Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Ce travail est en partie soutenu par le soutien financier des National Institutes of Health (HL131645, CA016058), de la Fondation St. Baldrick's et de la Fondation Pelotonia.

Ce protocole a été approuvé par le Comité national de soins et d'utilisation des animaux de l'Hôpital pour enfants (IACUC).
REMARQUE: Le protocole est décrit dans l'ordre chronologique qui s'étend sur une période de deux jours. Utilisez des réactifs frais tels que décrits dans le protocole ci-dessous.
1. Préparation des réactifs le jour précédant l'essai
<ol><li>
Hydratez la cartouche du capteur.
	<ol>
<li>Incuber 5 ...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

Ici, nous démontrons l'isolement d'une quantité maximale de population pure et viable de HSPCs murine aussi bien que la mesure de leur glycolyse et respiration mitochondriale avec un analyseur extracellulaire de flux. Plus précisément, le protocole surmonte les problèmes techniques suivants pour l'utilisation des HSPC LSK : i) la basse fréquence des HSPC LSK dans la moelle osseuse murine14, ii) faible activité métabolique basale de LSK HSPCs26, iii) la fragilité de...

Puisque la durée de vie de la plupart des cellules sanguines matures est courte, l'homéostasie du sang repose sur l'auto-renouvellement et la différenciation d'une population de longue durée mais rare de cellules souches hématopoïétiques (HSPC)1. Les HSPC sont tranquilles, mais ils sont prompts à proliférer et à subir une différenciation à la stimulation pour soutenir les exigences du système sanguin. Comme chaque état cellulaire HSPC nécessite une demande bioénergétique unique, les changements métaboliques sont des moteurs clés des décisions de destin HSPC. Par conséquent, la perte de plasticité métabolique, en modifiant l'équilibre entre la quiescence, l'auto-renouvellement et la différenciation des HSPC, conduit souvent à des troubles myéloou ou lympho-proliférants. Ensemble, la compréhension de la régulation métabolique du développement HSPC est essentielle pour découvrir les mécanismes sous-jacents aux malignités hématologiques2,3,4,5.
La respiration mitochondriale et la glycolyse génèrent de l'ATP pour susciter des réactions intracellulaires et produire les éléments constitutifs nécessaires à la synthèse des macromolécules. Puisque les HSPC ont la basse masse mitochondrique comparée aux cellules différenciées6 et ils soutiennent la quiescence dans les niches hypoxiques de moelle, Les HSPC s'appuient principalement sur la glycolyse. L'activation des HSPC améliore leur métabolisme mitochondrial qui mène à la perte de quiescence et à leur entrée ultérieure dans le cycle cellulaire. Une telle plasticité métabolique des HSPC permet le maintien de la piscine HSPC tout au long de la vie adulte6,7,8,9,10,11,12. Par conséquent, il est essentiel d'étudier leurs activités métaboliques, telles que le taux de consommation d'oxygène (OCR; indice de phosphorylation oxydative) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR; indice de glycolyse) pour analyser l'activation du HSPC et l'état de santé. L'OCR et l'ECAR peuvent être mesurés simultanément, en temps réel, à l'aide d'un analyseur de flux extracellulaire. Cependant, la méthode actuelle nécessite un grand nombre de cellules et est optimisée pour les cellules adhérentes13. Étant donné que les HSPC ne peuvent pas être isolés en grandes quantités de souris14, nécessitent le tri pour obtenir une population pure, sont des cellules non adhérentes15, et ne peuvent pas être cultivés du jour au lendemain sans éviter la différenciation16, il a été difficile de mesurer l'OCR et l'ECAR des HSPC. Ici, nous fournissons un ensemble d'instructions claires, étape par étape pour accompagner des tutoriels vidéo sur la façon de mesurer la respiration métabolique et la glycolyse de quelques milliers de moelle osseusemurine-Lineage negSca1-c-Kit (LSK) HSPCs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

Les cellules hématopoïétiques progénitrices de tige (HSPc) ont la plasticité métabolique distincte, qui leur permet de passer de leur état quiescent à un état de différenciation pour soutenir des demandes de la formation de sang. Cependant, il a été difficile d'analyser l'état métabolique (respiration mitochondriale et glycolyse) des HSPC en raison de leur nombre limité et de l'absence de protocoles optimisés pour les HSPC fragiles et non adhérents. Ici, nous fournissons un ensemble d'instructions claires, étape par étape pour mesurer la respiration métabolique (taux de consommation d'oxygène; OCR) et la glycolyse (taux d'acidification extracellulaire; ECAR) de la moelle osseuse murine-Lineageneg Sca1c-Kit(LSK) HSPc. Ce protocole fournit une plus grande quantité de HSPC LSK de la moelle osseuse, améliore la viabilité des HSPC pendant l'incubation, facilite les analyses de flux extracellulaires des HSPC non adhérents, et fournit des protocoles d'injection optimisés (concentration et temps) pour les médicaments ciblant la phosphorylation oxydative et les voies glycolytiques. Cette méthode permet de prédire l'état métabolique et la santé des HSPC pendant le développement sanguin et les maladies.

Notre méthode d'extraction nous a permis de récolter jusqu'à 80 000 HSPc LSK par souris. La viabilité et le nombre de cellules LSK ont été améliorés avec notre méthode, parce que nous : (1) la moelle osseuse combinée des membres supérieurs et inférieurs, des os de hanche, du sternum, de la cage thoracique, et de la colonne vertébrale, (2) évité d'utiliser le tampon de lyse de cellules rouges qui aurait augmenté la mort cellulaire et l'agglutination, (3) a utilisé la séparation moyenne de gradient de den...

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Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Les cellules progénitrices de tige hématopoïétiques (HSPc) transition d'un état quiescent à un état de différenciation dû à leur plasticité métabolique pendant la formation de sang. Ici, nous présentons une méthode optimisée pour mesurer la respiration mitochondriale et la glycolyse des HSPC.

Analyse du métabolisme hématopoïétique des cellules progénitrices

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Les changements métaboliques dans les cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre leur permettent de passer de leur état de quiescent à un état de différenciation pour soutenir des demandes de formation de sang. L’altération de la plasticité métabolique des cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre mène aux désordres hématologiques. Notre protocole aidera à mesurer la régulation métabolique et la santé des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pendant le développement sanguin et les maladies.L’analyse de la respiration mitochondrique et de la glycolyse des cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre est difficile car elles sont la population fragile et rare. Notre protocole optimisé permet l’isolement d’une plus grande quantité de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de la moelle osseuse murine, améliore leur viabilité pendant l’incubation, facilite l’analyse du flux extracellulaire des HSPC non adhérents et fournit des paramètres d’injection optimisés pour la phosphorylation oxydative ciblant les médicaments ainsi que les voies glycolytiques. Pour commencer cette procédure, remplissez les puits de la plaque d’utilité et les chambres autour des puits avec de l’eau stérile.Submergez la cartouche du capteur dans la plaque d’utilité en vous assurant que les capteurs sont complètement recouverts d’eau. Placez ensuite la cartouche immergée dans la plaque d’utilité dans un incubateur non CO2 à 37 degrés Celsius pour incuber pendant la nuit. Dans une armoire de biosécurité de classe II, ajouter 40 microlitres de solution PLL disponible dans le commerce à chaque puits de la plaque d’essai.Couvrir la plaque d’essai avec le couvercle fourni dans le kit et incuber la plaque fermée à température ambiante sous le capot pendant une heure. Après cela, utilisez un aspirateur stérile à base de vide pour enlever la solution excédentaire et sécher à l’air la plaque sous le capot. Pour récolter les cellules de moelle osseuse murine mononucléées, ajouter cinq millilitres de gradient de densité moyen à un tube conique de 15 millilitres.Ajouter lentement cinq millilitres de la suspension cellulaire de la moelle osseuse en s’assurant que les cellules restent comme une couche au-dessus du milieu de gradient de densité. Centrifugeuse à 500 fois g et à température ambiante pendant 30 minutes en s’assurant que la centrifugeuse est à la plus faible accélération possible. Récoltez l’interface moyenne des cellules mononucléées dans un tube frais de 15 millilitres.Ensuite, lavez les cellules avec cinq millilitres de 1X PBS contenant 2%FBS. Centrifugeuse à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Enlevez le supernatant et resuspendez les cellules dans 300 microlitres de 1X PBS contenant 2%FBS.Ensuite, aliquot 10 microlitres de la suspension cellulaire pour un contrôle non taché ou unicolore dans un tube FACS. Pour récolter les HSPCs LSK à partir de cellules de moelle osseuse murine mononucléées, ajoutez 15 microlitres de cocktail d’anticorps biotine à 300 microlitres de cellules de moelle osseuse mononucléées. Pour récolter les HSPCs LSK à partir de cellules de moelle osseuse murine mononucléées, ajoutez 15 microlitres de cocktail d’anticorps biotine à 300 microlitres de cellules de moelle osseuse mononucléées.Placer les tubes dans un seau à glace placé sur un shaker dans un réfrigérateur pour incuber à quatre degrés Celsius avec agitation pendant 30 minutes. Ajouter ensuite 10 millilitres de 1X PBS pré-refroidi contenant 2% de FBS aux cellules. Centrifugeuse à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Jetez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 400 microlitres de 1X PBS contenant 2%FBS. Vortex brièvement les microbilles anti-biotine avant utilisation. Ajouter 80 microlitres des microbilles à chaque échantillon et bien mélanger.Incuber pendant 20 minutes supplémentaires à quatre degrés Celsius avec agitation. Après cela, ajouter 10 millilitres de PBS pré-réfrigéré contenant 2%FBS aux cellules. Centrifuger le tube à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Jetez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS contenant 2%FBS. Rangez la suspension cellulaire à quatre degrés Celsius tout en installant l’unité de séparation magnétique. Placez la colonne dans un champ magnétique pour le séparateur de tri des cellules magnétiques assistées à quatre degrés Celsius.Préparez la colonne pour la séparation magnétique en la rinçant avec trois millilitres de 1X PBS contenant 2%FBS sous flux de gravité à quatre degrés Celsius. Ajouter la suspension cellulaire à la colonne pré-humide à quatre degrés Celsius. Laissez toutes les cellules traverser la colonne à quatre degrés Celsius et recueillez les effluents dans un tube conique de 15 millilitres.Ensuite, lavez la colonne avec trois millilitres de 1X PBS et 2%FBS à quatre degrés Celsius. Répétez ce lavage trois fois. Recueillir le flux à travers et le garder à quatre degrés Celsius.Centrifugeuse le tube conique contenant le flux à travers à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules en 0,5 millilitres de 1X PBS avec 2%FBS et transférez la suspension dans un tube FACS. Ajouter ensuite 24 microlitres du cocktail d’anticorps LSK à chaque tranche de 10 millions de cellules.Couvrir le tube de papier d’aluminium et incuber dans l’obscurité à quatre degrés Celsius avec agitation pendant une heure. Après cela, ajouter trois millilitres de 1X PBS avec 2%FBS au tube FACS. Centrifugeuse à 500 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Jetez le supernatant et resuspendez les cellules étiquetées anticorps en un millilitre de 1X PBS contenant 2%FBS. Juste avant le tri, ajouter un microlitre d’un milligramme par millilitre d’iodure de propidium à la suspension cellulaire et utiliser une passoire de 40 micromètres pour filtrer le contenu du tube FACS. Tout d’abord, centrifugeuse les cellules LSK recueillies à 500 fois g et à température ambiante pendant cinq minutes.Jetez le supernatant et résépendez les cellules dans un média complet à une concentration finale d’au moins 70 000 cellules par 40 microlitres. Ensemencer 40 microlitres de cette suspension cellulaire dans les puits d’une plaque de huit puits recouverte de PLL en s’assurant de laisser tous les puits d’angle vides. Centrifuger la plaque à 450 fois g et à température ambiante pendant une minute.Utilisez un microscope inversé pour vous assurer que les cellules sont fixées au fond des puits. Après cela, ajouter 135 microlitres de supports complets aux cellules de chaque puits, ce qui porte le volume final de chaque puits à 175 microlitres. Ajouter 175 microlitres de supports complets aux deux coins de la plaque sous forme de blancs.Incuber les cellules dans un incubateur non CO2 à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, mettre en place un programme pour l’analyseur d’ajouter des médicaments à chaque puits de la plaque tel que décrit dans le tableau deux et le tableau trois du protocole texte. Pour le test de résistance mitochondrial, récupérer la cartouche de capteur dans la plaque d’utilité de l’incubateur de sorte que chaque puits a une concentration finale de deux oligomycine micromolaire, 1,5 micromolaire FCCP, et 0,5 micromolaire de rotenone et anti-mycine A au besoin.Retirez le couvercle de la cartouche du capteur et placez-le sur le plateau de l’instrument. Commencez le processus d’étalonnage qui prendra 20 minutes. Lorsque l’étalonnage est terminé, retirez la plaque utilitaire et remplacez-la par la plaque d’analyse contenant les cellules LSK.Appuyez sur continuer à démarrer le programme précédemment défini. Lorsque le programme est terminé, récupérez les données et analysez-les. Dans cette étude, une quantité maximale de HSPCs viables de LSK de murine sont isolés et leur métabolisme glycolyse et mitochondrique est mesuré avec un analyseur de flux extracellulaire.Bien que l’analyse du flux extracellulaire soit traditionnellement utilisée pour les cellules adhérentes, cette méthode rend les HSPC LSK adhérents aux puits enduits de PLL, ce qui permet de mesurer le flux extracellulaire et donc la santé métabolique des HSPCs LSK. Afin de mesurer la respiration mitochondrique par le taux de consommation d’oxygène et la glycolyse par le taux d’acidification extracellulaire dans des conditions basales et de stress, les médicaments qui interfèrent avec la glycolyse et la respiration mitochondrique sont injectés séquentiellement. Comme prévu, le niveau basal du taux d’acidification extracellulaire est plus élevé pour les HSPCs de LSK cultivés dans le glucose et pyruvate les médias positifs comparés à ceux cultivés dans les médias négatifs.L’injection de glucose n’a pas changé le taux d’acidification extracellulaire pour les cellules cultivés dans les médias positifs, mais elle a stimulé la glycolyse des cellules dans les médias négatifs. Cependant, le niveau basal de ces cellules est resté plus bas dans le groupe positif. L’injection avec l’oligomycine a activé la glycolyse à son niveau maximum dans le groupe positif, mais n’a pas affecté le groupe négatif.L’injection avec l’analogue de glucose à 2-DG a retourné le taux d’acidification extracellulaire aux niveaux non glycolytiques. Pour le test de stress mitochondrial, l’injection d’oligomycine hyperpolarisé la membrane mitochondriale empêchant plus de pompage de protons à travers les complexes ETC et réduisant ainsi le taux de respiration mitochondriale. L’injection de FCCP pousse le taux de consommation d’oxygène au maximum pendant que les cellules essayent de récupérer le potentiel mitochondrique de membrane.L’injection avec deux autres inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons provoque l’arrêt complet de la respiration mitochondriale et donc le taux de consommation d’oxygène est revenu à son niveau minimum. S’il vous plaît éviter l’utilisation de tampon de lyse de globule rouge pour l’isolement cellulaire mononucléaire. Nous recommandons la séparation du gradient Ficoll pour empêcher la formation de touffes et réduire la perte de LSK.En utilisant notre méthode optimisée, nous pouvons mesurer la respiration mitochondrique et la glycolyse des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques rares et fragiles et l’étude des indices métaboliques régulent l’hématopoïèse normale et maligne.

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