Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

이 작품은 부분적으로 국립 보건원 (HL131645, CA016058), 세인트 볼드릭 재단 및 펠로토니아 재단의 자금 지원에 의해 지원됩니다.

이 프로토콜은 전국 어린이 병원 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 프로토콜은 2 일의 기간에 걸쳐 연대순으로 설명된다. 아래 프로토콜에 설명된 대로 신선한 시약을 사용하십시오.
1. 분석 전날 시약 준비
<ol><li>
센서 카트리지에 수분을 공급합니다.
	<ol>
<li>비CO2 37°C 인큐베이터에서 교정제...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

여기에서, 우리는 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 순수하고 실행 가능한 뮤린 LSK HSPC 집단의 최대 양뿐만 아니라 그들의 당해 및 미토콘드리아 호흡의 측정의 격리를 보여줍니다. 구체적으로, 이 프로토콜은 LSK HSPC의 사용에 대한 다음과 같은 기술적 문제를 극복한다 : i) murine 골수14에서LSK HSPC의 낮은 빈도, ii) LSK HSPC26의낮은 기저 대사 활성, iii) LSK HSPC<sup class...

대부분의 성숙한 혈액 세포의 수명이 짧기 때문에, 혈액의 항상성은 조혈 줄기 세포 (HSPC)의 장수하지만 희귀 한 집단의 자기 갱신 및 분화에 의존합니다1. HSPC는 정지, 하지만 그들은 증식 하 고 혈액 시스템의 요구를 유지 하기 위해 자극에 차별화를 겪고 신속. 각 HSPC 세포 상태는 독특한 생체 에너지 수요를 필요로하기 때문에, 신진 대사 변화는 HSPC 운명 결정의 주요 드라이버입니다. 따라서, 대사 가소성의 손실은, 정지, 자기 갱신 및 HSPC의 분화 사이의 평형을 변경함으로써, 종종 골수- 또는 림프증증성 장애로 이어집니다. 함께, HSPC 개발의 대사 조절의 이해는 혈액 학적 악성2,3,4,5의 근본적인 메커니즘을 발견하는 데 중요합니다.
미토콘드리아 호흡과 당해는 ATP를 생성하여 세포내 반응을 유도하고 거대분자 합성에 필요한 빌딩 블록을 생성합니다. HSPC는 분화 된 세포에 비해 낮은 미토콘드리아질량을 가지고 있기 때문에 6 그들은 저산소 골수 틈새 에 정지를 유지, HSPC는 주로 당해에 의존. HSPC의 활성화는 정지의 손실과 세포 주기로의 후속 항목으로 이어지는 미토콘드리아 대사를 향상시킵니다. HSPC의 이러한 대사 가소성은 성인 생활6,7,8,9,10,11,12에 걸쳐 HSPC 풀의 유지 보수를 허용합니다. 따라서, HSPC 활성화 및 건강 상태를 분석하기 위해 산소 소비율(OCR; 산화 인산화 지수) 및 세포외 산성화 율(ECAR; glycolysis 의 지수)과 같은 그들의 대사 활동을 조사하는 것이 중요하다. OCR과 ECAR는 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 실시간으로 동시에 측정할 수 있습니다. 그러나, 현재의 방법은 많은 수의 셀을 필요로 하며 부착셀(13)에최적화되어 있다. HSPC는마우스(14)로부터대량으로 분리될 수 없기 때문에, 순수한 집단을 얻기 위해 선별이 필요하고, 비부착세포(15)이며,분화를피하지 않고 하룻밤 배양될 수 없고, HSP의 OCR 및 ECAR를 측정하는 것이 어려웠다. 여기에서는 수천 개의 뮤린 골수-리니지negSca1+c-Kit+ (LSK) HSPC의 대사 호흡 및 당해 를 측정하는 방법에 대한 비디오 기반 자습서를 동반하는 명확한 단계별 지침 세트를 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC)는 혈액 형성의 요구를 유지하기 위해 그들의 정지 상태에서 분화 상태로 전환 할 수 있습니다 뚜렷한 대사 가소성을 가지고있다. 그러나 HSPC의 대사 상태(미토콘드리아 호흡 및 당해 용해)는 제한된 수와 비부착성, 깨지기 쉬운 HSPC에 대한 최적화된 프로토콜의 부족으로 인해 분석하기가 어려웠습니다. 여기에서, 우리는 신진 대사 호흡을 측정하기 위하여 명확한, 단계별 지침의 세트를 제공합니다 (산소 소비 비율; OCR) 및 당해(세포외 산성화 속도; Murine 골수-리니지negSca1+c-Kit+ (LSK) HSPC의 ECAR) 이 프로토콜은 뮤린 골수에서 LSK HSPC의 높은 양을 제공하고, 배양 중 HSPC의 생존력을 향상시키고, 비 부착 HSPC의 세포 외 플럭스 분석을 용이하게 하며, 산화 인산화 및 당해 경로를 표적으로 하는 약물에 최적화된 주사 프로토콜(농도 및 시간)을 제공합니다. 이 방법은 혈액 발달 및 질병 도중 HSPC의 신진 대사 상태 그리고 건강의 예측가능하게 합니다.

우리의 추출 방법은 우리가 마우스 당 ~ 80,000 LSK HSPC까지 수확 할 수 있었습니다. LSK 세포의 생존력과 수는 우리의 방법으로 향상되었다, 우리는 때문에: (1) 상지와 하부 사지에서 결합 된 골수, 엉덩이 뼈, 흉골, 늑골 케이지, 및 척추, (2) 세포 사멸과 응집 증가 했을 붉은 세포 용해 버퍼를 사용하여 피, (3) 단핵세포의 밀도 구배 배지 분리를 사용하고, (4) 덩어리에서 세포의 손실을 야기했을 사전 ?...

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Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 혈액 형성 동안 그들의 신진 대사 가소성으로 인해 분화 상태로 정지 상태에서 전환. 여기에서는 HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 당화 분석을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

조혈 줄기 선조 세포 대사 분석

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

조혈 줄기와 전구 세포의 대사 변화는 혈액 형성의 요구를 유지하기 위해 그들의 정지 상태에서 분화 상태로 전환 할 수 있습니다. 조혈 줄기와 선조 세포의 대사 가소성에 있는 변경은 혈액학 무질서로 이끌어 냅니다. 우리의 프로토콜은 혈액 발달 과 질병 도중 조혈 줄기 및 전구 세포의 신진 대사 규칙 그리고 건강을 측정하는 것을 도울 것입니다.조혈 줄기 및 전구 세포의 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스의 분석은 연약하고 희소한 인구이기 때문에 어렵습니다. 당사의 최적화된 프로토콜은 골린 골수로부터 더 많은 양의 조혈 줄기 및 전구세포를 분리하고, 잠복 시 생존력을 향상시키고, 비부착 HSPC의 세포외 플럭스 분석을 용이하게 하며, 산화 인산화뿐만 아니라 글리코리스틱 경로를 대상으로 하는 약물에 최적화된 사출 파라미터를 제공합니다. 이 절차를 시작하려면 유틸리티 플레이트의 우물과 우물 주변의 챔버를 멸균 물로 채웁니다.센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 잠그면 센서가 완전히 물로 덮여 있는지 확인합니다. 그런 다음 유틸리티 플레이트에 잠긴 카트리지를 섭씨 37도의 비 CO2 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서, 분석 플레이트의 각 웰에 시판 되는 0.1%PLL 솔루션의 40 마이크로 리터를 추가합니다.키트에 제공된 뚜껑으로 분석 판을 덮고 후드 아래실온도에서 1시간 동안 닫힌 플레이트를 배양합니다. 그 후, 멸균 진공 기반 의 흡인기를 사용하여 과도한 용액을 제거하고 후드 아래 플레이트를 건조시합니다. 단핵골골골수 세포를 수확하려면 밀도 그라데이션 배지 5밀리리터를 15밀리리터 원추형 튜브에 추가합니다.천천히 골수 세포 현탁액의 5 밀리리터를 추가하여 세포가 밀도 그라데이션 배지 위의 층으로 남아 있는지 확인합니다. 원심분리기는 500배 g, 실온에서 30분 동안 원심분리기가 가능한 가장 낮은 가속을 보장합니다. 모노뉴클레아드 세포의 중간 인터페이스를 신선한 15 밀리리터 튜브로 수확하십시오.그런 다음 2 %의 FBS를 포함하는 1X PBS의 5 밀리리터로 세포를 씻으시다. 원심분리기는 500배, 섭씨 4도에서 5분간. 2%의 FBS를 포함하는 1X PBS의 300 마이크로리터에서 상체를 제거하고 세포를 다시 중단합니다.다음으로, FACS 튜브에서 염색되지 않은 또는 단일 색 제어를 위한 세포 현탁액의 10 마이크로리터를 aliquot. 단핵골골골수 세포에서 LSK HSPC를 수확하려면 15마이크로리터의 비오틴 항체 칵테일을 단핵골수 세포의 300마이크로리터에 추가합니다. 단핵골골골수 세포에서 LSK HSPC를 수확하려면 15마이크로리터의 비오틴 항체 칵테일을 단핵골수 세포의 300마이크로리터에 추가합니다.튜브를 냉장고에 셰이커에 놓은 얼음 양동이에 넣고 섭씨 4도에서 30분 동안 교반하여 배양합니다. 그런 다음 세포에 2 %의 FBS를 포함하는 미리 냉각 된 1X PBS의 10 밀리리터를 추가하십시오. 원심분리기는 500배, 섭씨 4도에서 5분간.2%의 FBS를 함유한 1X PBS의 400마이크로리터에서 슈퍼네티티를 폐기하고 세포 펠릿을 재보힙. 사용하기 전에 안티 비오틴 마이크로비드를 간략하게 소용돌이시다. 각 샘플에 마이크로비드 80마이크로리터를 추가하고 잘 섞어보습니다.섭씨 4도에서 20분 간 추가로 배양하여 동요합니다. 그 후, 세포에 2%의 FBS를 포함하는 미리 차가운 PBS의 10 밀리리터를 추가합니다. 원심 분리는 500 배 g와 5 분 동안 섭씨 4도에서 튜브를 원심 분리합니다.상체를 버리고 2 %의 FBS를 포함하는 PBS의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 자기 분리 장치를 설정하는 동안 셀 서스펜션을 섭씨 4도에 보관하십시오. 자기 보조 셀 분류 분리기의 자기장에 열을 섭씨 4도에서 배치합니다.섭씨 4도에서 중력 흐름하에서 2%의 FBS를 함유한 1X PBS 3밀리리터로 헹구어 자기 분리를 위한 컬럼을 준비한다. 셀 서스펜션을 섭씨 4도의 습식 열에 추가합니다. 모든 세포가 섭씨 4도에서 컬럼을 통과하고 15 밀리리터 원원형 튜브에서 유출물을 수집할 수 있도록 합니다.다음으로, 1X PBS의 3밀리리터와 섭씨 4도에서 2%의 FBS로 컬럼을 세척합니다. 이 세척을 세 번 반복합니다. 흐름을 수집하고 섭씨 4도에서 유지합니다.원심 분리는 500 배 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 흐르는 흐름을 포함하는 원심관을 분리합니다. 상체를 버리고 2 %의 FBS로 1X PBS의 0.5 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 서스펜션을 FACS 튜브로 옮기십시오. 그런 다음 LSK 항체 칵테일의 24 마이크로리터를 각 1,000만 개의 세포에 추가합니다.호일로 튜브를 덮고 1 시간 동안 동요와 함께 섭씨 4도에서 어둠 속에서 배양하십시오. 그 후 FACS 튜브에 2%의 FBS를 갖춘 1X PBS 3밀리리터를 추가합니다. 원심분리기는 500배, 섭씨 4도에서 5분간.상체를 폐기하고 2%의 FBS를 포함하는 1X PBS의 1밀리리터에서 항체 표지된 세포를 재중단한다. 정렬 직전에 밀리리터 프로피듐 요오드당 1밀리리터를 세포 현탁액에 넣고 40 마이크로미터 여과기를 사용하여 FACS 튜브의 내용을 필터링합니다. 첫째, 수집된 LSK 세포를 500배 g및 실온에서 5분간 원심분리합니다.상체를 버리고 40 마이크로리터 당 적어도 70, 000 세포의 최종 농도로 전체 매체에서 세포를 재연하십시오. 이 셀 서스펜션의 40 마이크로리터를 PLL 코팅 된 8 웰 플레이트의 우물에 씨앗40 마이크로 리터는 모든 코너 우물을 비워 두십시오. 원심 분리는 450 배 g와 1 분 동안 실온에서 접시를 원심 분리합니다.반전된 현미경을 사용하여 세포가 우물 바닥에 부착되도록 합니다. 그 후, 각 웰의 최종 부피를 175 마이크로리터에 가져오는 각 우물의 세포에 완전한 매체의 135 마이크로리터를 추가합니다. 플레이트의 두 모서리에 175마이크로리터의 완전한 미디어를 공백으로 추가합니다.2 시간 동안 섭씨 37도에서 비 CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하십시오. 그런 다음 분석기가 표 2 및 텍스트 프로토콜의 표 3에 설명된 대로 플레이트의 각 웰에 약물을 추가하는 프로그램을 설정합니다. 미토콘드리아 응력 시험을 위해, 각 웰이 두 개의 마이크로몰라 올리고마이신, 1.5 마이크로몰라 FCCP, 그리고 필요에 따라 로테네및 항 마이신 A의 0.5 마이크로몰라의 최종 농도를 가지도록 인큐베이터로부터 유틸리티 플레이트내의 센서 카트리지를 회수한다.센서 카트리지에서 뚜껑을 분리하여 기기 트레이에 놓습니다. 20분이 소요되는 교정 프로세스를 시작합니다. 교정이 완료되면 유틸리티 플레이트를 제거하고 LSK 셀을 포함하는 분석 플레이트로 대체하십시오.계속 눌러 이전에 설정된 프로그램을 계속 시작합니다. 프로그램이 완료되면 데이터를 검색하고 분석합니다. 이 연구에서는, 실행 가능한 Murine LSK HSPC의 최대 양은 고립되고 그들의 glycolysis 및 미토콘드리아 물질 대사는 세포외 플럭스 분석기로 측정됩니다.세포 외 플럭스 분석은 전통적으로 부착 세포에 사용되지만,이 방법은 LSK HSPC가 세포 외 플럭스의 측정을 허용하고 따라서 LSK HSPC의 대사 건강을 허용하는 PLL 코팅 우물에 부착하게. 기저 및 응력 조건에서 세포외 산성화 율을 통해 산소 소비율 및 글리코리시를 통해 미토콘드리아 호흡을 측정하기 위해 글리코리시스및 미토콘드리아 호흡을 방해하는 약물을 순차적으로 주입한다. 예상대로, 외세포 산성화 율의 기저 수준은 음의 미디어에서 배양된 것과 비교하여 포도당 및 피루바테 양성 배지에서 배양된 LSK HSPC에 대해 더 높다.포도당을 가진 주사는 양성 매체에서 배양된 세포에 대한 세포 외 산성화 비율을 바꾸지 않았지만, 부정적인 매체에서 세포의 글리코리시저를 증폭시켰다. 그러나, 이 세포의 기저 수준은 여전히 양성 단에서 더 낮게 남아 있었습니다. 올리고마이신을 함유한 주사는 양수 군의 최대 수준에서 글리코분해를 활성화시켰지만 부정적인 그룹에는 영향을 미치지 않았다.2-DG에서 포도당 아날로그를 가진 주사는 비 혈당 수준으로 세포외 산성화 비율을 반환했습니다. 미토콘드리아 스트레스 시험의 경우, 올리고마이신의 주사는 미토콘드리아 막과 극화되어 ETC 복합체를 통해 더 많은 양성자가 펌핑되는 것을 방지하여 미토콘드리아 호흡 속도를 감소시킨다. FCCP의 주사는 세포가 미토콘드리아 막 전위를 복구하려고 할 때 산소 소비 속도를 최대로 밀어 넣습니다.다른 전자 수송 사슬 억제제 2개를 가진 주사는 미토콘드리아 호흡을 완전히 정지시키고 따라서 산소 소비 비율이 그것의 최소 수준으로 되돌아간다는 것을 일으키는 원인이 됩니다. 단핵 세포 절연을 위한 적세포 용해 버퍼의 사용을 피하십시오. 우리는 덩어리 형성을 방지하고 LSK의 손실을 줄이기 위해 Ficoll 그라데이션 분리를 권장합니다.최적화된 방법을 사용하여 희귀하고 깨지기 쉬운 조혈 줄기 및 전구 세포의 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시를 측정하고 대사 큐의 연구는 정상 및 악성 조혈을 조절할 수 있습니다.

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SCIENTISTS IN ACTION

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

연구

발생학

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리<sup&gt; 높은</sup&gt; 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...