Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
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DNL fue apoyado por la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill (UNC) School of Medicine como becario Simmons. TWR fue apoyado por UNC PREP Grant R25 GM089569. El trabajo que utilizaba el Fondo de Microscopía del Centro de Neurociencia de la UNC fue apoyado, en parte, mediante la financiación del NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 y la NiH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Grant U54 HD079124.

Todos los procedimientos de animales se realizaron con la aprobación de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Disección cerebral y cultura de los astrocitos primarios del ratón
NOTA: El siguiente protocolo se adaptó a partir de métodos publicados, que sigue el procedimiento original desarrollado por McCarthy y deVellis13,14,<sup class="xre...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+mammalian+development+and+disease.">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li><li>Allaman, I., B&#233;langer, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-neuron+metabolic+relationships:+for+better+and+for+worse.">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li><li>Chung, W. S., Barres, B. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

Aquí, describimos un enfoque experimental para expresar, visualizar y rastrear orgánulos y proteínas de membrana etiquetados fluorescentemente de interés utilizando microscopía de vídeo de lapso de tiempo en astrocitos corticales MD de ratón primariode mayor pureza. También delineamos una metodología para medir la dinámica de partículas. La visualización directa de la dinámica de proteínas y orgáulos en astrocitos primarios proporciona una poderosa herramienta para estudiar la regulación del transporte in...

Los astrocitos son las células más abundantes en el sistema nervioso central adulto, donde realizan funciones únicas de desarrollo y homeostáticos1. Los astrocitos modulan el desarrollo sináptico a través del contacto directo con terminales pre y postsinápticos como parte de la sinapsis tripartito, que contiene receptores de neurotransmisores, transportadores y moléculas de adhesión celular que facilitan la formación de sinapsis y comunicación neurona-astrocito2. Además, los astrocitos controlan activamente la transmisión sináptica y previenen la excitotoxicidad neuronal eliminando rápidamente los neurotransmisores excitatorios de la hendidura sináptica, los neurotransmisores de reciclaje, y participando en la poda sináptica3 , 4 , 5 , 6. Para permitir estas funciones altamente interactivas, los astrocitos se comunican entre sí, con otras células gliales, y con las neuronas a través de proteínas de membrana especializadas, incluyendo moléculas de adhesión celular, acuporinas, canales ióniales, transportadores de neurotransmisores, y moléculas de unión de brecha. Los astrocitos cambian activamente los niveles superficiales de estas proteínas en respuesta a las fluctuaciones en su entorno intra y extracelular7. Además, los cambios en los niveles y la distribución de las mitocondrias, las gotas lipídicas y los orgánulos dedegradadores y reciclados modulan el suministro de energía, la disponibilidad de metabolitos y los procesos de limpieza celular que son esenciales para la función astrocitos y Supervivencia.
Los cambios dinámicos en el tráfico y posicionamiento de proteínas de membrana y orgánulos en astrocitos seven facilitados por la función concertada de las proteínas motoras y adaptadores que promueven la motilidad de carga 8,9. Del mismo modo, los niveles superficiales de proteínas de membrana se modulan a través de eventos de internalización y reciclaje10. Estas cargas se transportan a través de una intrincada red de actina, microtúbulos y, posiblemente, filamentos intermediosdelas pistas 8. Los estudios basados en la tinción de inmunofluorescencia de la proteína de unión final 1 (EB1), que se acumula en los extremos del microtúbulo más, sugieren que en los haces de los astrocitos de microtúbulos irradian desde el perinúcleo y extienden su extremo más hacia el periferia11. Sin embargo, todavía falta un examen exhaustivo de la organización y polaridad de los microtúbulos y otros elementos citoesqueléticos mediante imágenes de células vivas. Mientras que muchos de los mecanismos subyacentes a la dinámica de los orgánulos y proteínas de membrana se han estudiado ampliamente en las neuronas y otros tipos de células, la motilidad de carga en los astrocitos es menos bien entendida. La mayor parte de nuestro conocimiento actual sobre los cambios en la distribución de proteínas y orgánulos en los astrocitos se basa en el etiquetado tradicional basado en anticuerpos de preparación fija, que impide el examen espacial y temporal preciso de la dinámica de carga7, 12.
Aquí, describimos un método para etiquetar proteínas de membrana y orgánulos para imágenes en vivo en cultivos primarios de astrocitos de ratón de alta pureza. Usando este protocolo, proporcionamos ejemplos en los que rastreamos la localización dinámica de proteínas de membrana etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP) en astrocitos transinfectados, incluyendo la proteína de unión gap connexin 43 (Cx43-GFP) y el aminoácido excitatorio transportador 1 (EAAT1-GFP). También describimos el uso de una sonda acidotrópica fluorescente para visualizar orgánulos ácidos y seguir su dinámica de tráfico en astrocitos vivos. Por último, demostramos cómo analizar los datos de lapso de tiempo para extraer y evaluar los parámetros de transporte para cargas individuales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

Los astrocitos se encuentran entre los tipos de células más abundantes en el cerebro adulto, donde desempeñan un papel clave en una multiplicidad de funciones. Como un jugador central en homeostasis cerebral, los astrocitos suministran a las neuronas metabolitos vitales y amortiguan el agua extracelular, los iones y el glutamato. Un componente integral de la sinapsis "tri-partito", los astrocitos también son críticos en la formación, poda, mantenimiento y modulación de las sinapsis. Para permitir estas funciones altamente interactivas, los astrocitos se comunican entre sí y con otras células gliales, neuronas, la vasculatura cerebral y el entorno extracelular a través de una multitud de proteínas de membrana especializadas que incluyen moléculas de adhesión, aquaporinas, canales iónionales, transportadores de neurotransmisores y moléculas de unión de separación. Para apoyar este flujo dinámico, los astrocitos, como las neuronas, dependen del transporte intracelular estrechamente coordinado y eficiente. A diferencia de las neuronas, donde el tráfico intracelular se ha delineado ampliamente, el transporte basado en microtúbulos en astrocitos ha sido menos estudiado. No obstante, el tráfico exo y endocítico de proteínas de membrana celular y transporte intracelular de orgáyos organiza la biología normal de los astrocitos, y estos procesos a menudo se ven afectados por enfermedades o en respuesta a lesiones. Aquí presentamos un protocolo sencillo para el cultivo de astrocitos murinas de alta calidad, para etiquetar fluorescentemente proteínas astrocíticas y orgánulos de interés, y para registrar su dinámica de transporte intracelular utilizando microscopía confocal de lapso de tiempo. También demostramos cómo extraer y cuantificar los parámetros de transporte relevantes de las películas adquiridas utilizando plugins de software de análisis de imágenes disponibles (es decir, ImageJ/FIJI).

El protocolo para establecer astrocitos MD de ratón primario descrito anteriormente debería producir cultivos reproducibles y de alta calidad. Aunque los cultivos inicialmente contienen una mezcla de astrocitos, fibroblastos y otras células gliales, incluyendo microglia y oligodendrocitos (Figura1Bi,Biv;puntas de flecha rojas), la adición de AraC al cultivo mixto entre DIV5-DIV7 minimiza la proliferación de estas células contaminantes. El tratamiento combinado de AraC ...

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Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Aquí describimos un método in vitro de imágenes en vivo para visualizar el transporte intracelular de orgánulos y el tráfico de proteínas de membrana plasmática en astrocitos murinos. Este protocolo también presenta una metodología de análisis de imágenes para determinar los itinerarios de transporte de carga y la cinética.

Visualización y análisis del transporte intracelular de organelos y otros Cargos en astrocitos

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Nuestro protocolo se puede utilizar para investigar la motilidad y localización de orgánulos astrocíticos o proteínas bajo ambientes extracelulares controlados y estados de enfermedad leves. A diferencia de las preparaciones fijas MHA, que proporcionan instantáneas individuales de localización de proteínas y orgánulos, nuestra técnica de imágenes en vivo se puede utilizar para analizar la dinámica de partículas en astrocitos vivos individuales. El día antes de la transfección se astrocita a la densidad adecuada para la toma de imágenes a las 24 a 48 horas después de la transfección.Diluir el reactivo de lipofección en un medio sérico reducido a la concentración experimental adecuada. Diluir cinco microgramos de ADN de alta pureza en 250 microlitros de medio sérico reducido y añadir cinco microlitros de reactivo potenciador de lipofección al tubo. Mezclar el reactivo de lipofección con un volumen igual de la mezcla del potenciador de lipofción de ADN e incubar la solución durante 15 minutos a temperatura ambiente.Al final de la incubación, retire el sobrenadante del cultivo de astrocitos y agregue 100 microlitros de la mezcla de transfección a las células. Después de seis horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, reemplace el complejo de transfección por un volumen adecuado de medio de cultivo de astrocitos y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 24 a 72 horas adicionales. 30 minutos antes de la toma de imágenes, diluir una sonda de etiquetado lisosomal adecuada en 200 microlitros de astrocitos medios a una concentración de trabajo de un micromolar y etiquetar los astrocitos con una sonda durante 30 minutos a 37 grados celsius.Luego lave las células una vez con un medio de cultivo de astrocitos calientes y reemplace el lavado con un medio de imagen. Inmediatamente después del etiquetado de la sonda, coloque el recipiente de cultivo de astrocitos en el adaptador apropiado en la etapa del microscopio y utilizando la luz de fluorescencia EBI, localice las células que expresan proteínas fluorescentes o sonda. Utilice la cámara digital para ajustar la iluminación de la muestra fluorescente para visualizar las celdas seleccionadas y ajustar el enfoque y acercar a una sola celda.A continuación, utilice las funciones Zoom y Enfoque definido para adquirir una sola serie de lapso de tiempo de pila Z a una frecuencia de un fotograma cada dos segundos para intervalos de tiempo que oscilan entre 300 y 500 segundos. Guarde y exporte las imágenes de lapso de tiempo como archivos de pila AVI o TIFF. Para analizar las imágenes de lapso de tiempo, abra la secuencia de imágenes de lapso de tiempo en ImageJ o Fiji y utilice la herramienta Canal dividido para dividir los canales.En la imagen de canal verde de ocho bits, utilice la herramienta Línea segmentada para trazar una línea a lo largo de las trayectorias de las partículas utilizando la misma convención direccional deseada para todas las películas, de modo que la polaridad sea coherente dentro y a través de todas las celdas que se están estudiando. Haga doble clic en la herramienta Línea para ajustar el ancho de línea para que coincida con el grosor de la pista y ejecute la macro Dibujar Kymo del complemento Kymo ToolBox utilizando un ancho de línea de 10. Aparecerá un mensaje que pide calibrar la imagen en tiempo y espacio.Una vez calibrados, se generarán kymographs y se pueden guardar como archivos TIFF. Para asignar trayectorias de partículas, utilice la herramienta Línea segmentada para realizar un seguimiento manual de cada partícula del kymograma durante toda la adquisición y utilice el gestor de ROI para registrar cada trayectoria de partícula como una región de interés. Guarde todas las regiones de interés por cada vídeo de lapso de tiempo para un análisis posterior y ejecute la macro Analizar Kymo del plugin Kymo ToolBox.Se abrirá una ventana pidiendo definir la dirección exterior del movimiento de partículas desde el núcleo de la celda de interés desde el menú desplegable. La velocidad límite debe definirse de acuerdo con la sensibilidad del software para cada carga de interés y el ancho de línea debe ajustarse para que coincida con el grosor de cada trayectoria de partícula. Las coordenadas extrapoladas Registrar todos los datos y El registro deben ser para el cálculo de los distintos parámetros de transporte de carga.Haga clic en Aceptar. Los datos calculados para las pistas individuales se agruparán por cifrógrafo y se guardarán en archivos de texto específicos de cada imagen. La combinación del tratamiento de la citosina arabinosa con la estrategia de purificación basada en el temblor enriquece la pureza de los cultivos de astrocitos sobre los protocolos tradicionales que incluyen el paso de purificación solamente.La transfección basada en lipofección permite la expresión transitoria de proteínas a niveles óptimos para la toma de imágenes de células vivas sin causar toxicidad o afectar la viabilidad de los astrocitos. Del mismo modo, el uso de una sonda fluorescente permite el etiquetado rápido y eficiente de los orgánulos endolysosomal ácidos para el seguimiento de la dinámica de organelélica y los astrocitos. Los datos de lapso de tiempo de las imágenes se pueden utilizar para generar cifógrafos que rastrean el movimiento de la carga en tiempo y espacio.En estos kymografos, el movimiento anterogrado de la carga indicada está representado por trayectorias con pendientes negativas, mientras que el movimiento retrógrado está representado por trayectorias con pendientes positivas. Las vesículas estacionarias aparecen como trayectorias verticales. En este análisis, la cuantificación del flujo de una carga específica a través de un área del astrocito reveló diferencias en el porcentaje de partículas modales entre las cargas que probablemente son representativas de su motilidad de línea base normal en la región del astrocito dentro de la cual se adquirieron las películas.El mapeo preciso del cambio en la posición X, Y a lo largo de la escala de tiempo completa para cada partícula obtenida del cifógrafo también se puede utilizar para evaluar otros parámetros de movimiento, como la velocidad de la carga y la longitud de la carrera. Dado que este protocolo requiere cultivos de astrocitos de alta calidad y etiquetado eficiente de la carga, el tiempo de incubación del reactivo de transfección y el plazo de adquisición deben ajustarse para cada plásmido o carga de interés. Este protocolo se puede modificar para caracterizar eventos de transporte en astrocitos en respuesta a daños celulares, toxicidad, mutaciones patógenas, actividad sináptica o cambios en el entorno intra o extracelular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Investigación

Neurociencias

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en estriatal astrocitos de ratones adultos a través de indicadores de calcio codificados genéticamente-

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualización y en proyección de imagen del Oligodendrocyte organelos en rebanadas de cerebro Organotypic mediante Virus Adeno-asociado y Microscopía Confocal

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Analizar el tamaño, forma y direccionalidad de las redes de astrocitos acoplados

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Transporte axónico de organelos en cultivos de neuronas motoras utilizando el sistema de cámaras microfluídicas

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...