Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (HL131645, CA016058), सेंट बाल्ड्रिक फाउंडेशन और पेलोतोनिया फाउंडेशन से धन समर्थन द्वारा समर्थित भाग में है ।

इस प्रोटोकॉल को राष्ट्रव्यापी बाल अस्पताल पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
नोट: प्रोटोकॉल कालक्रम में वर्णित है जो दो दिनों की अवधि में फैला है। नीच?...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. 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N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. 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यहां, हम शुद्ध और व्यवहार्य मूत्र एलएसके एचएसपीसी आबादी की अधिकतम मात्रा के अलगाव के साथ-साथ एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक के साथ उनके ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की माप को प्रदर्शित करते हैं।...

चूंकि सबसे परिपक्व रक्त कोशिकाओं की उम्र कम है, रक्त की होमोस्टेसिस हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएसपीसी)1की लंबे समय तक रहने वाली लेकिन दुर्लभ आबादी के आत्म-नवीकरण और भेदभाव पर निर्भर करती है। एचएसपीसी शांत हैं, लेकिन वे रक्त प्रणाली की मांगों को बनाए रखने के लिए उत्तेजना पर भेदभाव पैदा करने और भेदभाव से गुजरने के लिए जल्दी कर रहे हैं । प्रत्येक एचएसपीसी सेलुलर राज्य के रूप में एक अद्वितीय जैव ऊर्जावान मांग की आवश्यकता है, चयापचय परिवर्तन एचएसपीसी भाग्य निर्णय के प्रमुख ड्राइवर हैं । इसलिए, मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी का नुकसान, एचएसपीसी के संतुलन, आत्म-नवीकरण और भेदभाव के बीच संतुलन में फेरबदल करके, अक्सर माइलो-या लिम्फो-प्रोलिफेरेटिव विकारों की ओर जाता है। साथ में, एचएसपीसी विकास के मेटाबोलिक विनियमनकी समझ2,3,4,5अंतर्निहित तंत्र को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है।
माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस इंट्रासेलुलर प्रतिक्रियाओं को चलाने और मैक्रोमॉलिक्यूल सिंथेसिस के लिए आवश्यक इमारत ब्लॉकों का उत्पादन करने के लिए एटीपी उत्पन्न करते हैं। चूंकि एचएसपीसी में विभेदित कोशिकाओंकी तुलना में कम माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान होता है और वे हाइपोक्सिक बोन मैरो निकस में quiescence बनाए रखते हैं, इसलिए एचसीपीसी मुख्य रूप से ग्लाइकोलिसिस पर भरोसा करते हैं। एचएसपीसी की सक्रियता उनके माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म को बढ़ाती है जो quiescence की हानि और सेल चक्र में उनके बाद प्रवेश की ओर जाता है। एचएसपीसी की ऐसी मेटाबॉलिक प्लास्टिसिटी एचएसपीसी पूल को वयस्क जीवन6,7, 8 ,9,10,11,12में बनाए रखने की अनुमति देती है . इसलिए, एचएसपीसी सक्रियण और स्वास्थ्य स्थिति का विश्लेषण करने के लिए ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर; ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलाइजेशन का सूचकांक) और एक्स्सेल्युलर एसिडिफिकेशन रेट (ईसीएआर; ग्लाइकोलिसिस का सूचकांक) जैसी उनकी मेटाबोलिक गतिविधियों की जांच करना महत्वपूर्ण है । ओसीआर और ईएआर दोनों को एक अतिरिक्त प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके वास्तविक समय में एक साथ मापा जा सकता है। हालांकि, वर्तमान विधि को बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है और13अनुयायी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जाता है। चूंकि HSPCs चूहों14से बड़ी मात्रा में अलग नहीं किया जा सकता है, एक शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए छंटाई की आवश्यकता है, गैर अनुयायी कोशिकाओं15हैं, और16विभेदन से बचने के बिना रातोंरात सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है, यह OCR और HSPCs के ECAR को मापने के लिए मुश्किल हो गया है । यहां, हम वीडियो-आधारित ट्यूटोरियल के साथ कुछ हजारों मूत्र अस्थि मज्जा-वंशनेगस्का1+सी-किट+ (एलएसके) एचसीपीसी को मापने के तरीके पर स्पष्ट, कदम-दर-कदम निर्देश ों का एक सेट प्रदान करते हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

हेमेटोपोइटिक स्टेम जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) में अलग मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी होती है, जो उन्हें रक्त गठन की मांगों को बनाए रखने के लिए अपने शांत राज्य से एक भेदभाव राज्य में संक्रमण करने की अनुमति देती है। हालांकि, एचएसपीसी की मेटाबोलिक स्थिति (माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस) का विश्लेषण करना मुश्किल रहा है क्योंकि उनकी सीमित संख्या और गैर-अनुयायी, नाजुक एचएसपीसी के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल की कमी है। यहां, हम मेटाबोलिक श्वसन (ऑक्सीजन की खपत दर) को मापने के लिए स्पष्ट, कदम-दर-कदम निर्देशों का एक सेट प्रदान करते हैं; ओसीआर) और ग्लाइकोलाइसिस (एक्स्सेल्युलर एसिडिफिकेशन रेट; मूत्र अस्थि मज्जा-वंशनेगSca1+सी-किट+ (एलएसके) एचएसपीसी का ECAR। यह प्रोटोकॉल मूत्र अस्थि मज्जा से एलएसके एचएसपीसी की अधिक मात्रा प्रदान करता है, ऊष्मायन के दौरान एचसीपीसी की व्यवहार्यता में सुधार करता है, गैर-अनुयायी एचएसपीसी के बाह्य प्रवाह विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है, और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन और ग्लाइकोलिटिक रास्तों को लक्षित करने वाली दवाओं के लिए अनुकूलित इंजेक्शन प्रोटोकॉल (एकाग्रता और समय) प्रदान करता है। यह विधि रक्त विकास और बीमारियों के दौरान मेटाबोलिक स्थिति और एचएसपीसी के स्वास्थ्य की भविष्यवाणी को सक्षम बनाती है।

हमारी निष्कर्षण विधि ने हमें प्रति माउस ~ 80,000 एलएसके एचएसपीसी तक फसल करने की अनुमति दी। व्यवहार्यता और LSK कोशिकाओं की संख्या हमारी विधि के साथ सुधार किया गया, क्योंकि हम: (1) ऊपरी और निचले अंगों, कूल्हे की हड...

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Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

रक्त गठन के दौरान मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी के कारण एक शांत राज्य से एक भेदभाव राज्य में हेमेटोपोइटिक स्टेम जनक कोशिकाएं (एचएसपीसी) संक्रमण। यहां, हम एचएसपीसी के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस को मापने के लिए एक अनुकूलित विधि प्रस्तुत करते हैं।

हेमेटोपोइटिक स्टेम प्रोजेनिटर सेल मेटाबोलिज्म का विश्लेषण

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से कार्डिएक पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की व्युत्पत्ति

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

परिधीय रक्त Hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यक्ष प्रेरण

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

अमर multipotent Otic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में भेदभाव की शुरुआत

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

वसा डिपो विशेष Sca1 की immunomagnetic पृथक्करण<sup&gt; उच्च</sup&gt; वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

प्रतियोगी प्रत्यारोपण hematopoietic स्टेम सेल स्वास्थ्य मूल्यांकन करने के लिए

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल से आदिम और निश्चित टेम Progenitors के विभेद का निर्देशन

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

मल्टी-इलेक्ट्रोड एरेज़ (एमईए) का उपयोग कर मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायॉसाइट्स (एचपीएससी-सीएमएस) का इलेक्ट्रोफिजिकल विश्लेषण

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

Hemoglobinopathies के साथ रोगियों के लिए टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण के बाद अवशिष्ट दाता Erythroid जनक कोशिकाओं का पता लगाने

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

मात्रात्मक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस भ्रूण में कार्डियक जनक आबादी का विश्लेषण

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

एक इन विट्रो परख के विकास के लिए Quantitate टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) Zebrafish भ्रूण के विकास में

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...