Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Dette arbejde er delvis støttet af finansieringen støtte fra National Institutes of Health (HL131645, CA016058), St. Baldrick Foundation, og Pelotonia Foundation.

Denne protokol blev godkendt af landsdækkende børnepasning og brug Komité (IACUC).
Bemærk: Protokollen er beskrevet i kronologisk rækkefølge, der strækker sig over perioden på to dage. Brug friske reagenser som beskrevet i nedenstående protokol.
1. klargøring af reagenser dagen før analysen
<ol><li>
Fugt sensor patronen.
	<ol>
<li>Der Inkubér 5 mL af kalibranten (tabel over materialer) i en ikke-CO<sub...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

Her viser vi isolering af en maksimal mængde af ren og levedygtig murine LSK HSPCs befolkning samt måling af deres glycolyse og mitokondrie respiration med en ekstracellulær flux analysator. Protokollen overvinder især følgende tekniske problemer i forbindelse med brugen af LSK Hspc'er: i) den lave hyppighed af LSK Hspc'er i murine knoglemarv14, II) lav basal metabolisk aktivitet af LSK hspcs26, III) skrøbelighed af LSK hspcs27, og IV) manglend...

Da levetiden for de fleste modne blodlegemer er kort, er homøostase af blod afhængig af selvfornyelse og differentiering af en langvarig, men sjælden population af hæmatopoietiske stamceller (Hspc'er)1. Hspc'er er quiescent, men de er hurtige til at formere sig og undergår differentiering efter stimulation for at opretholde kravene i blodsystemet. Da hver HSPC cellulære tilstand kræver en unik bioenergetisk efterspørgsel, de metaboliske ændringer er centrale drivkræfter for HSPC skæbne beslutninger. Derfor, tabet af metabolisk plasticitet, ved at ændre balancen mellem quiescence, selvfornyelse, og differentiering af Hspc'er, ofte fører til myelo-eller lympho-proliferative lidelser. Sammen, forståelsen af metaboliske regulering af HSPC udvikling er afgørende for at afdække mekanismer underliggende hæmatologiske maligniteter2,3,4,5.
Mitokondrie respiration og glycolyse genererer ATP til at drive intracellulære reaktioner og producere de byggeklodser, som er nødvendige for makromolekyle syntese. Da hspc'er har lav mitokondrie masse sammenlignet med differentierede celler6 og de opretholder inaktive i hypoxisk knoglemarvs nicher, er hspc'er primært afhængige af glykolyse. Aktivering af hspc'er forbedrer deres mitokondrie metabolisme, der fører til tab af inaktive og deres efterfølgende indtræden i cellecyklussen. En sådan metabolisk plasticitet af hspc'er gør det muligt at vedligeholde HSPC-puljen i hele voksenlivet6,7,8,9,10,11,12. Derfor er det afgørende at undersøge deres metaboliske aktiviteter, såsom iltforbrug (OCR, indeks for oxidativ fosforylering) og den ekstracellulære forsuring (ECAR, Index of glycolyse) for at analysere HSPC-aktiveringen og sundhedsstatussen. Både OCR og ECAR kan måles samtidigt, i realtid, ved hjælp af en ekstracellulær flux analysator. Men den aktuelle metode kræver et stort antal celler og er optimeret til vedlige celler13. Da Hspc'er ikke kan isoleres i store mængder fra mus14, kræver sortering for at opnå en ren population, er ikke-vedstående celler15, og kan ikke dyrkes natten over uden at undgå differentiering16, har det været vanskeligt at måle OCR og ECAR af hspc'er. Her giver vi et sæt af klare, trin-for-trin instruktioner til at ledsage video-baserede tutorials om, hvordan man måler metabolisk respiration og glycolyse af få tusinder murine knoglemarv-LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hspc'er.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

Hæmatopoietiske Stam progenitorceller (Hspc'er) har en distinkt metabolisk plasticitet, som giver dem mulighed for at overgå fra deres lysende tilstand til en differentierings tilstand for at opretholde kravene til bloddannelsen. Men, det har været vanskeligt at analysere metabolisk status (mitokondrie respiration og glycolyse) af Hspc'er på grund af deres begrænsede antal og mangel på optimerede protokoller for ikke-vedlige, skrøbelige Hspc'er. Her giver vi et sæt klare, trin-for-trin instruktioner til at måle metabolisk respiration (iltforbrug sats; OCR) og glykolyse (ekstracellulær forsurings hastighed; VOGN) af murine knoglemarvs LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hspc'er. Denne protokol giver en højere mængde af LSK Hspc'er fra murine knoglemarv, forbedrer levedygtigheden af Hspc'er under inkubation, letter ekstracellulære flux analyser af ikke-klæbende Hspc'er, og giver optimerede injektions protokoller (koncentration og tid) for lægemidler rettet mod oxidativ fosforylering og glykolytiske veje. Denne metode gør det muligt at forudsige den metaboliske status og sundheden for Hspc'er under blod udvikling og sygdomme.

Vores ekstraktionsmetode tillod os at høste op til ~ 80.000 LSK Hspc'er pr. mus. Levedygtigheden og antallet af LSK-celler blev forbedret med vores metode, fordi vi: (1) kombineret knoglemarv fra øvre og nedre lemmer, hofte knogler, brystbenet, rib bur, og rygsøjlen, (2) undgås ved hjælp af rød cellelyse buffer, der ville have øget celle-død og clumping, (3) brugte tætheden gradient medium adskillelse af mono-nucleated celler, og (4) undgås ved hjælp af præ-kølet buffer, der ville have forårsaget tab af cel...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hæmatopoietiske Stam progenitorceller (Hspc'er) overgang fra en lysende tilstand til en differentierings tilstand på grund af deres metaboliske plasticitet under dannelse af blod. Her præsenterer vi en optimeret metode til måling af mitokondrie respiration og glycolyse af Hspc'er.

Analyse af hæmatopoietisk Stam Progenitorcellernes metabolisme

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Metaboliske ændringer i hæmatopoietiske stamceller og progenitor celler giver dem mulighed for at overgangen fra deres quiescent tilstand til en differentiering tilstand til at opretholde krav om bloddannelse. Ændring i metabolisk plasticitet af hæmatopoietiske stamceller og progenitor celler fører til hæmatologiske lidelser. Vores protokol vil hjælpe med at måle den metaboliske regulering og sundhed hæmatopoietiske stamceller og progenitor celler under blodudvikling og sygdomme.Analyse af mitokondriel respiration og glykolyse af hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller er vanskelig, da de er skrøbelige og sjældne population. Vores optimerede protokol gør det muligt at isolere en større mængde hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller fra murin knoglemarven, forbedrer deres levedygtighed under inkubation, letter ekstracellulære fluxanalyse af ikke-klæbende HSPC'er og giver optimerede injektionsparametre for lægemiddelmålretning oxidativ fosforylering samt glykolytisk veje. For at begynde denne procedure, fylde brønde af utility plade og kamrene omkring brøndene med sterilt vand.Nedsænk sensorpatronen i bryggerpladen og sørg for, at sensorerne er helt dækket af vand. Læg derefter patronen nedsænket i bryggeren i en ikke CO2-inkubator ved 37 grader Celsius for at inkubere natten over. I et klasse II biosikkerhedsskab tilsættes 40 mikroliter af kommercielt tilgængelig 0,1% PLL-opløsning til hver brønd af analysepladen.Analysepladen dækkes med låget i sættet, og den lukkede plade inkuberes ved stuetemperatur under kølerhjelmen i en time. Derefter skal du bruge en steril vakuumbaseret aspirator til at fjerne den overskydende opløsning og lufttørre pladen under kølerhjelmen. At høste mononukleerede murine knoglemarvsceller, tilføje fem milliliter af tæthed gradient medium til en 15 milliliter konisk rør.Tilsæt langsomt fem milliliter af knoglemarvscellesuspensionen og sørg for, at cellerne forbliver som et lag over tæthedens gradientmedium. Centrifuge ved 500 gange g og ved stuetemperatur i 30 minutter og sørg for, at centrifugen er ved den lavest mulige acceleration. Høst den midterste grænseflade af mononukleerede celler i en frisk 15 milliliter rør.Derefter vaskes cellerne med fem milliliter 1X PBS indeholdende 2%FBS. Centrifuge ved 500 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Fjern supernatanten, og opsplit cellerne i 300 mikroliter 1X PBS indeholdende 2% FBS.Dernæst aliquot 10 mikroliter af cellen suspension for uhæmmet eller ensfarvet kontrol i et FACS rør. For at høste LSK HSPC'er fra mononukleerede murine knoglemarvsceller tilsættes 15 mikroliter biotinantistofcocktail til 300 mikroliter mononukleerede knoglemarvsceller. For at høste LSK HSPC'er fra mononukleerede murine knoglemarvsceller tilsættes 15 mikroliter biotinantistofcocktail til 300 mikroliter mononukleerede knoglemarvsceller.Læg rørene i en isspand placeret på en shaker i et køleskab for at inkubere ved fire grader Celsius med omrøring i 30 minutter. Derefter tilsættes 10 milliliter forkølet 1X PBS indeholdende 2% FBS til cellerne. Centrifuge ved 500 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter.Kassér supernatanten og opsplitning af cellepellet i 400 mikroliter af 1X PBS indeholdende 2% FBS. Kort vortex anti-biotin mikroperler før brug. Tilsæt 80 mikroliter af mikroperler til hver prøve og bland godt.Inkuber i yderligere 20 minutter ved fire grader Celsius med omrøring. Derefter tilsættes 10 milliliter forkølet PBS indeholdende 2%FBS til cellerne. Centrifuge røret ved 500 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter.Supernatanten kasseres, og cellepelletpen skal resuspenderes i en milliliter PBS indeholdende 2%FBS. Opbevar celleaffjedringen ved fire grader Celsius, mens den magnetiske separationsenhed opsættes. Kolonnen skal være placeret i et magnetfelt til den magnetiske cellesorteringsudseparator ved fire grader Celsius.Forbered kolonnen til magnetisk adskillelse ved at skylle den med tre milliliter 1X PBS, der indeholder 2% FBS under tyngdekraften flow ved fire grader Celsius. Tilføj cellesuspensionen til den for våde kolonne ved fire grader Celsius. Lad alle cellerne passere gennem kolonnen ved fire grader Celsius og opsaml spildevandet i et 15 milliliter konisk rør.Dernæst vaskes kolonnen med tre milliliter 1X PBS og 2% FBS ved fire grader Celsius. Gentag denne vask tre gange. Saml strømmen igennem og holde det på fire grader Celsius.Centrifuge det koniske rør, der indeholder strømmen gennem ved 500 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kassér supernatanten og opslæmm cellerne i 0,5 milliliter 1X PBS med 2%FBS og overfør suspensionen til et FACS-rør. Derefter tilsættes 24 mikroliter af LSK antistofcocktail til hver 10 millioner celler.Dæk røret med folie og inkuberes i mørke ved fire grader Celsius med omrøring i en time. Derefter tilsættes tre milliliter 1X PBS med 2% FBS til FACS-røret. Centrifuge ved 500 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter.Supernatanten kasseres, og de antistofmærkede celler skal opslæskes igen i en milliliter 1X PBS indeholdende 2%FBS. Lige før sortering, tilsæt en mikroliter af en milligram per milliliter propidium iodid til celle suspension og bruge en 40 mikrometer si til at filtrere indholdet af FACS rør. Først centrifugeres de indsamlede LSK-celler ved 500 gange g og ved stuetemperatur i fem minutter.Supernatanten kasseres, og cellerne skal opspørliges i komplette medier til en endelig koncentration på mindst 70.000 celler pr. 40 mikroliter. Seed 40 mikroliter af denne celle suspension i brøndene i en PLL belagt otte-brønd plade og sørg for at forlade alle hjørnerbåse tomme. Centrifuge pladen ved 450 gange g og ved stuetemperatur i et minut.Brug et omvendt mikroskop for at sikre, at cellerne er fastgjort til bunden af brøndene. Efter dette, tilføje 135 mikroliter af komplette medier til cellerne i hver brønd bringe det endelige volumen af hver brønd til 175 mikroliter. Tilføj 175 mikroliter af komplette medier til de to hjørner af pladen som emner.Inkuber cellerne i en ikke-CO2-inkubator ved 37 grader Celsius i to timer. Derefter oprette et program for analysatoren til at tilføje narkotika til hver brønd af pladen som skitseret i tabel to og tabel tre af tekstprotokollen. For mitokondriel stresstest, hente sensoren patron i utility plade fra inkubatoren sådan, at hver brønd har en endelig koncentration af to mikromolar oligomycin, 1,5 mikromolar FCCP, og 0,5 mikromolar af enten rotenon og anti-mycin A efter behov.Tag låget ud af sensorpatronen, og placer det på instrumentbakken. Begynd kalibreringen, som vil tage 20 minutter. Når kalibreringen er færdig, fjernes brugspladen, og analysepladen, der indeholder LSK-cellerne, erstattes.Tryk på fortsæt med at starte det tidligere indstillede program. Når programmet er fuldført, skal du hente dataene og analysere dem. I denne undersøgelse, en maksimal mængde levedygtige murine LSK HSPC'er er isoleret og deres glykolyse og mitokondrielle stofskifte måles med en ekstracellulær flux analysator.Selv om ekstracellulære flux analyse traditionelt anvendes til klæbende celler, denne metode gør LSK HSPC'er klæbende til PLL belagte brønde, som giver mulighed for måling af den ekstracellulære flux og dermed metaboliske sundhed LSK HSPCs. For at måle mitokondriel respiration gennem iltforbrug sats og glykolyse gennem ekstracellulær forsuring sats i basale og stress betingelser, lægemidler, der forstyrrer glykolyse og mitokondrielle respiration injiceres sekventielt. Som forventet er det basale niveau af den ekstracellulære forsuring højere for LSK HSPC'er dyrket i glukose og pyruvat positive medier sammenlignet med dem, der dyrkes i negative medier.Injektionen med glukose ændrede ikke den ekstracellulære forsuringshastighed for de celler, der dyrkes i de positive medier, men det øgede glykolyse af celler i negative medier. Det basale niveau af disse celler forblev dog stadig lavere i den positive gruppe. Injektionen med oligomycin aktiverede glykolysen på sit maksimale niveau i den positive gruppe, men påvirkede ikke den negative gruppe.Injektionen med glukoseanalogien ved 2-GD returnerede den ekstracellulære forsuringshastighed til ikke-glykolytiske niveauer. Til mitokondriel stresstest, injektion af oligomycin hyperpolariseret mitokondrielle membran forhindrer mere proton pumpe gennem ETC komplekser og dermed reducere hastigheden af mitokondrielle respiration. Injektionen af FCCP skubber iltforbruget sats til det maksimale som celler forsøger at inddrive mitokondrielle membran potentiale.Injektionen med to andre elektrontransportkædehæmmere får mitokondrielle respiration til helt at stoppe, og dermed vendte iltforbruget tilbage til sit minimumsniveau. Undgå brug af lysisbuffer for røde blodlegemer til mononuklear celleisolering. Vi anbefaler Ficoll gradient adskillelse for at forhindre klumpdannelse og reducere tabet af LSK.Ved hjælp af vores optimerede metode, kan vi måle mitokondriel respiration og glykolyse af sjældne og skrøbelige hæmatopoietiske stamceller og progenitor celler og undersøgelse af metaboliske signaler regulere normale og ondartede hæmatopoiesis.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Afledning af Cardiac progenitorceller af embryonale stamceller

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkte Induktion af humane neurale stamceller fra perifert blod hæmatopoietiske stamceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Start af Differentiering i Immortaliserede multipotent Otic progenitorceller

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Immunomagnetisk Adskillelse af Fat Depot-specifikke Sca1<sup&gt; høj</sup&gt; adipøst afledte stamceller (ASC&#39;er)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Konkurrencedygtige Transplantationer at vurdere hæmatopoietisk stamcelletransplantation Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Elektrofysiologisk analyse af humane pluripotente stamceller-afledte kardiomyocytter (hPSC-CM&#39;er) ved anvendelse af multi-elektrode arrays (MEA&#39;er)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

Påvisning af resterende Donor Erythroid stamceller efter hæmatopoietisk stamcelletransplantation til patienter med Hemoglobinopathies

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Udvikling af et In Vitro Assay at kvantificere hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs) i at udvikle zebrafisk embryoner

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...