Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Dit werk wordt deels gesteund door de steun van de National Institutes of Health (HL131645, CA016058), de Stichting van de St. Baldrick en de Pelotonia Foundation.

Dit protocol werd goedgekeurd door Nationwide Children's Hospital Animal Care and use Committee (IACUC).
Opmerking: Het protocol wordt beschreven in chronologische volgorde die over de periode van twee dagen overspant. Gebruik verse reagentia zoals beschreven in het onderstaande protocol.
1. bereiding van de reagentia op de dag voorafgaand aan de bepaling
<ol><li>
Hydrateer de sensor cartridge.
	<ol>
<li>Incuberen 5 mL van het ijk...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

Hier tonen we de isolatie van een maximale hoeveelheid zuivere en levensvatbare Murine LSK HSPCs populatie, evenals de meting van hun glycolyse en mitochondriale ademhaling met een extracellulaire flux Analyzer. Het protocol overkomt met name de volgende technische problemen voor het gebruik van LSK Hspc's: i) de lage frequentie van LSK-Hspc's in het lymfklier beenmerg14, II) lage basale metabole activiteit van LSK hspc's26, III) de FRAGILITEIT van LSK hspcs<sup class="xref...

Aangezien de levensduur van de meeste volwassen bloedcellen kort is, de homeostase van bloed berust op de zelf vernieuwing en differentiatie van een langlevende maar zeldzame populatie van hematopoietische stamcellen (HSPCs)1. Hspc's zijn stilaan, maar ze zijn snel te vermenigvuldigen en differentiëren op stimulatie om de eisen van het bloedsysteem te ondersteunen. Aangezien elke HSPC cellulaire staat een unieke bioenergetische vraag vereist, zijn de metabole veranderingen belangrijke drijf-en- Daarom, het verlies van metabole plasticiteit, door het veranderen van het evenwicht tussen quiescentie, zelf vernieuwing, en differentiatie van Hspc's, leidt vaak tot myelo-of LYMPHO-proliferatieve stoornissen. Samen is het begrip van metabole regulering van de ontwikkeling van hspc van cruciaal belang om mechanismen te ontdekken die onderliggende hematologische maligniteiten2,3,4,5vormen.
Mitochondriale ademhaling en glycolyse genereren ATP om intracellulaire reacties te stimuleren en produceren de bouwstenen die nodig zijn voor Macromolecuul synthese. Aangezien Hspc's lage mitochondriale massa in vergelijking met gedifferentieerde cellen6 en ze ondersteunen quiescentie in hypoxische beenmerg niches, hspc's voornamelijk vertrouwen op glycolyse. Activering van Hspc's verbetert hun mitochondriale metabolisme dat leidt tot het verlies van de quiescentie en hun daaropvolgende binnenkomst in de celcyclus. Dergelijke metabole plasticiteit van hspc's maakt het mogelijk om de hspc-pool te onderhouden gedurende het hele volwassen leven6,7,8,9,10,11,12. Daarom is het van cruciaal belang om hun metabole activiteiten te onderzoeken, zoals het zuurstofverbruik (OCR; index van oxidatieve fosforylering) en de extracellulaire verzuring rate (ECAR; index van glycolyse) om de HSPC-activatie en de gezondheidsstatus te analyseren. Zowel de OCR als de ECAR kunnen gelijktijdig worden gemeten, in real-time, met behulp van een extracellulaire flux Analyzer. De huidige methode vereist echter een groot aantal cellen en is geoptimaliseerd voor aanhandige cellen13. Aangezien Hspc's niet kunnen worden geïsoleerd in grote hoeveelheden van muizen14, vereisen sortering om een zuivere populatie te verkrijgen, zijn niet-aanhandende cellen15en kunnen niet 's nachts worden gekweekt zonder differentiatie te vermijden16, het is moeilijk om de OCR en de ECAR van hspc's te meten. Hier bieden we een set van duidelijke, stapsgewijze instructies om video-gebaseerde tutorials te begeleiden over het meten van metabole ademhaling en glycolyse van enkele duizenden muriene beenmerg-LineageNEGSca1+c-Kit+ (LSK) hspcs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc's) hebben een duidelijke metabole plasticiteit, waardoor ze kunnen overgaan van hun rusttoestand naar een differentiatie toestand om de eisen van de bloedvorming te ondersteunen. Echter, het is moeilijk om de metabole status te analyseren (mitochondriale ademhaling en glycolyse) van Hspc's vanwege hun beperkte aantallen en het ontbreken van geoptimaliseerde protocollen voor niet-aanhandige, fragiele Hspc's. Hier bieden we een set van duidelijke, stapsgewijze instructies voor het meten van metabole ademhaling (zuurstofverbruik; OCR) en glycolyse (extracellulaire verzuring; ECAR) van muriene beenmerg-LineageNEGSca1+c-Kit+ (LSK) hspcs. Dit protocol biedt een hogere hoeveelheid LSK-Hspc's van muriene beenmerg, verbetert de levensvatbaarheid van Hspc's tijdens de incubatie, vergemakkelijkt extracellulaire flux analyses van niet-aanhangende Hspc's en biedt geoptimaliseerde injectie protocollen (concentratie en tijd) voor geneesmiddelen gericht op oxidatieve fosforylering en glycolytische trajecten. Deze methode maakt de voorspelling van de metabole status en de gezondheid van Hspc's tijdens de ontwikkeling van het bloed en ziekten.

Met onze extractiemethode konden we tot ~ 80.000 LSK Hspc's per muis oogsten. De levensvatbaarheid en aantallen LSK cellen werden verbeterd met onze methode, omdat wij: (1) gecombineerde beenmerg van bovenste en onderste ledematen, heup botten, borstbeen, ribbenkast, en wervelkolom, (2) vermeden met behulp van rode cel lysis buffer die zou hebben verhoogd cel-dood en klonteren, (3) gebruikt de dichtheidsgradiënt middelmatige scheiding van mono-nucleated cellen, en (4) vermeden met behulp van voorgekoelde buffer die zou ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc's) overgang van een rusttoestand naar een differentiatie toestand als gevolg van hun metabole plasticiteit tijdens de bloedvorming. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het meten van de mitochondriale ademhaling en glycolyse van Hspc's.

Analyse van hematopoietische stam voorlopercellen metabolisme

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Metabolische veranderingen in hematopoietische stam- en voorlopercellen stellen hen in staat om over te stappen van hun rustige toestand naar een differentiatietoestand om eisen van bloedvorming te ondersteunen. Verandering in metabole plasticiteit van hematopoietische stam- en voorlopercellen leidt tot hematologische aandoeningen. Ons protocol zal helpen meten van de metabole regulatie en de gezondheid van hematopoietische stam- en voorlopercellen tijdens de bloedontwikkeling en ziekten.Analyse van de mitochondriale ademhaling en glycolyse van hematopoietische stam- en voorlopercellen is moeilijk omdat ze kwetsbaar en zeldzaam zijn. Ons geoptimaliseerde protocol maakt het mogelijk om een hogere hoeveelheid hematopoietische stam- en voorlopercellen uit murinebeenmerg te isoleren, verbetert hun levensvatbaarheid tijdens incubatie, vergemakkelijkt extracellulaire fluxanalyse van niet-aanhangende HSPCs en biedt geoptimaliseerde injectieparameters voor medicijntargeting oxidatieve fosforylatie en glycolytische paden. Om deze procedure te beginnen, vul de putten van de hulpplaat en de kamers rond de putten met steriel water.Dompel de sensorcartridge onder in de hulpplaat om ervoor te zorgen dat de sensoren volledig door water worden afgedekt. Plaats vervolgens de cartridge ondergedompeld in de utility plate in een niet CO2 incubator op 37 graden Celsius om 's nachts uit te broeden. In een bioveiligheidskast van klasse II voegt u 40 microliter commercieel beschikbare 0,1%PLL-oplossing toe aan elke put van de testplaat.Bedek de testplaat met het deksel in de kit en broed de gesloten plaat een uur onder de motorkap uit. Gebruik hierna een steriele vacuümgebaseerde aspirator om de overtollige oplossing te verwijderen en de plaat onder de motorkap te drogen. Om mononucleated murine beenmergcellen te oogsten, voeg vijf milliliter dichtheidsgradiëntmedium toe aan een conische buis van 15 milliliter.Voeg langzaam vijf milliliter van de beenmergcelsuspensie toe om ervoor te zorgen dat de cellen als laag boven het dichtheidsgradiëntmedium blijven. Centrifuge op 500 keer g en bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om ervoor te zorgen dat de centrifuge bij de laagst mogelijke versnelling is. Oogst de middelste interface van mononucleated cellen in een verse buis van 15 milliliter.Was vervolgens de cellen met vijf milliliter 1X PBS met 2%FBS. Centrifuge op 500 keer g en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant en resuspend de cellen in 300 microliter van 1X PBS met 2%FBS.Vervolgens aliquot 10 microliters van de cel suspensie voor onbevlekte of single-gekleurde controle in een FACS buis. Om LSK HSPCs te oogsten uit mononucleated murine beenmergcellen, voeg 15 microliters biotine antilichaam cocktail toe aan 300 microliters van mononucleated beenmergcellen. Om LSK HSPCs te oogsten uit mononucleated murine beenmergcellen, voeg 15 microliters biotine antilichaam cocktail toe aan 300 microliters van mononucleated beenmergcellen.Plaats de buizen in een ijsemmer geplaatst op een shaker in een koelkast om te broeden op vier graden Celsius met agitatie gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 10 milliliter voorgekoelde 1X PBS met 2%FBS toe aan de cellen. Centrifuge op 500 keer g en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Gooi de supernatant weg en verleg de celpellet opnieuw in 400 microliter van 1X PBS met 2%FBS. Kort vortex de anti-biotine microbeads voor gebruik. Voeg 80 microliter van de microbeads toe aan elk monster en meng goed.Incubeer voor een extra 20 minuten op vier graden Celsius met agitatie. Voeg hierna 10 milliliter voorgekoelde PBS met 2%FBS toe aan de cellen. Centrifugeren de buis op 500 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Gooi de supernatant weg en verleg de celpellet opnieuw in één milliliter PBS met 2%FBS. Bewaar de celsuspensie op vier graden Celsius tijdens het instellen van de magnetische scheidingseenheid. Plaats de kolom in een magnetisch veld voor de magnetische ondersteunde celsorteerseparator op vier graden Celsius.Bereid de kolom voor op magnetische scheiding door het te spoelen met drie milliliter 1X PBS met 2%FBS onder zwaartekrachtstroom bij vier graden Celsius. Voeg de celsuspensie toe aan de voorwettige kolom bij vier graden Celsius. Laat alle cellen bij vier graden Celsius door de kolom gaan en verzamel het afvalwater in een conische buis van 15 milliliter.Was vervolgens de kolom met drie milliliter 1X PBS en 2%FBS bij vier graden Celsius. Herhaal deze was drie keer. Verzamel de stroom door en houd het op vier graden Celsius.Centrifugeren de conische buis met de stroom door bij 500 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en zet de cellen opnieuw op in 0,5 milliliter 1X PBS met 2%FBS en breng de suspensie over naar een FACS-buis. Voeg vervolgens 24 microliter van de LSK-antilichaamcocktail toe aan elke 10 miljoen cellen.Bedek de buis met folie en uitbroed in het donker op vier graden Celsius met agitatie gedurende een uur. Voeg hierna drie milliliter 1X PBS met 2%FBS toe aan de FACS-buis. Centrifuge op 500 keer g en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Gooi de supernatant weg en stel de cellen met het etiket van antilichamen opnieuw op in één milliliter 1X PBS met 2%FBS. Voeg vlak voor het sorteren een microliter van één milligram per milliliter propidiumjodide toe aan de celsuspensie en gebruik een zeef van 40 micrometer om de inhoud van de FACS-buis te filteren. Ten eerste, centrifugeren de verzamelde LSK cellen op 500 keer g en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Gooi de supernatant weg en zet de cellen in volledige media opnieuw op tot een uiteindelijke concentratie van ten minste 70.000 cellen per 40 microliter. Zaad 40 microliters van deze cel suspensie in de putten van een PLL gecoate acht-put plaat ervoor te zorgen dat alle hoekputten leeg te laten. Centrifugeren de plaat op 450 keer g en bij kamertemperatuur gedurende een minuut.Gebruik een omgekeerde microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen zijn bevestigd aan de bodem van de putten. Voeg hierna 135 microliter complete media toe aan de cellen in elke put, waardoor het uiteindelijke volume van elke put op 175 microliters komt. Voeg 175 microliter van volledige media toe aan de twee hoeken van de plaat als losse flodders.Incubeer de cellen in een niet CO2 incubator op 37 graden Celsius gedurende twee uur. Stel vervolgens een programma op voor de analyzer om drugs toe te voegen aan elke put van de plaat zoals beschreven in tabel twee en tabel drie van het tekstprotocol. Voor de mitochondriale stresstest haalt u de sensorcartridge in de hulpplaat uit de couveuse zodat elke put een laatste concentratie heeft van twee micromolar oligomycine, 1,5 micromolar FCCP en 0,5 micromolar van rotenone en anti-mycin A als dat nodig is.Haal het deksel van de sensorcartridge en plaats het op de instrumentenlade. Begin met het kalibratieproces dat 20 minuten duurt. Wanneer de kalibratie is voltooid, verwijdert u de nutsplaat en vervangt u deze door de testplaat met de LSK-cellen.Druk op Doorgaan met het starten van het eerder ingestelde programma. Wanneer het programma is voltooid, haalt u de gegevens op en analyseert u deze. In deze studie wordt een maximale hoeveelheid levensvatbare murine LSK HSPCs geïsoleerd en wordt hun glycolyse en mitochondriale metabolisme gemeten met een extracellulaire fluxanalysator.Hoewel extracellulaire flux analyse traditioneel wordt gebruikt voor aanhangende cellen, deze methode maakt LSK HSPCs aanhanger van PLL gecoate putten die het mogelijk maakt voor de meting van de extracellulaire flux en dus metabole gezondheid van LSK HSPCs. Om de mitochondriale ademhaling te meten door middel van het zuurstofverbruik en glycolyse door de extracellulaire verzuring in basale en stressomstandigheden, worden geneesmiddelen die interfereren met glycolyse en mitochondriale ademhaling achtereenvolgens geïnjecteerd. Zoals verwacht is het basale niveau van de extracellulaire verzuring hoger voor LSK HSPCs gekweekt in glucose en pyruvaat positieve media in vergelijking met die gekweekt in negatieve media.De injectie met glucose veranderde niet de extracellulaire verzuring voor de cellen gekweekt in de positieve media, maar het verhoogde de glycolyse van cellen in negatieve media. Het basale niveau van deze cellen bleef echter nog steeds lager in de positieve groep. De injectie met oligomycine activeerde de glycolyse op het maximale niveau in de positieve groep, maar had geen invloed op de negatieve groep.De injectie met de glucose analoog op 2-DG keerde de extracellulaire verzuring naar niet-glycolytische niveaus. Voor de mitochondriale stresstest hyperpolariseerde de injectie van oligomycine het mitochondriale membraan waardoor meer protondoorpompen door de ETC-complexen werd voorkomen en zo de snelheid van mitochondriale ademhaling werd verminderd. De injectie van FCCP duwt het zuurstofverbruik tot het maximum als cellen proberen om het mitochondriale membraan potentieel terug te krijgen.De injectie met twee andere elektronentransportketenremmers zorgt ervoor dat mitochondriale ademhaling volledig stopt en daarmee het zuurstofverbruik weer op zijn minimumniveau komt. Vermijd het gebruik van rode cel lyse buffer voor de mononucleaire celisolatie. Wij raden de Ficoll gradiëntscheiding aan om klontervorming te voorkomen en het verlies van LSK te verminderen.Met behulp van onze geoptimaliseerde methode kunnen we mitochondriale ademhaling en glycolyse van zeldzame en fragiele hematopoietische stam- en voorlopercellen meten en bestuderen van metabole signalen reguleren normale en kwaadaardige hematopoiesis.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiëren Differentiatie in Onsterfelijk Multipotent Otic Progenitor Cellen

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Immunomagnetische Scheiding van Fat Depot-specifieke SCA1<sup&gt; hoog</sup&gt;-Vetcellen afgeleide stamcellen (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Elektrofysiologische analyse van humane Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM&#39;s) met behulp van multi-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

Detectie van residuele Donor Erythroid voorlopercellen na hematopoietische stamceltransplantatie voor patiënten met Hemoglobinopathieën

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Ontwikkeling van een In Vitro Assay voor het kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) bij de ontwikkeling van de zebravis embryo 's

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...