии, чтобы соответствовать толщине трека и запустить draw Kymo макрос плагина Kymo ToolBox с использованием ширины линии 10. Появится запрос с просьбой откалибровать изображение во времени и пространстве.После калибровки кимографы будут сгенерированы и могут быть сохранены в качестве файлов TIFF. Чтобы назначить траектории частиц, используйте инструмент Segmented Line, чтобы вручную отслеживать каждую частицу в кимографе в течение всего срока приобретения и использовать менеджер рентабельности инвестиций для записи каждой траектории частицы в качестве области интересов. Сохранить все регионы, представляющие интерес для каждого замедленного видео для дальнейшего анализа и запустить анализ Kymo макро плагина Kymo ToolBox.Откроется окно с просьбой определить внешнее направление движения частиц из ядра ячейки, представляющих интерес, из меню высадки. Предельная скорость должна определяться в соответствии с чувствительностью программного обеспечения для каждого заинтересованного груза, а ширина линии должна быть скорректирована в соответствии с толщиной каждой траектории частицы. Для расчета различных параметров грузового транспорта должны быть экстраполированы координаты журнала «Все данные и журнал».Нажмите Хорошо. Данные, рассчитанные для отдельных треков, затем объединяются для кимографа и сохраняются в текстовых файлах, характерных для каждого изображения. Сочетание цитозин арабинозидной обработки со стратегией очистки на основе встряхивания обогащает чистоту культур астроцитов по отношению к традиционным протоколам, которые включают только шаг очистки.Липофекция на основе трансфекции позволяет преходящее выражение белков на уровнях, которые являются оптимальными для живой визуализации клеток, не вызывая токсичности или влияющих на жизнеспособность астроцитов. Аналогичным образом, использование флуоресцентного зонда позволяет быстро и эффективно маркировать кислые эндолизомальные органеллы для отслеживания динамики органелл и астроцитов. Данные замедленного действия изображения могут быть использованы для создания кимографов, отслеживая движение груза во времени и пространстве.В этих кимографах антероградное движение указанного груза представлено траекториями с отрицательными склонами, а ретроградное движение представлено траекториями с положительными склонами. Стационарные пузырьки отображаются как вертикальные траектории. В этом анализе количественная оценка потока конкретного груза через область астроцита выявила различия в проценте модальных частиц среди грузов, которые, вероятно, являются репрезентативными для их нормальной подвижности базовой линии в области астроцита, в пределах которого были приобретены фильмы.Точное отображение изменения положения X, Y по полной шкале времени для каждой частицы, полученной из кимографа, также может быть использовано для оценки других параметров движения, таких как скорость груза и длина бега. Поскольку этот протокол требует высококачественных культур астроцитов и эффективной маркировки грузов, время инкубации трансфекции реагентов и сроки приобретения должны быть скорректированы для каждой плазмиды или груза, представляющих интерес. Этот протокол может быть изменен для характеристики транспортных событий в астроцитах в ответ на повреждение клеток, токсичность, патогенные мутации, синаптической активности или изменения внутриклеточной или внеклеточной среды.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Флуоресценция Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) флуоресценции меткой Белки в Дендритные Шипы культивированный нейронов гиппокампа

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Выделение и культуры мышь кортикальной астроциты

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Изображений внутриклеточный Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Сигналы в полосатом теле астроциты от мышей помощью взрослого генетически закодированные показатели кальция

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Протокол трехмерной конфокальной морфометрического анализа астроцитов

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Анализ Дендритные Морфология в столбцах и слоях

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Визуализация и живой изображений Олигодендроциты органелл в Organotypic мозга фрагментов с помощью аденоассоциированный вирус и конфокальная микроскопия

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Анализируя размер, форму и направленность сетей спаренных астроциты

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Анализ митохондриального транспорта и морфологии в антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронов в наследственной спастической параплегии

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Аксональный Транспорт органелл в культурах моторных нейронов с использованием системы микрофлюидных камер

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Клин Фрагмент Подготовка для имитации In Vivo Нейрональной цепи подключения

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...