Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

DNL fick stöd av University of North Carolina på Chapel Hill (UNC) School of Medicine som Simmons Scholar. TWR stöddes av UNC PREP Grant R25 GM089569. Arbeta med hjälp av UNC Neuroscience Center mikroskopi Core facility stöddes delvis av finansiering från NIH-NINDS neurovetenskap Center support Grant P30 NS045892 och NIH-NICHD intellektuella och utvecklingsstörning Research Center support Grant U54 HD079124.

Alla djurförsök utfördes med godkännande av University of North Carolina på Chapel Hill Animal Care och use Committee (IACUC).
1. hjärn dissektion och kultur av primära mus astrocyter
Anmärkning: följande protokoll anpassades från publicerade metoder, som följer den ursprungliga proceduren som utvecklats av McCarthy och devellis13,14,15. Blandade cellkulturer av Mc...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+mammalian+development+and+disease.">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li><li>Allaman, I., B&#233;langer, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-neuron+metabolic+relationships:+for+better+and+for+worse.">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li><li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination.">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li><li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+Synapse+Formation,+Function,+and+Elimination.">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).</li><li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

Här beskriver vi en experimentell metod för att uttrycka, visualisera och spåra Fluorescent taggade organeller och membranproteiner av intresse med hjälp av Time-lapse video mikroskopi i hög renhet primära mus kortikala MD astrocyter. Vi beskriver också en metod för att mäta partikel dynamiken. Direkt visualisering av protein och organell dynamik i primära astrocyter ger ett kraftfullt verktyg för att studera regleringen av intracellulär transport i dessa celler in vitro-.
Metoden ...

Astrocyter är de vanligast förekommande cellerna i den vuxna centralanervsystemet, där de utför unika utvecklings-och homeostatiska funktioner1. Astrocyter modulera synaptisk utveckling genom direkt kontakt med pre-och postsynaptiska terminaler som en del av Tri-partssynapsen, som innehåller signalsubstansen receptorer, transportörer, och cell adhesionsmolekyler som underlättar synapsen bildas och neuron-astrocyte kommunikation2. Dessutom, astrocyter aktivt kontroll synaptisk transmission och förhindra neuronala excitotoxicitet genom att snabbt ta bort excitatoriska neurotransmittorer från den synaptiska spalten, återvinning neurotransmittorer, och deltar i Synaptic beskärning3 , 4 , ,5 , 6. för att möjliggöra dessa mycket interaktiva funktioner, astrocyter kommunicera sinsemellan, med andra gliaceller celler, och med nervceller genom specialiserade membranproteiner, inklusive cell adhesionsmolekyler, aquaporins, jonkanaler, signalsubstansen transportörer och gap Junction molekyler. Astrocyter förändrar aktivt ytnivåerna av dessa proteiner som svar på fluktuationer i deras intraoch extracellulära miljö7. Dessutom, förändringar i nivåer och distribution av mitokonsamerna, lipiddroppar, och nedbrytande och återvinning organeller modulera energiförsörjning, metabolit tillgänglighet, och cellulära Clearing processer som är viktiga för astrocytmodell funktion och Överlevnad.
De dynamiska förändringarna i membranprotein och organell handel och positionering i astrocyter underlättas av den samordnade funktionen av motorproteiner och adaptrar som främjar Last motilitet8,9. På liknande sätt är ytskikt av membranproteiner modulerade genom internalisering och återvinningshändelser10. Dessa laster transporteras via ett intrikat nätverk av Actin, microtubules, och möjligen mellanliggande glödtrådar spår8. Studier baserade på immunofluorescens färgning av slutbindande protein 1 (EB1), som ackumuleras vid den växande mikrotubuli plus ändar, tyder på att i astrocyter buntar av mikrotubuli utstrålar ut från perinucleus och förlänga deras plus änden mot peripheryen11. Emellertid, en omfattande undersökning av organisationen och polaritet av mikrotubuli och andra cytoskeletala element med hjälp av levande cell avbildning saknas fortfarande. Medan många av de mekanismer som ligger bakom dynamiken i organeller och membranproteiner har studerats i stor utsträckning i nervceller och andra celltyper, är Last motilitet i astrocyter mindre väl förstådd. De flesta av våra nuvarande kunskaper om förändringar i protein och organell distribution i astrocyter är baserad på traditionell antikroppsbaserad märkning av fasta preparat, vilket utesluter noggrann rumslig och tidsmässig undersökning av lastdynamik7, 12.
Här beskriver vi en metod för att märka membranproteiner och organeller för levande avbildning i hög renhet primära mus astrocytkulturer. Med hjälp av detta protokoll ger vi exempel där vi spårar den dynamiska lokaliseringen av grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta membranproteiner i transfekterade astrocyter, inklusive gap Junction protein Connexin 43 (Cx43-GFP) och den excitatoriska aminosyran transportör 1 (EAAT1-GFP). Vi beskriver också användningen av en fluorescerande sur-tropisk sond för att visualisera sura organeller och följa deras människohandel dynamik i levande astrocyter. Slutligen visar vi hur man analyserar tids fördröjnings data för att extrahera och utvärdera transportparametrar för enskilda laster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

Astrocyter är bland de vanligast förekommande celltyperna i den vuxna hjärnan, där de spelar nyckelroller i en mångfald av funktioner. Som en central aktör i hjärnan homeostas, astrocyter leverera nervceller med vitala metaboliter och buffert extracellulära vatten, joner, och glutamat. En integrerad del av "Tri-parts" synapsen, astrocyter är också kritiska i bildandet, beskärning, underhåll, och modulering av synapser. För att möjliggöra dessa mycket interaktiva funktioner, astrocyter kommunicera sinsemellan och med andra gliaceller celler, nervceller, hjärnan vasculature, och den extracellulära miljön genom en mängd specialiserade membranproteiner som innehåller cell adhesionsmolekyler, aquaporiner, jonkanaler, signalsubstans transportörer och gap Junction molekyler. För att stödja denna dynamiska Flux, astrocyter, som nervceller, förlita sig på tätt samordnade och effektiva intracellulära transport. Till skillnad från neuroner, där intracellulär människohandel har omfattande avgränsas, har mikrotubule-baserade transporter i astrocyter varit mindre studerade. Icke desto mindre iscengör EXO-och endocytisk handel med cellmembran proteiner och intracellulär organell transport astrocyter normala biologi, och dessa processer är ofta drabbade av sjukdom eller som svar på skada. Här presenterar vi ett enkelt protokoll för att odla hög kvalitet murina astrocyter, att överföras etikett astrocytic proteiner och organeller av intresse, och att spela in sina intracellulära transportdynamik med hjälp av tidsförlopp konfokal mikroskopi. Vi visar också hur man extraherar och kvantifiera relevanta transportparametrar från de förvärvade filmerna med hjälp av tillgängliga bildanalysprogram (dvs ImageJ/FIJI) plugins.

Protokollet för fastställande av primär mus MD astrocyter som beskrivs ovan bör ge reproducerbara, hög kvalitet kulturer. Även om kulturer inledningsvis innehåller en blandning av astrocyter, fibroblaster och andra gliaceller, inklusive mikroglia och oligodendrocyter (figur 1bi, BIV; röda pilspetsar), tillägg av Arac till blandad kultur mellan DIV5-DIV7 minimerar spridningen av dessa kontaminantceller. Den kombinerade AraC-behandlingen och skakbaserad renings strate...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Här beskriver vi en in vitro Live-Imaging metod för att visualisera intracellulär transport av organeller och handel med plasmamembran proteiner i murina astrocyter. Detta protokoll innehåller också en bildanalys metod för att bestämma transport resvägar och kinetik.

Visualisera och analysera intracellulär transport av organeller och andra laster i astrocyter

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Vårt protokoll kan användas för att undersöka motilitet och lokalisering av astrocytiska organeller eller proteiner under kontrollerade extracellulära miljöer och mild sjukdom stater. Till skillnad från MHA fasta preparat, som ger enstaka ögonblicksbilder av protein och organell lokalisering, kan vår levande bildframställning teknik användas för att analysera partikeldynamik i enskilda levande astrocyter. Dagen före transfektionsfröet astrocyterna vid lämplig densitet för avbildning vid 24 till 48 timmar efter transfection.Späd lipofection-reagensen i reducerat serummedium till lämplig experimentell koncentration. Späd fem mikrogram hög renhet DNA i 250 mikroliter av reducerat serum medium och tillsätt fem mikroliter av lipofection enhancer reagens till röret. Blanda lipofection-reagensen med en lika stor volym av mixen DNA-lipofection-förstärkare och inkubera lösningen i 15 minuter vid rumstemperatur.Vid slutet av inkubationen, ta bort supernatanten från astrocytekulturen och tillsätt 100 mikroliters av transfektionsblandningen droppvis till cellerna. Efter sex timmar vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid, ersätta transfektionskomplexet med en lämplig volym av astrocyter odlingsmedium och returnera cellerna till cellodlingsinkubatorn i ytterligare 24 till 72 timmar. 30 minuter före avbildningen, späd en lämplig lysosomal märkningssond i 200 mikroliter av astrocyter odlingsmedium till en arbetskoncentration av en mikromolar och märka astrocyterna med en sond i 30 minuter vid 37 grader Celsius.Tvätta sedan cellerna en gång med varmt astrocyter odlingsmedium och ersätta tvätten med bildbehandlingsmedium. Omedelbart efter sonden märkning, placera astrocyter kultur behållaren i lämplig adapter på mikroskopet scenen och med hjälp av EBI fluorescens ljus, lokalisera de celler som uttrycker fluorescerande proteiner eller sond. Använd digitalkameran för att justera den fluorescerande provbelysningen för att visualisera de valda cellerna och justera fokus och zooma in till en enda cell.Använd sedan funktionerna Zoom och Definite Focus för att skaffa en enda Z-stack-time-lapse-serie med en frekvens av en bildruta varannan sekund för tidsintervaller som sträcker sig mellan 300 och 500 sekunder. Spara och exportera timelapse-bilderna som AVI- eller TIFF-stackfiler. Om du vill analysera timelapsebilderna öppnar du tidsfördröjningsbildsekvensen i ImageJ eller Fiji och använder verktyget Dela kanal för att dela kanalerna.I den åtta bitar gröna kanalbilden använder du verktyget Segmenterad linje för att spåra en linje längs partiklarnas banor med samma önskade riktningskonvention för alla filmer så att polariteten är konsekvent inom och över alla de celler som studeras. Dubbelklicka på linjeverktyget för att justera linjebredden så att den matchar tjockleken på spåret och kör den Rita Kymo makrot i Kymo ToolBox plugin med hjälp av en linjebredd på 10. En uppmaning om att kalibrera bilden i tid och rum kommer att visas.När de är kalibrerade kommer kymographs att genereras och kan sparas som TIFF-filer. Tilldela partikelbanor genom att använda verktyget Segmenterad linje för att manuellt spåra varje partikel i kymograph för hela förvärvstiden och använda ROI-chefen för att registrera varje partikelbana som en region av intresse. Spara alla de regioner av intresse per varje time-lapse video för ytterligare analys och kör Analysera Kymo makrot i Kymo ToolBox plugin.Ett fönster kommer att öppna ber att definiera den yttre riktningen av partikel rörelse från kärnan i cellen av intresse från dropdown menyn. Gränshastigheten bör definieras enligt programvarans känslighet för varje last av intresse och linjebredden bör justeras så att den överensstämmer med tjockleken på varje partikelbana. Log All Data och Logga Extrapolerade Koordinater ska vara för beräkning av de olika lasttransportparametrarna.Klicka på Okej. De data som beräknas för de enskilda spåren kommer sedan att poolas per kymograf och sparas i textfiler som är specifika för varje bild. Att kombinera cytosin arabinoside behandling med skakningar baserade reningsstrategi berikar renhet astrocyter kulturer över traditionella protokoll som inkluderar rening steg bara.Lipofection baserad transfektion tillåter övergående uttryck av proteiner på nivåer som är optimala för levande cell avbildning utan att orsaka toxicitet eller påverkar astrocyter livskraft. På samma sätt tillåter användningen av en fluorescerande sond en snabb och effektiv märkning av sura endolysosomala organeller för spårning av organelldynamik och astrocyter. Time-lapse-data från bildåtergivningen kan användas för att generera kymografer som spårar laströrelse i tid och rum.I dessa kymographs representeras anterograderörelsen av den indikerade lasten av banor med negativa sluttningar, medan bakåtsträvande rörelse representeras av banor med positiva backar. Stationära vesiklar visas som vertikala banor. I denna analys, kvantifiering av fluss av en specifik last genom ett område av astrocyten visade skillnader i andelen av modala partiklar bland laster som sannolikt är representativa för deras normala baslinje motilitet i regionen av astrocyten inom vilken filmerna förvärvades.Den exakta kartläggningen av förändringen i X, Y-position längs hela tidsskalan för varje partikel som erhålls från kymograph kan också användas för att utvärdera andra rörelseparametrar, såsom lasthastighet och körlängd. Eftersom detta protokoll kräver högkvalitativa astrocyter kulturer och effektiv lastmärkning, transfection reagens inkubationstiden och förvärvet tidslinjen bör justeras för varje plasmid eller last av intresse. Detta protokoll kan ändras för att karakterisera transporthändelser i astrocyter som svar på cellskador, toxicitet, patogena mutationer, synaptisk aktivitet eller förändringar i den intra- eller extracellulära miljön.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) av fluorescens märkta proteiner i Dendritutskotten hos odlade hippocampus nervceller

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolering och odling av Mus Kortikala Astrocyter

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging intracellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i Striatal Astrocyter från vuxna möss använda genetiskt kodade kalcium indikatorer

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll för Tredimensionell Confocal Morfometrisk Analys av Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analysera Dendritic morfologi i kolumner och lager

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering och levande avbildning av Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjärnan skivor med hjälp av Adeno-associerade Virus och konfokalmikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Analysera den storlek, form och riktningen av nätverk av kopplade astrocyter

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysera mitokondriell transport och morfologi i mänskliga inducerad pluripotent stamcell-härledda nervceller i ärftliga spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonal Transport av organeller i motor neuron kulturer med microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Förberedelse för Härma In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...