Name: visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

DNL, Kuzey Carolina Üniversitesi tarafından Chapel Hill (UNC) Tıp Fakültesi'nde Simmons Bursu ile desteklenmiştir. TWR UNC PREP Grant R25 GM089569 tarafından desteklenmiştir. UNC Nörobilim Merkezi Mikroskobu Çekirdek Tesisi'ni kullanan çalışmalar kısmen NIH-NINDS Nörobilim Merkezi Destek Desteği P30 NS045892 ve NIH-NICHD Entelektüel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi Destek Destek U54 tarafından desteklendi. HD079124.

Tüm hayvan prosedürleri Chapel Hill Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Kuzey Carolina Üniversitesi onayı ile yapıldı.
1. Beyin diseksiyonu ve birincil fare astrositkültürü
NOT: Aşağıdaki protokol, McCarthy ve deVellis13,14,15tarafından geliştirilen orijinal prosedürü takip eden yayınlanmış yöntemlerden uyarlanmıştır. McCarthy/deVellis (MD) astr...

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+Glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li><li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+mammalian+development+and+disease.">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li><li>Allaman, I., B&#233;langer, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-neuron+metabolic+relationships:+for+better+and+for+worse.">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li><li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination.">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li><li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+Synapse+Formation,+Function,+and+Elimination.">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).</li><li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP.">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li><li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes.">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li><li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes.">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li><li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway.">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).</li><li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection.">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells.">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li><li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport.">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li><li>. IJ KymoToolBox Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016)</li></ol>

Burada, yüksek saflıkta birincil fare kortikal MD astrositlerinde hızlandırılmış video mikroskobu kullanarak floresan etiketli organelleri ve membran proteinlerini ifade etmek, görselleştirmek ve izlemek için deneysel bir yaklaşımı tanımlıyoruz. Ayrıca parçacık dinamiklerini ölçmek için bir metodoloji anahat. Birincil astrositlerde protein ve organel dinamiğinin doğrudan görselleştirilmesi, bu hücrelerde hücre içi taşımanın düzenlenmesini in vitro olarak incelemek için güçlü bir araç ...

Astrositler yetişkin merkezi sinir sisteminde en bol hücrelerdir, onlar benzersiz gelişimsel ve homeostatik fonksiyonları gerçekleştirmeknerede 1. Astrositler, nörotransmitter reseptörleri, taşıyıcılar ve sinaps oluşumunu kolaylaştıran hücre adezyon moleküllerini içeren üçlü sinapsların bir parçası olarak pre-ve postsinaptik terminallerle doğrudan temas yoluyla sinaptik gelişimi modüle eder. ve nöron-astrosit iletişimi2. Buna ek olarak, astrositler sinaptik iletimi aktif olarak kontrol eder ve sinaptik yarıktan çıkarıcı nörotransmitterleri hızla çıkararak nöronal eksitotoksisiteyi önler, nörotransmitterleri geri dönüştürer ve sinaptik budama dakatılır3 , 4.2.2 , 5.000 , 6. Bu son derece etkileşimli fonksiyonları etkinleştirmek için, astrositler kendi aralarında iletişim kurmak, diğer glial hücreleri ile, ve özel membran proteinleri aracılığıyla nöronlar ile, hücre adezyon molekülleri de dahil olmak üzere, aquaporins, iyon kanalları, nörotransmitter taşıyıcılar ve boşluk kavşak molekülleri. Astrositler, hücre içi ve hücre dışı ortamlarındaki dalgalanmalara yanıt olarak buproteinlerin yüzey düzeylerini aktif olarak değiştirirler 7. Ayrıca, astrosit fonksiyonu için gerekli olan mitokondri, lipid damlacıkları ve bozunatif ve geri dönüşüm organellerinin seviyelerinde ve dağılımındaki değişiklikler enerji arzını, metabolit kullanılabilirliğini ve hücresel temizleme süreçlerini modüle eder ve Hayatta kalma.
Membran protein ve organel ticareti ve astrositlerde konumlandırma dinamik değişiklikler motor proteinlerve adaptörlerin uyumlu fonksiyonu ile kolaylaştırılır kargo hareketliliği teşvik8,9. Benzer şekilde, membran proteinlerinin yüzey seviyeleri içselleştirme ve geri dönüşüm olayları ile modüle edilir10. Bu kargolar aktin, mikrotübüller ve muhtemelen ara filamentler parça karmaşık bir ağ üzerinden taşınır8. Büyüyen mikrotübül artı uçlarında biriken son bağlayıcı protein 1'in (EB1) immünororesans boyamasını temel alan çalışmalar, mikrotübüllerin astrosit demetlerinde perinükleustan dışarı yayılarak artı uçlarını çevre11. Ancak, canlı hücre görüntüleme kullanarak mikrotübüller ve diğer sitoskeletal elementlerin organizasyon ve polarite kapsamlı bir inceleme hala eksiktir. Organellerin ve membran proteinlerinin dinamiğinin altında yatan mekanizmaların çoğu nöronlarda ve diğer hücre tiplerinde kapsamlı bir şekilde incelenmekle birlikte, astrositlerde kargo hareketliliği daha az anlaşılmaktadır. Astrositlerde protein ve organel dağılımındaki değişiklikler hakkındaki mevcut bilgilerimizin çoğu, kargo dinamiklerinin hassas mekansal ve zamansal incelemesini engelleyen sabit preparatın geleneksel antikor bazlı etiketlemesini temel alıyor7, 12. Yıl.
Burada, yüksek saflıkta birincil fare astrosit kültürlerinde canlı görüntüleme için membran proteinleri ve organelleri etiketlemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokolü kullanarak, transfekte astrositlerde yeşil floresan proteinin (GFP) etiketli membran proteinlerinin dinamik lokalizasyonunu izlediğimiz, gap kavşak proteinconnexin 43 (Cx43-GFP) ve uyarıcı amino asit dahil olmak üzere örnekler salıyoruz. taşıyıcı 1 (EAAT1-GFP). Ayrıca asidik organelleri görselleştirmek ve canlı astrositlerde insan ticareti dinamiklerini takip etmek için floresan asiotropik prob kullanımını da tanımlıyoruz. Son olarak, tek tek kargolar için taşıma parametrelerini ayıklamak ve değerlendirmek için hızlandırılmış verilerin nasıl analiz edilebildiğini gösteriyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-203-637</td>
			<td>Sorvall ST8 Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>WSN-AXIOVERT A1</td>
			<td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi 305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat-Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version 1.52i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Style #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>012-63000</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3670S</td>
			<td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes</td>
			<td>Mattek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7526</td>
			<td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KymoToolBox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Enhancer Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11514015</td>
			<td>Plus Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15338100</td>
			<td>Lipofectamine LTX reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>8261-30-1008</td>
			<td>Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>25-507x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>OPTI-MEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-209</td>
			<td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filter Systems</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-227</td>
			<td>500 ml, PES membrane, 0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and analyzing intracellular transport of organelles and other cargos in astrocytes

Astrositler yetişkin beyninde en bol hücre tipleri arasında yer alır, onlar fonksiyonların çokluğu önemli rol oynarlar. Beyin homeostaz merkezi bir oyuncu olarak, astrositler hayati metabolitleri ve tampon ekstrasellüler su, iyonlar ve glutamat ile nöronkaynağı. "Üçlü" sinapsayrılmaz bir bileşeni olan astrositler, sinapsların oluşumunda, budamasında, bakımında ve modülasyonunda da önemlidir. Bu son derece etkileşimli fonksiyonları etkinleştirmek için, astrositler kendi aralarında ve diğer glial hücreler, nöronlar, beyin vaskülatürü ve hücre dışı çevre ile hücre içeren özel membran proteinleri çok sayıda iletişim yapışma molekülleri, aquaporinler, iyon kanalları, nörotransmitter taşıyıcılar ve boşluk bağlantı molekülleri. Bu dinamik akı desteklemek için, astrositler, nöronlar gibi, sıkı koordine ve verimli hücre içi taşıma güveniyor. Hücre içi ticaretin yaygın olarak açıklandığı nöronların aksine, astrositlerde mikrotübül bazlı ulaşım daha az çalışılmıştır. Bununla birlikte, hücre zarı proteinlerinin ekolog ve endositik ticareti ve hücre içi organel nakli astrositlerin normal biyolojisini düzenler ve bu süreçler genellikle hastalıktan veya yaralanmaya yanıt olarak etkilenir. Burada kültür yüksek kaliteli murine astrositler için basit bir protokol savuruyoruz, floresan astrositik proteinleri ve organelleri ilgi çekici olarak etiketlemek ve zaman atlamalı konfokal mikroskopi kullanarak hücre içi aktarım dinamiklerini kaydetmek için. Ayrıca, mevcut görüntü analiz yazılımlarını (imageJ/FIJI) eklentilerini kullanarak edinilen filmlerden ilgili taşıma parametrelerinin nasıl ayıklanıp ölçültüldünü de gösteriyoruz.

Yukarıda özetlenen birincil fare MD astrositleri oluşturmak için protokol tekrarlanabilir, yüksek kaliteli kültürler vermelidir. Kültürler başlangıçta astrositler, fibroblastlar ve mikroglia ve oligodendrositler (Şekil1Bi,Biv; kırmızı ok başları) dahil olmak üzere diğer glial hücrelerin bir karışımını içermesine rağmen, ARAC'nin DIV5-DIV7 arasındaki karışık kültüre eklenmesi en aza indirgenmiştir. bu kirletici hücrelerin çoğalması. Komb...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes at JoVE.com

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Protokolümüz, astrositik organellerin veya proteinlerin kontrollü hücre dışı ortamlar ve hafif hastalık durumları altında hareketliliğini ve lokalizasyonunu araştırmak için kullanılabilir. Protein ve organel lokalizasyonunun tek bir anlık görüntüsünü sağlayan MHA sabit preparatlarının aksine, canlı görüntüleme tekniğimiz bireysel canlı astrositlerde parçacık dinamiklerini analiz etmek için kullanılabilir. Transfeksiyon tohumu astrositlerinden bir gün önce 24-48 saat sonra görüntüleme için uygun yoğunlukta astrositler.Seyreltmek dudak reaktifi uygun deneysel konsantrasyon azaltılmış serum orta. Azaltılmış serum ortamının 250 mikrolitresinde beş mikrogram yüksek saflıkta DNA seyreltin ve tüpe beş mikrolitre lipofection arttırıcı reaktif ekleyin. Lipofection reaktifini DNA lipofection arttırıcı karışımının eşit hacmiyle karıştırın ve çözeltiyi oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonunda, astrosit kültüründen supernatant çıkarın ve hücrelere dropwise transfection karışımı 100 mikrolitre ekleyin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit altı saat sonra, astrosit kültür ortamı uygun bir hacim ile transfeksiyon kompleksi değiştirin ve ek bir 24 ila 72 saat için hücre kültürü kuluçka hücreleri iade. Görüntülemeden 30 dakika önce, 200 mikrolitre astrosit kültür ortasında uygun bir lisozomal etiketleme sondasını bir mikromolar üzerinde çalışmaya niçin seyreltin ve astrositleri 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir sonda ile etiketleyin.Daha sonra hücreleri sıcak astrosit kültür ortamı ile bir kez yıkayın ve görüntüleme ortamı ile yıkama değiştirin. Sonda etiketlemehemen sonra, mikroskop aşamasında uygun adaptör içine astrosit kültür konteyner yerleştirin ve EBI floresan ışık kullanarak, floresan proteinler veya prob ifade hücreleri bulmak. Seçili hücreleri görselleştirmek ve odağı ayarlamak ve tek bir hücreye yakınlaştırmak için floresan örnek aydınlatmayı ayarlamak için dijital kamerayı kullanın.Daha sonra 300 ile 500 saniye arasında değişen zaman aralıkları için her iki saniyede bir kare lik bir sıklıkta tek bir Z yığını zaman atlamalı seri elde etmek için Yakınlaştırma ve Kesin Odaklama işlevlerini kullanın. Hızlandırılmış görüntüleri AVI veya TIFF yığın dosyaları olarak kaydedin ve dışa aktarın. Hızlandırılmış görüntüleri analiz etmek için ImageJ veya Fiji'deki hızlandırılmış görüntü sırasını açın ve kanalları bölmek için Split Channel aracını kullanın.Sekiz bit yeşil kanal görüntüsünde, kutupluluk incelenen tüm hücreler içinde ve arasında tutarlı olacak şekilde tüm filmler için aynı istenilen yön kuralını kullanarak parçacıkların yörüngeleri boyunca bir çizgi izlemek için Segmented Line aracını kullanın. Parçanın kalınlığına uyacak şekilde çizgi genişliğini ayarlamak için Çizgi aracını çift tıklatın ve 10 çizgi genişliği kullanarak Kymo ToolBox eklentisinin Kymo'nun Beraberlik Kymo makrosu çalıştırın. Görüntüyü zaman ve mekanda kalibre etmek isteyen bir istem görüntülenir.Kalibre edildikten sonra, kymographs oluşturulur ve TIFF dosyaları olarak kaydedilebilir. Parçacık yörüngeleri atamak için, satın alma süresi boyunca kymograph'taki her parçacığı el ile izlemek için Segmented Line aracını kullanın ve her parçacık yörüngesini ilgi alanı olarak kaydetmek için YG yöneticisini kullanın. Daha fazla analiz için her zaman atlamalı video başına ilgi tüm bölgeleri kaydedin ve Kymo ToolBox eklentisinin Analiz Kymo makro çalıştırın.Açılan menüden ilgi hücresinin çekirdeğinden parçacık hareketinin dışa doğru yönünü tanımlamak isteyen bir pencere açılır. Sınır hızı, her bir ilgi kargosu için yazılımın hassasiyetine göre tanımlanmalı ve hat genişliği her parçacık yörüngesinin kalınlığına uyacak şekilde ayarlanmalıdır. Log Tüm Veriler ve Log Ekstrapolated Koordinatlar çeşitli kargo taşıma parametrelerinin hesaplanması için olmalıdır.Tamam'ı tıklatın. Tek tek parçalar için hesaplanan veriler daha sonra kymograph başına biraraya gelir ve her görüntüye özgü metin dosyalarına kaydedilir. Sitozin arabinoside tedavi ile sallayarak tabanlı arınma stratejisi birleştirerek sadece arınma adımı içeren geleneksel protokoller üzerinde astrosit kültürlerin saflık zenginleştirir.Lipofection tabanlı transfeksiyon toksisite neden olmadan canlı hücre görüntüleme için en uygun düzeyde proteinlerin geçici ifade sağlar veya astrosit canlılık etkilemez. Benzer şekilde, floresan sonda kullanımı organel dinamikleri ve astrositlerin izlenmesi için asidik endolysomal organellerin hızlı ve verimli etiketlemeizin sağlar. Görüntülemeden elde edilen hızlandırılmış veriler, zaman ve mekandaki kargo hareketini izleyen kymograflar oluşturmak için kullanılabilir.Bu kymograflarda, belirtilen kargonun anterograd hareketi negatif eğimli yörüngelerle, retrograd hareketi ise pozitif eğimli yörüngelerle temsil edilir. Sabit veziküller dikey yörüngeler olarak görünür. Bu analizde, belirli bir kargonun akının astrosit in bir alanı üzerinden ölçülmesi, filmlerin edinildiği astrosit bölgesinde normal taban çizgisi hareketliliğini temsil eden yükler arasındaki modal partiküllerin yüzdesi arasındaki farklılıkları ortaya koymuştur.Kymograph'tan elde edilen her bir parçacık için x, y pozisyonundaki değişimin tam zaman ölçeği boyunca kesin eşleneği, kargo hızı ve çalışma uzunluğu gibi diğer hareket parametrelerini değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu protokol yüksek kaliteli astrosit kültürleri ve verimli kargo etiketlemegerektirdiğinden, transfeksiyon reaktif kuluçka süresi ve satın alma zaman çizelgesi ilgi her plazmid veya kargo için ayarlanmalıdır. Bu protokol, hücre hasarı, toksisite, patojenik mutasyonlar, sinaptik aktivite veya hücre içi veya hücre dışı ortamdaki değişikliklere yanıt olarak astrositlerdeki taşıma olaylarını karakterize etmek için değiştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Görüntüleme hücre içi Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Sütunlar ve Katmanlar dendritik Morfoloji Analizi

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Mikroakışkan Odacıksistemi Kullanılarak Motor Nöron Kültürlerinde Organellerin Aksonal Taşınması

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...