Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Questo lavoro è in parte supportato dal sostegno finanziatorio dei National Institutes of Health (HL131645, CA016058), dalla Fondazione St. Baldrick e dalla Pelotonia Foundation.

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato nazionale per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale pediatrico (IACUC).
 NOT:</</c0> Il protocollo è descritto in ordine cronologico che si estende per il periodo di due giorni. Utilizzare nuovi reagenti come descritto nel protocollo riportato di seguito.
1. Preparazione del reagenti il giorno precedente al test
<ol><li>
Idratare la cartuccia del sensore.
	<ol>
<li>Incubare ...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

Qui, dimostriamo l'isolamento di una quantità massima di popolazione di HSPC murini murini puro e vitale, nonché la misurazione della loro glicolisi e della respirazione mitocondriale con un analizzatore di flusso extracellulare. In particolare, il protocollo supera i seguenti problemi tecnici per l'uso di HSPC LSK : i) la bassa frequenza degli HSPC LSK nel midollo osseo murino14, ii) bassa attività metabolica basale di LSK HSPCs26, iii) la fragilità di LSK HSPCs<sup cl...

Poiché la durata della vita della maggior parte delle cellule del sangue mature è breve, l'omeostasi del sangue si basa sull'auto-rinnovamento e la differenziazione di una popolazione longeva ma rara di cellule staminali ematopoietiche (HSPN)1. Gli HSPC sono quiescenti, ma sono pronti a proliferare e a subire differenziazione sulla stimolazione per sostenere le esigenze del sistema sanguigno. Poiché ogni stato cellulare HSPC richiede una domanda bioenergetica unica, i cambiamenti metabolici sono i fattori chiave delle decisioni del destino HSPC. Pertanto, la perdita di plasticità metabolica, alterando l'equilibrio tra quiescenza, auto-rinnovamento e differenziazione degli HPG, porta spesso a disturbi mielo- o linfo-proliferativi. Insieme, la comprensione della regolazione metabolica dello sviluppo HSPC è fondamentale per scoprire i meccanismi alla base delle neoplasie ematologiche2,3,4,5.
La respirazione mitocondriale e la glicolisi generano ATP per guidare reazioni intracellulari e produrre gli elementi costitutivi necessari per la sintesi delle macromolecole. Poiché gli HSPC hanno una bassa massa mitocondriale rispetto alle cellule differenziate6 e sostengono la quiescenza nelle nicchie ipossiche del midollo osseo, gli HSPC si basano principalmente sulla glicolisi. L'attivazione di HSPC migliora il loro metabolismo mitocondriale che porta alla perdita di quiescenza e la loro successiva immissione nel ciclo cellulare. Tale plasticità metabolica degli HSPN consente la manutenzione del pool HSPC per tutta la vita adulta6,7,8,9,10,11,12. Pertanto, è fondamentale studiare le loro attività metaboliche, come il tasso di consumo di ossigeno (OCR; indice di fosforo ossidativo) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR; indice della glicolisi) per analizzare l'attivazione di HSPC e lo stato di salute. Sia l'OCR che l'ECAR possono essere misurati simultaneamente, in tempo reale, utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Tuttavia, il metodo corrente richiede un numero elevato di celle ed è ottimizzato per le celle aderenti13. Poiché gli HSPC non possono essere isolati in grandi quantità dai topi14, richiedono lo smistamento per ottenere una popolazione pura, sono cellule non aderenti15e non possono essere coltivate durante la notte senza evitare la differenziazione16, è stato difficile misurare l'OCR e l'ECAR degli HSPC. Qui, forniamo una serie di chiare istruzioni passo-passo per accompagnare video-based tutorial su come misurare la respirazione metabolica e la glicolisi di poche migliaia di murine osso midollo-LineagenegSca1-c-Kit(LSK) HSPC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) hanno una plasticità metabolica distinta, che permette loro di passare dal loro stato quiescente a uno stato di differenziazione per sostenere le richieste della formazione del sangue. Tuttavia, è stato difficile analizzare lo stato metabolico (respirazione mitocondriale e glicolisi) degli HSPC a causa del loro numero limitato e della mancanza di protocolli ottimizzati per HSPC fragili e non aderenti. Qui, forniamo una serie di chiare istruzioni passo-passo per misurare la respirazione metabolica (tasso di consumo di ossigeno; OCR) e glicolisi (tasso di acidificazione extracellulare; ECAR) di HSPC di midollo osseo murino-Lingo Questo protocollo fornisce una maggiore quantità di HSPC LSK dal midollo osseo murino, migliora la vitalità degli HSPC durante l'incubazione, facilita l'analisi del flusso extracellulare di HSPC non aderenti e fornisce protocolli di iniezione ottimizzati (concentrazione e tempo) per i farmaci che prendono di mira il fosforolazione ossidativa e le vie glicolytiche. Questo metodo consente la previsione dello stato metabolico e della salute degli HPC durante lo sviluppo del sangue e le malattie.

Il nostro metodo di estrazione ci ha permesso di raccogliere fino a 80.000 HSPC LSK per mouse. La vitalità e il numero di cellule LSK sono stati migliorati con il nostro metodo, perché noi: (1) combinato midollo osseo da arti superiori e inferiori, ossa dell'anca, sterno, gabbia toracica, e la colonna vertebrale, (2) evitato utilizzando buffer di lisi a cellule rosse che avrebbe aumentato la morte delle cellule e l'agglomeramento, (3) utilizzato il gradiente di densità media separazione delle cellule mono-nucleate, e ...

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Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) passano da uno stato quiescente a uno stato di differenziazione a causa della loro plasticità metabolica durante la formazione del sangue. Qui, presentiamo un metodo ottimizzato per misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi degli HSPC.

Analisi del metabolismo delle cellule staminali ematopoietiche

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

I cambiamenti metabolici nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici consentono loro di passare dal loro stato quiescente a uno stato di differenziazione per sostenere le richieste di formazione del sangue. L'alterazione della plasticità metabolica delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici porta a disturbi ematologici. Il nostro protocollo aiuterà a misurare la regolazione metabolica e la salute delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici durante lo sviluppo del sangue e le malattie.L'analisi della respirazione mitocondriale e della glicolisi delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici è difficile in quanto sono popolazione fragile e rara. Il nostro protocollo ottimizzato consente l'isolamento di una maggiore quantità di cellule staminali ematopoietiche e progenitrici dal midollo osseo murino, migliora la loro vitalità durante l'incubazione, facilita l'analisi del flusso extracellulare di HSPC non aderenti e fornisce parametri di iniezione ottimizzati per il farmaco che mira alla fosforilazione ossidativa e alle vie glicolitiche. Per iniziare questa procedura, riempire i pozzi della piastra di utilità e le camere intorno ai pozzi con acqua sterile.Immergere la cartuccia del sensore nella piastra di utilità assicurandosi che i sensori siano completamente coperti dall'acqua. Quindi posizionare la cartuccia immersa nella piastra di utilità in un incubatore non di CO2 a 37 gradi Celsius per incubare durante la notte. In un armadio di biosicurezza di classe II, aggiungere 40 microlitri di soluzione 0,1%PLL disponibile in commercio a ciascun pozzo della piastra di dosaggio.Coprire la piastra di dosaggio con il coperchio fornito nel kit e incubare la piastra chiusa a temperatura ambiente sotto il cofano per un'ora. Successivamente, utilizzare un aspiratore sterile a base di vuoto per rimuovere la soluzione in eccesso e asciugare ad aria la piastra sotto il cofano. Per raccogliere cellule di midollo osseo murino mononucleate, aggiungere cinque millilitri di gradiente di densità medio a un tubo conico da 15 millilitri.Aggiungere lentamente cinque millilitri della sospensione cellulare del midollo osseo assicurandosi che le cellule rimangano come uno strato al di sopra del mezzo gradiente di densità. Centrifugare a 500 volte g e a temperatura ambiente per 30 minuti assicurandosi che la centrifuga sia alla più bassa accelerazione possibile. Raccogliere l'interfaccia centrale delle cellule mononucleate in un tubo fresco da 15 millilitri.Quindi lavare le celle con cinque millilitri di 1X PBS contenenti 2%FBS. Centrifuga a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare le celle in 300 microlitri di 1X PBS contenenti 2%FBS.Successivamente, aliquote 10 microlitri della sospensione cellulare per il controllo non macchiato o monocolore in un tubo FACS. Per raccogliere HSPC LSK da cellule del midollo osseo murino mononucleate, aggiungere 15 microlitri di cocktail anticorpale di biotina a 300 microlitri di cellule mononucleate del midollo osseo. Per raccogliere HSPC LSK da cellule del midollo osseo murino mononucleate, aggiungere 15 microlitri di cocktail anticorpale di biotina a 300 microlitri di cellule mononucleate del midollo osseo.Posizionare i tubi in un secchio di ghiaccio posizionato su uno shaker in frigorifero per incubare a quattro gradi Celsius con agitazione per 30 minuti. Quindi aggiungere 10 millilitri di PBS 1X prerimente refrigerato contenente 2%FBS alle celle. Centrifuga a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 400 microlitri di 1X PBS contenenti 2%FBS. Vortice brevemente le microperline anti-biotina prima dell'uso. Aggiungere 80 microlitri delle microperline a ciascun campione e mescolare bene.Incubare per altri 20 minuti a quattro gradi Celsius con agitazione. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di PBS pre-refrigerato contenenti 2%FBS alle celle. Centrifugare il tubo a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un millilitro di PBS contenente il 2%FBS. Conservare la sospensione cellulare a quattro gradi Celsius durante la configurazione dell'unità di separazione magnetica. Posizionare la colonna in un campo magnetico per il separatore di smistamento delle celle assistite magnetiche a quattro gradi Celsius.Preparare la colonna per la separazione magnetica risciacquarla con tre millilitri di 1X PBS contenenti 2%FBS sotto flusso di gravità a quattro gradi Celsius. Aggiungere la sospensione cellulare alla colonna pre-bagnata a quattro gradi Celsius. Lasciare passare tutte le cellule attraverso la colonna a quattro gradi Celsius e raccogliere l'effluente in un tubo conico da 15 millilitri.Quindi, lavare la colonna con tre millilitri di 1X PBS e 2%FBS a quattro gradi Celsius. Ripetere questo lavaggio tre volte. Raccogli il flusso e mantienilo a quattro gradi Celsius.Centrifugare il tubo conico contenente il flusso a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le celle in 0,5 millilitri di 1X PBS con 2%FBS e trasferire la sospensione su un tubo FACS. Quindi aggiungere 24 microlitri del cocktail anticorpale LSK a ogni 10 milioni di cellule.Coprire il tubo con un foglio e incubare al buio a quattro gradi Celsius con agitazione per un'ora. Successivamente, aggiungere tre millilitri di 1X PBS con 2%FBS al tubo FACS. Centrifuga a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Scartare il supernatante e rimescolare le cellule etichettate con anticorpi in un millilitro di 1X PBS contenente 2%FBS. Poco prima dello smistamento, aggiungere un microlitro di un milligrammo per millilitro propidio ioduro alla sospensione cellulare e utilizzare un colino da 40 micrometri per filtrare il contenuto del tubo FACS. In primo luogo, centrifugare le cellule LSK raccolte a 500 volte g e a temperatura ambiente per cinque minuti.Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in mezzi completi ad una concentrazione finale di almeno 70.000 cellule per 40 microlitri. Semina 40 microlitri di questa sospensione cellulare nei pozzi di una piastra a otto pozzatti rivestita in PLL assicurandosi di lasciare tutti i pozzi d'angolo vuoti. Centrifugare la piastra a 450 volte g e a temperatura ambiente per un minuto.Utilizzare un microscopio invertito per assicurarsi che le cellule siano attaccate alla parte inferiore dei pozzi. Successivamente, aggiungere 135 microlitri di supporto completo alle cellule in ogni pozzo portando il volume finale di ogni pozzo a 175 microlitri. Aggiungere 175 microlitri di supporti completi ai due angoli della piastra come spazi vuoti.Incubare le cellule in un incubatore non di CO2 a 37 gradi Celsius per due ore. Quindi impostare un programma per l'analizzatore per aggiungere farmaci a ogni pozzo della piastra come descritto nella tabella due e nella tabella tre del protocollo di testo. Per la prova di stress mitocondriale, recuperare la cartuccia del sensore nella piastra di utilità dall'incubatore in modo tale che ogni pozzo abbia una concentrazione finale di due oligomicina micromolare, 1,5 micromolare FCCP e 0,5 micromolare di rotenone e antimicina A, se necessario.Rimuovere il coperchio dalla cartuccia del sensore e posizionarlo sul vassoio dello strumento. Iniziare il processo di calibrazione che richiederà 20 minuti. Al termine della calibrazione, rimuovere la piastra di utilità e sostituirla con la piastra di dosaggio contenente le celle LSK.Premere continua per avviare il programma impostato in precedenza. Al termine del programma, recuperare i dati e analizzarli. In questo studio, una quantità massima di HSPC LSK murini vitali sono isolati e la loro glicolisi e metabolismo mitocondriale viene misurata con un analizzatore di flusso extracellulare.Sebbene l'analisi del flusso extracellulare sia tradizionalmente utilizzata per le cellule aderenti, questo metodo rende gli HSPC LSK aderenti ai pozzi rivestiti in PLL che consentono la misurazione del flusso extracellulare e quindi la salute metabolica degli HSPC LSK. Al fine di misurare la respirazione mitocondriale attraverso il tasso di consumo di ossigeno e la glicolisi attraverso il tasso di acidificazione extracellulare in condizioni basali e di stress, i farmaci che interferiscono con la glicolisi e la respirazione mitocondriale vengono iniettati in sequenza. Come previsto, il livello basale del tasso di acidificazione extracellulare è più elevato per gli HSPC LSK coltivati in glucosio e piruvati positivi rispetto a quelli coltivati in mezzi negativi.L'iniezione con glucosio non ha cambiato il tasso di acidificazione extracellulare per le cellule coltivate nei mezzi positivi, ma ha aumentato la glicolisi delle cellule in mezzi negativi. Tuttavia, il livello basale di queste cellule è rimasto ancora più basso nel gruppo positivo. L'iniezione con oligomicina ha attivato la glicolisi al suo livello massimo nel gruppo positivo, ma non ha influenzato il gruppo negativo.L'iniezione con l'analogo glucosio a 2-DG ha restituito il tasso di acidificazione extracellulare a livelli non glicolitici. Per la prova di stress mitocondriale, l'iniezione di oligomicina iperpolarizzò la membrana mitocondriale impedendo un maggiore pompaggio di protoni attraverso i complessi ETC e riducendo così il tasso di respirazione mitocondriale. L'iniezione di FCCP spinge il tasso di consumo di ossigeno al massimo mentre le cellule cercano di recuperare il potenziale della membrana mitocondriale.L'iniezione con altri due inibitori della catena di trasporto degli elettroni fa sì che la respirazione mitocondriale si fermi completamente e quindi il tasso di consumo di ossigeno sia tornato al suo livello minimo. Si prega di evitare l'uso di tampone di lisi dei globuli rossi per l'isolamento delle cellule mononucleari. Si consiglia la separazione del gradiente Ficoll per prevenire la formazione di ciuffi e ridurre la perdita di LSK.Utilizzando il nostro metodo ottimizzato, possiamo misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche rare e fragili e lo studio di segnali metabolici regolano l'ematopoiesi normale e maligna.

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