Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

この作品は、国立衛生研究所(HL131645、CA016058)、セントボールドリック財団、ペロトニア財団からの資金援助の一部で支えています。

このプロトコルは、全国小児病院動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
注:プロトコルは、2 日間にわたる時系列で記述されます。以下のプロトコルに記載されているように、新鮮な試薬を使用してください。
1. アッセイ前日の試薬の調製
<ol><li>
センサーカートリッジを水和します。
	<ol>
<li>非CO2 37...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

ここでは、純粋で生存可能なマウスLSK HSPC集団の最大量の単離と、細胞外フラックス分析装置による糖質およびミトコンドリア呼吸の測定を示す。具体的には、このプロトコルは、LSK HSPCの使用に関する以下の技術的課題を克服する: i) マウス骨髄におけるLSK HSPCの低周波14, ii) LSK HSPCの低基底代謝活性26, iii) LSK HSPCの脆弱さ27,およびiv) LSK HSP...

ほとんどの成熟した血液細胞の寿命は短いので、血液の恒常性は、造血幹細胞(HSPC)1の長寿命であるが稀な集団の自己再生と分化に依存する。HSPCは静止しているが、血液系の要求を維持するために刺激時に増殖し、分化を受けるのが速い。各HSPC細胞状態は、ユニークな生物エネルギー需要を必要とするので、代謝の変化は、HSPC運命の決定の主要な要因です。したがって、代謝可塑性の喪失は、静止、自己再生、およびHSPCの分化との間の平衡を変化させることによって、しばしば骨髄またはリンパ増殖性障害を引き起ぐ。HSPC開発の代謝調節の理解は、血液悪性腫瘍2、3、4、5の基礎となるメカニズムを明らかにするために重要である。
ミトコンドリア呼吸と糖状化は、細胞内反応を駆動し、高分子合成に必要なビルディングブロックを生成するためにATPを生成します。HSPCは分化細胞6に比べてミトコンドリア質量が低く、低酸素骨髄ニッチで静止を持続するため、HSPCは主に糖質に依存しています。HSPCの活性化は、静止の損失とその後の細胞周期への入り口につながるミトコンドリア代謝を高めます.このようなHSPCの代謝可塑性は、成人生活6、7、8、9、10、11、12を通じてHSPCプールの維持を可能にする。したがって、酸素消費量(OCR、酸化リン酸化指数)や細胞外酸性化率(ECAR;糖系の指標)などの代謝活性を調べて、HSPC活性化と健康状態を分析することが重要です。OCRとECARの両方を、細胞外フラックスアナライザを使用して、リアルタイムで同時に測定できます。しかしながら、現在の方法は多数の細胞を必要とし、付着細胞13に最適化されている。HSPCはマウス14から大量に単離することができず、純粋な集団を得るためにソートを必要とし、非付着細胞15であり、かつ分化16を避けずに一晩培養することができないので、HSCのOCRおよびECARを測定することは困難であった。ここでは、数千のマウス骨髄-リネージュネグSca1+(LSK)HSPCの数千人のマウス骨髄-リネージネグの代謝呼吸と糖解症を測定する方法に関するビデオベースのチュートリアルに付随する明確な、ステップバイステップの手順のセットを提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

造血幹細胞(HSPC)は、異なる代謝可塑性を有し、血液形成の要求を維持するために静止状態から分化状態に移行することを可能にする。しかし、HSPCの代謝状態(ミトコンドリア呼吸と糖直症)の分析は、非付着性の脆弱なHSPCに対する最適化されたプロトコルの数が限られており、分析することは困難でした。ここでは、代謝呼吸(酸素消費量率)を測定するための明確な、ステップバイステップの指示のセットを提供します。OCR)および糖上昇(細胞外酸性化率;ECAR)のマウス骨髄系統性スカ1+cキット+(LSK)HSPC。このプロトコルは、マウス骨髄からより多くのLSK HSPCを提供し、インキュベーション中のHSPCの生存率を向上させ、非付着性HSPCの細胞外フラックス分析を促進し、酸化リン酸化および糖分解経路を標的とする薬物に最適化された注入プロトコル(濃度および時間)を提供します。この方法は、血液の発達および疾患の間にHSPCの代謝状態および健康の予測を可能にする。

私たちの抽出方法は、マウスあたり約80,000 LSK HSPCを収穫することができました。LSK細胞の生存率と数は、(1)上肢と下肢、股関節骨、胸骨、肋骨ケージ、脊椎の骨髄を組み合わせたもので、(2)細胞死と凝集を増加させる赤い細胞リシス緩衝液の使用を避けたため、我々の方法で改善された(3)単一有核細胞の密度勾配培地分離を用い、(4)塊の細胞の損失を引き起こすであろう事前冷却緩衝液を使?...

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Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

造血幹細胞(HSPC)は、血液形成中の代謝可塑性による静止状態から分化状態に移行します。ここでは、HSPCのミトコンドリア呼吸と糖状化を測定するための最適化された方法を提示する。

造血幹細胞細胞代謝の解析

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

造血幹細胞および前駆細胞の代謝変化は、血液形成の要求を維持するために静止状態から分化状態に移行することを可能にする。造血幹細胞や前駆細胞の代謝可塑性の変化は、血液疾患につながります。私たちのプロトコルは、血液の発達と病気の間に代謝調節と造血幹細胞および前駆細胞の健康を測定するのに役立ちます。造血幹細胞や前駆細胞のミトコンドリア呼吸と解糖の解析は、脆弱で稀な集団であるため困難です。当社の最適化されたプロトコルにより、マウス骨髄からより多くの造血幹細胞および前駆細胞を単離し、インキュベーション中の生存率を向上させ、非接着性HSpcsの細胞外フラックス分析を促進し、酸化リン酸化と解糖経路を標的とする薬物に最適化された注射パラメータを提供します。この手順を開始するには、ユーティリティプレートの井戸とウェルの周りの部屋に無菌水を充填します。センサーカートリッジをユーティリティプレートに差し込み、センサーが完全に水で覆われていることを確認します。その後、カートリッジを非CO2インキュベーターの37°Cでユーティリティプレートに沈め、一晩インキュベートします。クラスIIバイオセーフティキャビネットでは、アッセイプレートの各ウェルに市販の0.1%PLL溶液を40マイクロリットル加えます。キットに用意されている蓋でアッセイプレートを覆い、ボンネット下の室温で閉じたプレートを1時間インキュベートします。この後、無菌真空系アスピレーターを使用して余分な溶液を除去し、ボンネットの下でプレートを乾燥させます。単核マウス骨髄細胞を収穫するには、密度勾配培地を5ミリリットルの円錐チューブに加える。ゆっくりと5ミリリットルの骨髄細胞懸濁液を加え、細胞が密度勾配培地の上の層として残っていることを確認します。500倍gの遠心分離機と室温で30分間、遠心分離機が可能な限り低い加速度であることを確認します。単核細胞の中間界面を新鮮な15ミリリットルのチューブに収穫する。その後、2%FBSを含む1X PBSの5ミリリットルで細胞を洗浄します。500倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。上清を取り除き、2%FBSを含む1X PBSの300マイクロリットルで細胞を再懸濁します。次に、FACSチューブ内の染色されていないまたは単色のコントロールのための細胞懸濁液のアリコート10マイクロリットル。単核マウス骨髄細胞からLSK HSPCsを収穫するには、15マイクロリットルのビオチン抗体カクテルを100マイクロリットルの単核骨髄細胞に加える。単核マウス骨髄細胞からLSK HSPCsを収穫するには、15マイクロリットルのビオチン抗体カクテルを100マイクロリットルの単核骨髄細胞に加える。冷蔵庫のシェーカーに置いたアイスバケツにチューブを入れ、30分間攪拌して摂氏4度でインキュベートします。その後、細胞に2%FBSを含む1X PBSの10ミリリットルを加えます。500倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。上清を捨て、2%FBSを含む1X PBSの400マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁する。使用前に抗ビオチンマイクロビーズを簡単に渦を起たむ。各サンプルにマイクロビーズの80マイクロリットルを加え、よく混ぜます。攪拌で摂氏4度でさらに20分間インキュベートします。この後、細胞に2%FBSを含む10ミリリットルの冷蔵PBSを加えます。チューブを500倍g、摂氏4度で5分間遠心します。上清を捨て、2%FBSを含むPBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。磁気分離装置を設置しながら、セルサスペンションを摂氏4度で保存します。磁気アシストセルソートセパレータの磁場にカラムを摂氏4度で配置します。2%FBSを含む1X PBSの3ミリリットルを摂氏4度で重力流でリンスして、磁気分離のためのカラムを準備します。セルサスペンションを4°Cのプレウェットカラムに加えます。すべての細胞が摂氏4度でカラムを通過し、15ミリリットルの円錐管に排水を集めます。次に、1X PBSの3ミリリットルと摂氏4度で2%FBSでカラムを洗います。この洗浄を3回繰り返します。流れを収集し、摂氏4度に保ちます。500倍gで流れを含む円錐管を5分間摂氏4度で遠心分離する。上清を捨て、2%FBSで1X PBSの0.5ミリリットルで細胞を再懸濁し、FACSチューブに懸濁液を移します。その後、各1000万個の細胞にLSK抗体カクテルの24マイクロリットルを加えます。ホイルでチューブを覆い、1時間攪拌で摂氏4度で暗闇の中でインキュベートします。この後、FACSチューブに2%FBSの1X PBSを3ミリリットル加えます。500倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。上清を捨て、2%FBSを含む1X PBSの1ミリリットルで抗体標識細胞を再懸濁する。仕分け直前に、1ミリリットルのヨウ化プロピジウム1ミリグラムを1マイクロリットルを細胞懸濁液に加え、40マイクロメートルのストレーナーを使用してFACSチューブの内容物をフィルタリングします。まず、収集したLSK細胞を500倍gで、室温で5分間遠心する。上清を捨て、完全な培地中の細胞を40マイクロリットル当たり少なくとも70,000個の細胞の最終濃度まで再懸濁する。この細胞懸濁液の種子40マイクロリットルは、PLLコーティングされた8ウェルプレートの井戸に入り、すべてのコーナーウェルを空のままにします。プレートを450倍g、室温で1分間遠心します。逆顕微鏡を使用して、細胞がウェルの底に取り付けられていることを確認します。この後、各ウェルの細胞に完全な培地の135マイクロリットルを加え、各ウェルの最終体積を175マイクロリットルにします。プレートの2つのコーナーに175マイクロリットルの完全なメディアをブランクとして追加します。37°Cで非CO2インキュベーターに細胞を2時間インキュベートします。次に、テキストプロトコルの表2と表3に概説されているように、プレートの各ウェルに薬物を追加するアナライザー用のプログラムを設定します。ミトコンドリア応力試験では、各ウェルが2つのマイクロモルオリゴマイシン、1.5マイクロモルFCCP、および必要に応じてロテロンと抗ミシンAの0.5マイクロモルの最終濃度を有するように、インキュベーターからユーティリティプレート内のセンサーカートリッジを取り出します。センサーカートリッジから蓋を取り出し、計器トレイに置きます。20分かかるキャリブレーションプロセスを開始します。キャリブレーションが完了したら、ユーティリティプレートを取り外し、LSK細胞を含むアッセイプレートに置き換えます。前に設定したプログラムを開始するには、続行を押します。プログラムが完了したら、データを取得して分析します。本研究では、生存可能なマウスLSK HSPの最大量を単離し、その解糖およびミトコンドリア代謝を細胞外フラックス分析装置で測定した。細胞外フラックス解析は従来、接着細胞に使用されていますが、この方法では、LSK HSPCsをPLLコーティングされたウェルに接着させ、細胞外フラックスの測定とLSK HSPCsの代謝の健康を可能にします。基底およびストレス条件下での細胞外酸性化率を介した酸素消費率と解糖によるミトコンドリア呼吸を測定するために、解糖およびミトコンドリア呼吸を妨害する薬剤を順次注入する。予想通り、細胞外酸性化率の基底レベルは、負の培地で培養されたものと比較してグルコースおよびピルビン酸陽性培地で培養されたLSK HSPCsに対して高い。グルコースによる注射は、陽性培地で培養された細胞の細胞外酸性化速度を変化させなかったが、陰性培地中の細胞の解糖を高めた。しかし、これらの細胞の基底レベルは依然として陽性群において低いままであった。オリゴマイシンによる注射は、陽性群の最大レベルで解糖を活性化したが、陰性基には影響しなかった。2-DGでグルコースアナログを用いた注入は、非解糖レベルに細胞外酸性化率を戻した。ミトコンドリアストレス試験では、オリゴマイシンの注入により、ミトコンドリア膜がETC複合体を通るプロトンのポンピングを防止し、ミトコンドリア呼吸の速度を低下させる。FCCPの注入は細胞がミトコンドリア膜電位を回復しようとするので酸素消費率を最大限に押し出す。他の2つの電子輸送鎖阻害剤による注入は、ミトコンドリア呼吸を完全に停止させ、酸素消費率を最小レベルに戻す原因となる。単核細胞分離のために赤い細胞のリシスバッファーを使用しないでください。束の形成を防ぎ、LSKの損失を減らすために、Ficoll勾配分離をお勧めします。最適化された方法を用いて、希少で壊れやすい造血幹細胞および前駆細胞のミトコンドリア呼吸と解糖を測定し、代謝キューの研究は正常および悪性造血を調節することができます。

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

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末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

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Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

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脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離<sup&gt;高</sup&gt;脂肪由来幹細胞（ASCに）

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

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Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

多電極アレイ（MEA）を用いたヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（hPSC-CM）の電気生理学的解析

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ初期胚細胞 (HSPCs) を造血幹・前駆細胞の量的にIn Vitroアッセイの開発

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...