Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

עבודה זו מהווה חלק בתמיכת המימון של המכון הלאומי לבריאות (HL131645, CA016058), קרן סנט בלדריק וקרן פליטוניה.

פרוטוקול זה אושר על ידי הילדים ברחבי המדינה טיפול בבעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC).
הערה: הפרוטוקול מתואר בסדר כרונולוגי המתפרס במשך יומיים. השתמש ריאגנטים טרי כפי שמתואר בפרוטוקול להלן.
1. הכנת ריאגנטים ביום שלפני השיטת הזמן
<ol><li>
. מימה את מחסנית ...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

כאן, אנו להדגים את הבידוד של כמות מקסימלית של האוכלוסייה הטהורה מורצק LSK הקיימא, כמו גם את המדידה של גליקוליזיס שלהם ואת הנשימה מיטוכונדריאלי עם מנתח השטף של מסחטות. באופן ספציפי, הפרוטוקול גובר על הנושאים הטכניים הבאים לשימוש ב-LSK HSPCs: i) התדר הנמוך של LSK HSPCs במוח עצם מוריין14, ii) פ?...

כיוון שתוחלת החיים של כדוריות הדם הבוגרות ביותר קצרה, הומאוסטזיס של דם נשענת על התחדשות עצמית והבחנה של אוכלוסייה ארוכת חיים אך נדירה של תאי גזע המטקיים (HSPCs)1. HSPCs הם השקט, אבל הם מהירים להתרבות ולעבור בידול על הגירוי כדי לקיים את הדרישות של מערכת הדם. כמו כל מדינה סלולרית HSPC דורש דרישה bioenergetic ייחודית, שינויים מטבולית הם מנהלי מפתח של החלטות הגורל HSPC. לכן, אובדן הפלסטיות המטבולית, על ידי שינוי שיווי המשקל בין שקט, התחדשות עצמית, והבידול של HSPCs, לעתים קרובות מוביל הפרעות myelo או lympho ההתרבות. יחד, ההבנה של רגולציה המטבולית של הפיתוח hspc הוא קריטי לחשוף מנגנונים בבסיס ממאירות המטקולוגי2,3,4,5.
נשימה מיטוכונדריאלי וגליקולזיס מייצרים ATP כדי לנהוג בתגובות תאיים ולייצר את אבני הבניין הדרושות לסינתזה מקרומולקולה. מאז HSPCs יש מסה נמוכה מיטוכונדריאלי בהשוואה לתאים הבדיל6 והם מקיימים השקט בגומחות במח ארוי העצם, hspcs מסתמכים בעיקר על גליקוליזיס. ההפעלה של HSPCs משפר את חילוף החומרים היטוכונדריאלי שמוביל לאובדן השקט והכניסה הבאה שלהם לתוך מחזור התא. הפלסטיות המטבולית הזאת של hspcs מאפשר תחזוקה של בריכת hspc לאורך חיי מבוגרים6,7,8,9,10,11,12. לכן, זה קריטי לחקור את פעילויות חילוף החומרים שלהם, כגון שיעור צריכת החמצן (OCR; אינדקס של זירחון חמצוני) ואת שיעור חמצה מסירה (ECAR; אינדקס של גליקוליזיס) כדי לנתח את ההפעלה HSPC ואת מצב הבריאות. הן OCR ו-ECAR ניתן למדוד בו זמנית, בזמן אמת, באמצעות מנתח השטף החילוץ. עם זאת, השיטה הנוכחית דורשת מספר גדול של תאים וממוטבת עבור תאים מחסיד13. מאז HSPCs לא ניתן לבודד בכמויות גדולות מעכברים14, דורשים מיון כדי להשיג אוכלוסייה טהורה, הם תאים לא חסיד15, ואין אפשרות להיות מתורבת לילה מבלי להימנע בידול16, זה היה קשה למדוד את ה-OCR ואת ecar של hspcs. כאן, אנו מספקים קבוצה של ברור, צעד אחר צעד הוראות ללוות וידאו מבוססי הדרכות על איך למדוד נשימה מטבולית ו גליקוליזיס של כמה אלפי העצם מוריין מחמינוסSca1+c-Kit+ (lsk) hspcs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

המטפאות בתאי הגזע (HSPCs) יש הפלסטיות המטבולית ברורים, אשר מאפשר להם מעבר מהמצב השקט שלהם למצב בידול כדי לקיים את הדרישות של היווצרות הדם. עם זאת, היה קשה לנתח את מצב חילוף החומרים (הנשמה מיטוכונדריאלי) של HSPCs בשל המספרים המוגבלים שלהם וחוסר פרוטוקולים ממוטבים עבור HSPCs שברירית, שברירי. כאן, אנו מספקים קבוצה של ברור, צעד אחר צעד הוראות למדוד נשימה מטבולית (שיעור צריכת החמצן; OCR) ו גליקוליזיס (שיעור חמצה מסחטות; ECAR) של מח עצם מורין-השושלתמינוסSca1+c-Kit+ (lsk) hspcs. פרוטוקול זה מספק כמות גבוהה יותר של LSK HSPCs מ מח עצם murine, משפר את הכדאיות של HSPCs במהלך הדגירה, מאפשר ניתוח השטף החילוץ של שאינם חסיד HSPCs, ומספק פרוטוקולי הזרקה אופטימיזציה (ריכוז וזמן) עבור תרופות מיקוד זרחון חמצוני ומסלולים גליקוליטיות. שיטה זו מאפשרת חיזוי מעמד חילוף החומרים ובריאות HSPCs במהלך פיתוח דם ומחלות.

שיטת החילוץ שלנו אפשרה לנו לקצור עד ~ 80,000 LSK HSPCs לכל עכבר. הכדאיות והמספרים של תאים LSK שופרו עם השיטה שלנו, כי אנחנו: (1) מח עצם משולב מגפיים העליון והתחתון, עצמות הירך, עצם החזה, צלעות כלוב, ועמוד השדרה, (2) נמנע באמצעות מאגר לפירוק התאים האדומים כי היה להגדיל את מוות התאים והשיא, ( השתמשו בצפיפות ה...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

מעבר ממצב השקט למצב בידול בשל הפלסטיות המטבולית שלהם במהלך היווצרות הדם. כאן, אנו מציגים שיטה ממוטבת למדידת נשימה מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס של HSPCs.

ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

שינויים מטבוליים בגזע hematopoietic ותאי אביהם מאפשרים להם לעבור מהמדינה ההפוגה שלהם למצב התברואה כדי לקיים את הדרישות של היווצרות הדם. שינוי בפלסטיות מטבולית של גזע hematopoietic ותאי צאצא מוביל להפרעות המטולוגיות. הפרוטוקול שלנו יעזור למדוד את הרגולציה המטבולית ואת הבריאות של גזע hematopoietic ותאי ההמה במהלך התפתחות הדם ומחלות.ניתוח של הנשימה המיטוכונדרית וגליקוליזה של גזע hematopoietic ותאי הצאצא קשה כפי שהם אוכלוסייה שברירית ונדירה. הפרוטוקול האופטימי שלנו מאפשר בידוד של כמות גבוהה יותר של תאי גזע וצאצאים מהמורין עצם, משפר את הכדאיות שלהם במהלך הדגירה, מקל על ניתוח שטף חוץ-תאי של HSPCs שאינם חסידים, ומספק פרמטרי הזרקה אופטימליים לתרופות המכוונות לזרחון חמצוני כמו גם מסלולים גליקוליטיים. כדי להתחיל בהליך זה, למלא את הבארים של צלחת השירות ואת התאים סביב הבארים עם מים סטריליים.להטביע את מחסנית החיישן לתוך לוח השירות לוודא כי החיישנים מכוסים לחלוטין על ידי מים. לאחר מכן מניחים את המחסנית שקועה בצלחת השירות באינקובטור שאינו CO2 ב 37 מעלות צלזיוס כדי להדגור בן לילה. בארונות biosafety מסוג II, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של פתרון מסחרי זמין של 0.1%PLL לכל באר של צלחת ההתמדה.מכסים את צלחת ההסגר עם המכסה המסופק בערכה ודורגים את הצלחת הסגורה בטמפרטורת החדר מתחת למכסה המנוע במשך שעה. לאחר מכן, השתמשו בהשראה סטרילית המבוססת על ואקום כדי להסיר את הפתרון העודף ולייבש את הצלחת מתחת למכסה המנוע. כדי לקצור תאי מח עצם מורין מונונוקלציה, להוסיף חמישה מיליליטר של בינוני שיפוע צפיפות לצינור חרוט 15 מיליליטר.לאט להוסיף חמישה מיליליטר של המתלה תא מח העצם לוודא כי התאים נשארים כשכבה מעל המדיום שיפוע צפיפות. צנטריפוגה ב 500 פעמים g ו בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לוודא כי הצנטריפוגה היא ההאצה הנמוכה ביותר האפשרית. לקצור את הממשק האמצעי של תאים mononucleated לתוך צינור טרי 15 מיליליטר.לאחר מכן לשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של PBS 1X המכיל 2%FBS. צנטריפוגה ב 500 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים ב- 300 מיקרוליטרים של PBS 1X המכילים 2%FBS.לאחר מכן, aliquot 10 microliters של ההשעיה התא עבור שליטה לא מוכתמת או חד-צבעית בצינור FACS. כדי לקצור LSK HSPCs מתאים חד-גרעיניים של מח עצם מורין, הוסיפו 15 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים ביוטין ל-300 מיקרוליטרים של תאי מח עצם חד-גרעיניים. כדי לקצור LSK HSPCs מתאים חד-גרעיניים של מח עצם מורין, הוסיפו 15 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים ביוטין ל-300 מיקרוליטרים של תאי מח עצם חד-גרעיניים.מניחים את הצינורות בדלי קרח ממוקם על שייקר במקרר כדי דגירה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה במשך 30 דקות. לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של PBS 1X מקורר מראש המכיל 2%FBS לתאים. צנטריפוגה ב 500 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על גלולת התא ב-400 מיקרוליטרים של 1X PBS המכילים 2%FBS. בקצרה מערבולת microbeads אנטי ביוטין לפני השימוש. מוסיפים 80 מיקרולייטרים של המיקרוביאדים לכל דגימה ומערבבים היטב.דגירה במשך 20 דקות נוספות בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של PBS מקורר מראש המכיל 2%FBS לתאים. צנטריפוגה הצינור ב 500 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על גלולת התא במיליליטר אחד של PBS המכיל 2%FBS. אחסן את מתלי התא בארבע מעלות צלזיוס בעת הגדרת יחידת ההפרדה המגנטית. מקם את העמודה בשדה מגנטי עבור מפריד מיון התאים בסיוע מגנטי בארבע מעלות צלזיוס.הכן את העמודה להפרדה מגנטית על ידי שטיפתה בשלושה מיליליטר של PBS 1X המכיל 2% FBS תחת זרימת כבידה בארבע מעלות צלזיוס. מוסיפים את מתלי התא לעמודה הרטובה מראש בארבע מעלות צלזיוס. אפשר לכל התאים לעבור דרך העמוד בארבע מעלות צלזיוס ולאסוף את הצלם בצינור חרוט 15 מיליליטר.לאחר מכן, לשטוף את העמוד עם שלושה מיליליטר של 1X PBS ו 2% FBS בארבע מעלות צלזיוס. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים. לאסוף את הזרימה דרך ולשמור אותו בארבע מעלות צלזיוס.צנטריפוגה הצינור חרוט המכיל את הזרימה דרך ב 500 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והעבר את התאים ב- 0.5 מיליליטר של 1X PBS עם 2%FBS והעבר את ההשעיה לצינור FACS. לאחר מכן הוסיפו 24 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים LSK לכל 10 מיליון תאים.מכסים את הצינור בנייר כסף ודגירה בחושך בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה במשך שעה. לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר של PBS 1X עם 2%FBS לצינור FACS. צנטריפוגה ב 500 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים המסומן בנוגדנים במיליליטר אחד של 1X PBS המכיל 2%FBS. רגע לפני המיון, מוסיפים מיקרוליטר אחד של מיליגרם אחד למיליליטר פרופידיום יודיד לתליית התא ולהשתמש מסננת 40 מיקרומטר כדי לסנן את התוכן של צינור FACS. ראשית, צנטריפוגה תאים LSK שנאספו ב 500 פעמים g ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים במדיה מלאה לריכוז סופי של לפחות 70,000 תאים לכל 40 מיקרוליטרים. זרעים 40 microliters של ההשעיה תא זה לתוך הבארים של צלחת מצופה 8 בארות הקפדה להשאיר את כל בארות הפינה ריקות. צנטריפוגה הצלחת ב 450 פעמים g ו בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת.השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח שהתאים מחוברים לתחתית בארות. לאחר מכן, להוסיף 135 microliters של מדיה מלאה לתאים בכל באר להביא את הנפח הסופי של כל באר ל 175 microliters. הוסף 175 מיקרוליטרים של מדיה מלאה לשתי הפינות של הלוח כריק.דגירה התאים באינקובטור שאינו CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן הגדר תוכנית עבור המנתח כדי להוסיף תרופות לכל באר של הלוח כפי שמתואר בטבלה 2 וטבלה שלוש של פרוטוקול הטקסט. לבדיקת הלחץ המיטוכונדריאלי, אחזר את מחסנית החיישן בצלחת השירות מהחמה כך שלכל באר יש ריכוז סופי של שני אוליגומיצין מיקרומולרי, 1.5 מיקרומולרי FCCP ו- 0.5 מיקרומולר של רוטנונה ואנטי מיצין A לפי הצורך.הסר את המכסה ממחסנית החיישן והצב אותו על מגש המכשיר. התחל את תהליך הכיול שייקח 20 דקות. לאחר השלמת הכיול, הסר את לוחית השירות והחליף אותה בצלחת ההתקלה המכילה את תאי LSK.לחץ על המשך כדי להפעיל את התוכנית הקודמת שנקבעה. לאחר השלמת התוכנית, אחזר את הנתונים ונתח אותם. במחקר זה, כמות מקסימלית של HSPCs LSK מורין קיימא מבודדים חילוף החומרים גליקוליזה המיטוכונדריאלי שלהם נמדד עם מנתח שטף חוץ תאיים.למרות ניתוח שטף חוץ תאי משמש באופן מסורתי עבור תאים חסידים, שיטה זו עושה LSK HSPCs דבק בארות מצופה PLL המאפשר מדידה של שטף חוץ תאי ובכך בריאות מטבולית של LSK HSPCs. על מנת למדוד את הנשימה המיטוכונדרית באמצעות קצב צריכת החמצן וגליקוליזה באמצעות שיעור החומציות החוץ תאית בתנאי בסיס ומתח, תרופות המפריעות לגליקוליזה ולנשימה מיטוכונדרית מוזרקים ברצף. כצפוי, הרמה הבסיסית של שיעור החומציות החוץ-תאית גבוהה יותר עבור LSK HSPCs בתרבות של גלוקוז ופירובט מדיה חיובית בהשוואה לאלה שתורבת במדיה שלילית.הזריקה עם גלוקוז לא לשנות את שיעור חומציות חוץ תאית עבור התאים מתורבתים בתקשורת חיובית, אבל זה הגביר את גליקוליזה של תאים במדיה שלילית. עם זאת, הרמה הבסיסית של תאים אלה עדיין נותרה נמוכה יותר בקבוצה החיובית. הזריקה עם אוליגומיצין הפעילה את הגליקוליסיס ברמתו המרבית בקבוצה החיובית, אך לא השפיעה על הקבוצה השלילית.ההזרקה עם אנלוגי הגלוקוז ב-2-DG החזירה את קצב החומציות החוץ-תאי לרמות שאינן גליקוליטיות. לבדיקת הלחץ המיטוכונדריאלי, הזריקה של אוליגומיצין היפרפולרית הממברנה המיטוכונדרית מונעת שאיבת פרוטון יותר דרך קומפלקסים ETC ובכך להפחית את קצב הנשימה המיטוכונדרית. הזרקת FCCP דוחפת את שיעור צריכת החמצן למקסימום כאשר תאים מנסים לשחזר את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית.הזריקה עם שני מעכבי שרשרת הובלת אלקטרונים אחרים גורמת לנשימה המיטוכונדרית להפסיק לחלוטין ובכך קצב צריכת החמצן חזר לרמתו המינימלית. נא הימנע משימוש במאגר תותים של תא אדום לבידוד התא המונונוקליארי. אנו ממליצים על הפרדת מעבר צבע Ficoll כדי למנוע היווצרות גוש ולהפחית את אובדן LSK.באמצעות השיטה האופטימלית שלנו, אנו יכולים למדוד נשימה מיטוכונדרית וגליקוליזה של גזע hematopoietic נדיר ושברירי ותאי הצאצאים וחקר רמזים מטבוליים לווסת hematopoiesis נורמלי וממאאיר.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

גזירה של תאי לב ותאים מתאי גזע עובריים

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

ייזום בידול בתאי multipotent otic אב הונצחו

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1<sup&gt; גבוה</sup&gt; בתאי גזע שמקורם שומן (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע Hematopoietic

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

ניתוח אלקטרופיזי של האדם Pluripotent גזע גזע נגזר Cardiomyocytes (hPSC-CMs) באמצעות מערכים אלקטרודה רב (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

זיהוי של התורם שיורית Erythroid ובתאים לאחר השתלת תא גזע Hematopoietic עבור חולים עם פתולוגיות של המוגלובין

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

התפתחות במבחנה הנועד Quantitate גזע Hematopoietic, קדמון תאים (HSPCs) בפיתוח עוברי דג זברה

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...