Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Diese Arbeit wird zum Teil durch die finanzielle Unterstützung der National Institutes of Health (HL131645, CA016058), der St. Baldrick es Foundation und der Pelotonia Foundation unterstützt.

Dieses Protokoll wurde vom Nationwide Children es Hospital Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
HINWEIS: Das Protokoll wird in chronologischer Reihenfolge beschrieben, die sich über einen Zeitraum von zwei Tagen erstreckt. Verwenden Sie frische Reagenzien, wie im folgenden Protokoll beschrieben.
1. Herstellung von Reagenzien am Tag vor dem Assay
<ol><li>
Hydratisieren Sie die Sensorpatrone.
	<ol>
<li>Inkubieren Sie 5 ...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

Hier zeigen wir die Isolierung einer maximalen Menge an reiner und lebensfähiger muriner LSK HSPCs Population sowie die Messung ihrer Glykolyse und mitochondrialen Atmung mit einem extrazellulären Flussanalysator. Insbesondere überwindet das Protokoll die folgenden technischen Probleme für die Verwendung von LSK HSPCs: i) die niedrige Frequenz von LSK HSPCs im murinen Knochenmark14, ii) niedrige basale metabolische Aktivität von LSK HSPCs26, iii) die Fragilität von LS...

Da die Lebensdauer der meisten reifen Blutkörperchen kurz ist, beruht die Homöostase des Blutes auf der Selbsterneuerung und Differenzierung einer langlebigen, aber seltenen Population hämatopoetischer Stammzellen (HSPCs)1. HSPCs sind still, aber sie sind schnell zu vermehren und unterziehen Differenzierung auf Stimulation, um die Anforderungen des Blutsystems zu erhalten. Da jeder HSPC-Zellzustand eine einzigartige bioenergetische Nachfrage erfordert, sind die metabolischen Veränderungen die wichtigsten Treiber von HSPC-Schicksalsentscheidungen. Daher führt der Verlust der metabolischen Plastizität, indem das Gleichgewicht zwischen Ruhe, Selbsterneuerung und Differenzierung von HSPCs verändert wird, oft zu myelo- oder lympho-proliferativen Störungen. Zusammen ist das Verständnis der metabolischen Regulation der HSPC-Entwicklung entscheidend, um Mechanismen aufzudecken, die hämatologischen Malignitäten2,3,4,5zugrunde liegen.
Mitochondriale Atmung und Glykolyse erzeugen ATP, um intrazelluläre Reaktionen anzutreiben und die für die Makromolekülsynthese notwendigen Bausteine zu produzieren. Da HSPCs im Vergleich zu differenzierten Zellen6 eine niedrige mitochondriale Masse haben und in hypoxischen Knochenmarknischen Ruhe halten, setzen HSPCs in erster Linie auf Glykolyse. Die Aktivierung von HSPCs verbessert ihren mitochondrialen Stoffwechsel, der zum Verlust der Ruhe und ihrem anschließenden Eintritt in den Zellzyklus führt. Eine solche metabolische Plastizität von HSPCs ermöglicht die Aufrechterhaltung des HSPC-Pools während des gesamten Erwachsenenlebens6,7,8,9,10,11,12. Daher ist es wichtig, ihre metabolischen Aktivitäten zu untersuchen, wie die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR; Index der oxidativen Phosphorylierung) und die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR; Index der Glykolyse), um die HSPC-Aktivierung und den Gesundheitszustand zu analysieren. Sowohl die OCR als auch die ECAR können gleichzeitig in Echtzeit mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen werden. Die aktuelle Methode erfordert jedoch eine große Anzahl von Zellen und ist für anhimierende Zellen13optimiert. Da HSPCs nicht in großen Mengen von Mäusen isoliert werden können14, eine Sortierung erfordern, um eine reine Population zu erhalten, sind nicht-anhantibe Zellen15, und kann nicht über Nacht kultiviert werden, ohne Differenzierung zu vermeiden16, war es schwierig, die OCR und die ECAR von HSPCs zu messen. Hier bieten wir eine Reihe klarer, Schritt-für-Schritt-Anleitungen, um videobasierte Tutorials zu begleiten, wie man metabolische Atmung und Glykolyse von einigen tausend murinen Knochenmark-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs misst.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) haben eine ausgeprägte metabolische Plastizität, die es ihnen ermöglicht, von ihrem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand überzugehen, um die Anforderungen der Blutbildung aufrechtzuerhalten. Allerdings war es schwierig, den metabolischen Zustand (mitochondriale Atmung und Glykolyse) von HSPCs aufgrund ihrer begrenzten Anzahl und des Fehlens optimierter Protokolle für nicht-haftige, zerbrechliche HSPCs zu analysieren. Hier stellen wir eine Reihe klarer, Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Messung der metabolischen Atmung (Sauerstoffverbrauchsrate; OCR) und Glykolyse (extrazelluläre Versauerungsrate; ECAR) von murinen Knochenmark-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Dieses Protokoll bietet eine höhere Menge an LSK-HSPCs aus murinen Knochenmark, verbessert die Lebensfähigkeit von HSPCs während der Inkubation, erleichtert extrazelluläre Flussanalysen von nicht-haftenden HSPCs und bietet optimierte Injektionsprotokolle (Konzentration und Zeit) für Medikamente, die auf oxidative Phosphorylierung und glykolytische Pfade abzielen. Diese Methode ermöglicht die Vorhersage des Stoffwechselzustands und der Gesundheit von HSPCs während der Blutentwicklung und Krankheiten.

Unsere Extraktionsmethode ermöglichte es uns, bis zu 80.000 LSK HSPCs pro Maus zu ernten. Die Lebensfähigkeit und Anzahl der LSK-Zellen wurde mit unserer Methode verbessert, weil wir: (1) Knochenmark aus oberen und unteren Gliedmaßen, Hüftknochen, Brustbein, Rippenkäfig und Wirbelsäule kombinierten, (2) die Verwendung eines roten Zelllysepuffers vermieden, der den Zelltod und die Verklumpung erhöht hätte, (3) nutzte die Dichtegradienten-Mitteltrennung von mononukleierten Zellen und (4) die Verwendung von vorgekü...

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Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) übergehen von einem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand aufgrund ihrer metabolischen Plastizität während der Blutbildung. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von HSPCs vor.

Analyse des hämatopoetischen Stamm-Vorläufer-Zellstoffwechsels

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Metabolische Veränderungen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen ermöglichen es ihnen, von ihrem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand überzugehen, um die Anforderungen an die Blutbildung zu erhalten. Die Veränderung der metabolischen Plastizität von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen führt zu hämatologischen Störungen. Unser Protokoll wird dazu beitragen, die metabolische Regulation und die Gesundheit von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen während der Blutentwicklung und Krankheiten zu messen.Die Analyse der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen ist schwierig, da sie zerbrechlich und selten sind. Unser optimiertes Protokoll ermöglicht die Isolierung einer höheren Menge hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark, verbessert deren Lebensfähigkeit während der Inkubation, erleichtert die extrazelluläre Flussanalyse nicht-anhaftender HSPCs und bietet optimierte Injektionsparameter für die bekämpfungde oxidative Phosphorylierung sowie glykolytische Wege. Um dieses Verfahren zu beginnen, füllen Sie die Brunnen der Versorgungsplatte und die Kammern um die Brunnen mit sterilem Wasser.Tauchen Sie die Sensorpatrone in die Netzteilplatte ein, um sicherzustellen, dass die Sensoren vollständig mit Wasser bedeckt sind. Dann legen Sie die Patrone in der Versorgungsplatte in einem Nicht-CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius, um über Nacht zu brüten. In einem Biosicherheitsschrank der Klasse II fügen Sie 40 Mikroliter handelsüblichen 0,1%PLL-Lösung zu jedem Brunnen der Assayplatte hinzu.Bedecken Sie die Assayplatte mit dem im Kit enthaltenen Deckel und bebrüten Sie die geschlossene Platte bei Raumtemperatur unter der Haube für eine Stunde. Danach verwenden Sie einen sterilen Vakuum-aspirator, um die überschüssige Lösung zu entfernen und die Platte unter der Haube zu trocknen. Um mononukleierte murinierte Knochenmarkzellen zu ernten, fügen Sie fünf Milliliter Dichtegradienten medium zu einem 15 Milliliter konischen Rohr hinzu.Fügen Sie langsam fünf Milliliter der Knochenmarkzellsuspension hinzu, um sicherzustellen, dass die Zellen als Schicht über dem Dichtegradientenmedium bleiben. Zentrifuge bei 500 mal g und bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um sicherzustellen, dass die Zentrifuge bei der geringstmöglichen Beschleunigung ist. Ernten Sie die mittlere Schnittstelle der mononukleierten Zellen in eine frische 15 Milliliter Tube.Waschen Sie dann die Zellen mit fünf Millilitern 1X PBS, die 2%FBS enthalten. Zentrifuge bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 300 Mikrolitern 1X PBS mit 2%FBS wieder auf.Als nächstes aliquot 10 Mikroliter der Zellsuspension für ungefärbte oder einfarbige Kontrolle in einem FACS-Rohr. Um LSK HSPCs aus mononukleierten murinen Knochenmarkzellen zu ernten, fügen Sie 15 Mikroliter Biotin-Antikörpercocktail zu 300 Mikrolitermononukleated Knochenmarkzellen hinzu. Um LSK HSPCs aus mononukleierten murinen Knochenmarkzellen zu ernten, fügen Sie 15 Mikroliter Biotin-Antikörpercocktail zu 300 Mikrolitermononukleated Knochenmarkzellen hinzu.Legen Sie die Rohre in einen Eiskübel, der auf einem Shaker in einem Kühlschrank positioniert ist, um bei vier Grad Celsius mit Rührung für 30 Minuten zu brüten. Fügen Sie dann 10 Milliliter vorgekühlte 1X PBS mit 2%FBS zu den Zellen hinzu. Zentrifuge bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 400 Mikrolitern 1X PBS mit 2%FBS wieder auf. Kurz wirbeln die Anti-Biotin-Mikroperlen vor der Verwendung. Fügen Sie 80 Mikroliter der Mikroperlen zu jeder Probe hinzu und mischen Sie sie gut.Weitere 20 Minuten bei vier Grad Celsius mit Aufregung inkubieren. Danach fügen Sie 10 Milliliter vorgekühlter PBS, die 2%FBS enthalten, zu den Zellen hinzu. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS mit 2%FBS wieder auf. Bewahren Sie die Zellsuspension bei vier Grad Celsius auf, während Sie die magnetische Trenneinheit einrichten. Platzieren Sie die Säule in einem Magnetfeld für den magnetisch unterstützten Zellsortierabscheider bei vier Grad Celsius.Bereiten Sie die Säule für die magnetische Trennung vor, indem Sie sie mit drei Millilitern 1X PBS mit 2%FBS unter Schwerkraftfluss bei vier Grad Celsius spülen. Fügen Sie die Zellsuspension bei vier Grad Celsius in die vornasse Säule ein. Lassen Sie alle Zellen bei vier Grad Celsius durch die Säule passieren und sammeln Sie das Abwasser in einem 15 Milliliter konischen Rohr.Als nächstes waschen Sie die Säule mit drei Millilitern 1X PBS und 2%FBS bei vier Grad Celsius. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal. Sammeln Sie den Durchfluss und halten Sie ihn bei vier Grad Celsius.Zentrifugieren Sie das konische Rohr, das den Durchfluss bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten enthält. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 0,5 Millilitern 1X PBS mit 2%FBS wieder aus und übertragen Sie die Suspension in ein FACS-Rohr. Dann fügen Sie 24 Mikroliter des LSK-Antikörpercocktails zu je 10 Millionen Zellen hinzu.Das Rohr mit Folie bedecken und im Dunkeln bei vier Grad Celsius eine Stunde lang mit Aufregung bedecken. Danach fügen Sie drei Milliliter 1X PBS mit 2%FBS in das FACS-Rohr. Zentrifuge bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die antikörperbeschrifteten Zellen in einem Milliliter 1X PBS mit 2%FBS wieder aus. Kurz vor der Sortierung einen Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Propidiumjodid in die Zellsuspension geben und mit einem 40-Mikrometer-Sieb den Inhalt der FACS-Röhre filtern. Zunächst zentrifugieren Sie die gesammelten LSK-Zellen bei 500-fachem g und bei Raumtemperatur für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in vollständigen Medien auf eine Endkonzentration von mindestens 70 000 Zellen pro 40 Mikroliter wieder aus. Samen 40 Mikroliter dieser Zellsuspension in die Brunnen einer PLL beschichteten Acht-Well-Platte, die sicherstellen, dass alle Eckbrunnen leer zu lassen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 450 mal g und bei Raumtemperatur für eine Minute.Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen an der Unterseite der Brunnen befestigt sind. Danach fügen Sie 135 Mikroliter komplette Medien in die Zellen in jedem Brunnen hinzu und bringen das Endvolumen jedes Brunnens auf 175 Mikroliter. Fügen Sie 175 Mikroliter komplettemedien als Rohlinge in die beiden Ecken der Platte.Inkubieren Sie die Zellen in einem Nicht-CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Richten Sie dann ein Programm für den Analysator ein, um jedem Brunnen der Platte Medikamente hinzuzufügen, wie in Tabelle 2 und Tabelle drei des Textprotokolls beschrieben. Für den mitochondrialen Stresstest, holen Sie die Sensorpatrone in der Gebrauchsplatte aus dem Inkubator, so dass jeder Brunnen eine endgültige Konzentration von zwei mikromolaren Oligomycin, 1,5 Mikromolar FCCP, und 0,5 Mikromolar von entweder Roton und Anti-Mycin A nach Bedarf hat.Entfernen Sie den Deckel von der Sensorpatrone und legen Sie ihn auf das Gerätefach. Beginnen Sie den Kalibrierungsprozess, der 20 Minuten dauert. Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Versorgungsplatte und ersetzen Sie sie durch die Assayplatte, die die LSK-Zellen enthält.Drücken Sie die Taste continue, um das zuvor eingestellte Programm zu starten. Wenn das Programm abgeschlossen ist, rufen Sie die Daten ab und analysieren Sie sie. In dieser Studie wird eine maximale Menge an lebensfähigen murinen LSK HSPCs isoliert und ihre Glykolyse und ihr mitochondrialer Stoffwechsel mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen.Obwohl die extrazelluläre Flussanalyse traditionell für anhäßende Zellen verwendet wird, macht diese Methode LSK HSPCs an PLL-beschichtete Brunnen haften, was die Messung des extrazellulären Flusses und damit des metabolischen Zustands von LSK HSPCs ermöglicht. Um die mitochondriale Atmung durch die Sauerstoffverbrauchsrate und Glykolyse durch die extrazelluläre Versauerungsrate bei Basal- und Stressbedingungen zu messen, werden Medikamente, die die Glykolyse und die mitochondriale Atmung stören, sequenziell injiziert. Wie erwartet ist der Basalgehalt der extrazellulären Versauerungsrate bei LSK HSPCs, die in Glukose- und Pyruvat-positiven Medien kultiviert sind, höher als bei den in negativen Medien kultivierten.Die Injektion mit Glukose änderte nicht die extrazelluläre Versauerungsrate für die zellenkultiviert in den positiven Medien, aber es steigerte die Glykolyse der Zellen in negativen Medien. Der Basalgehalt dieser Zellen blieb jedoch in der positiven Gruppe niedriger. Die Injektion mit Oligomycin aktivierte die Glykolyse auf ihrem maximalen Niveau in der positiven Gruppe, hatte aber keinen Einfluss auf die negative Gruppe.Die Injektion mit dem Glukose-Analog bei 2-DG brachte die extrazelluläre Versauerungsrate auf nicht-glykolytische Werte zurück. Für den mitochondrialen Stresstest hyperpolarisierte die Injektion von Oligomycin die mitochondriale Membran, die mehr Protonenpumpen durch die ETC-Komplexe verhinderte und somit die Rate der mitochondrialen Atmung reduzierte. Die Injektion von FCCP drückt die Sauerstoffverbrauchsrate auf das Maximum, da Zellen versuchen, das mitochondriale Membranpotenzial zurückzugewinnen.Die Injektion mit zwei weiteren Elektronentransportketteninhibitoren bewirkt, dass die mitochondriale Atmung vollständig zum Stillstand kommt und damit die Sauerstoffverbrauchsrate auf ihr Mindestniveau zurückgesetzt wird. Bitte vermeiden Sie die Verwendung eines Red-Zell-Lysepuffers für die mononukleäre Zellisolation. Wir empfehlen die Ficoll Gradiententrennung, um die Verklumpbildung zu verhindern und den Verlust von LSK zu reduzieren.Mit unserer optimierten Methode können wir die mitochondriale Atmung und Glykolyse seltener und zerbrechlicher hämatosischer Stamm- und Vorläuferzellen messen und die Untersuchung von metabolischen Hinweisen normale und bösartige Hämatopoese regulieren.

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Ableitung von Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen

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Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

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Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1<sup&gt; Hoch</sup&gt; Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

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The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

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One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Elektrophysiologische Analyse von humanen Pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten (hPSC-CMs) unter Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

Erkennung von passives Spender erythroiden Vorläuferzellen nach hämatopoetische Stammzell-Transplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Entwicklung eines In-vitro- Assay, hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Quantitate Zellen (HSPCs) bei der Entwicklung von Zebrafish Embryos

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...