Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Dette arbeidet er delvis støttet av finansieringen støtte fra National Institutes of Health (HL131645, CA016058), St. Baldrick ' s Foundation, og Pelotonia Foundation.

Denne protokollen ble godkjent av Nationwide Children ' s Hospital Animal Care og use Committee (IACUC).
Merk: Protokollen er beskrevet i kronologisk rekkefølge som strekker seg over perioden på to dager. Bruk friske reagenser som beskrevet i protokollen nedenfor.
1. utarbeidelse av reagenser på dagen før analysen
<ol><li>
Fukt sensor patronen.
	<ol>
<li>Ruge 5 mL av calibrant (tabell over materialer) i en ikk...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

Her viser vi isolering av en maksimal mengde ren og levedyktig murine LSK HSPCs befolkning samt måling av deres Glykolysen og mitokondrie åndedrett med en ekstracellulære Flux analysator. Nærmere bestemt, overvinner protokollen følgende tekniske problemer for bruk av LSK HSPCs: i) den lave frekvensen av LSK HSPCs i murine benmarg14, II) lav basal metabolsk aktivitet av LSK HSPCs26, III) skjørhet av LSK HSPCs27, og IV) den ikke-overholdelse av L...

Siden levetiden til de fleste eldre blodlegemer er kort, er homeostase av blod avhengig av selv-fornyelse og differensiering av en lang levetid, men sjelden befolkning på blodkreft stamceller (HSPCs)1. HSPCs er Quiescent, men de er raske til å spre og gjennomgå differensiering ved stimulering for å opprettholde kravene i blod systemet. Som hver HSPC mobilnettet tilstand krever en unik bioenergetisk etterspørsel, den metabolske endringene er sentrale drivere av HSPC skjebne beslutninger. Derfor, tap av metabolsk plastisitet, ved å endre likevekt mellom fredfulle omgivelser, selv-fornyelse, og differensiering av HSPCs, fører ofte til myelo-eller lymfe-proliferativ lidelser. Sammen er forståelsen av metabolsk regulering av HSPC utvikling avgjørende for å avdekke mekanismer underliggende Hematologic ondartet2,3,4,5.
Mitokondrie åndedrett og Glykolysen genererer ATP for å drive intracellulære reaksjoner og produsere byggesteinene som er nødvendige for Makromolekyl syntese. Siden HSPCs har lav mitokondrie masse i forhold til differensiert celler6 og de oppholder fredfulle omgivelser i hypoxic benmarg nisjer, HSPCs primært stole på Glykolysen. Aktivering av HSPCs forbedrer deres mitokondrie metabolisme som fører til tap av fredfulle omgivelser og deres påfølgende inntreden i cellesyklusen. Slike metabolske plastisitet av HSPCs tillater vedlikehold av HSPC bassenget gjennom voksne liv6,7,8,9,10,11,12. Derfor er det avgjørende å undersøke deres metabolske aktiviteter, slik som oksygen forbruksraten (OCR; indeks av oksidativt fosforylering) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR; indeks av Glykolysen) for å analysere HSPC-aktiveringen og tilstandsstatusen. Både OCR og ECAR kan måles samtidig, i sanntid, ved hjelp av en ekstracellulære Flux analysator. Den gjeldende metoden krever imidlertid et stort antall celler og er optimalisert for tilhenger celler13. Siden HSPCs ikke kan isoleres i store mengder fra mus14, krever sortering for å få en ren befolkning, er ikke-tilhenger celler15, og kan ikke være kultivert over natten uten å unngå differensiering16, har det vært vanskelig å måle OCR og ECAR av HSPCs. Her gir vi et sett med klare, trinn-for-trinn-instruksjoner for å følge video-baserte opplæringsprogrammer om hvordan du kan måle metabolsk åndedrett og Glykolysen av få tusen murine benmarg-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

Blodkreft stammen stamceller (HSPCs) har forskjellige metabolske plastisitet, som tillater dem å gå over fra sine Quiescent staten til en differensiering stat å opprettholde kravene i bloddannelse. Det har imidlertid vært vanskelig å analysere metabolsk status (mitokondrie åndedrett og Glykolysen) av HSPCs på grunn av deres begrensede tall og mangel på optimaliserte protokoller for ikke-tilhenger, skjøre HSPCs. Her gir vi et sett av klare, trinn-for-trinn-instruksjoner for å måle metabolsk åndedrett (oksygenforbruk rate; OCR) og Glykolysen (ekstracellulære forsuring rate; ECAR) av murine benmarg-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Denne protokollen gir en høyere mengde LSK HSPCs fra murine benmarg, forbedrer levedyktigheten til HSPCs under inkubasjons, forenkler ekstracellulære Flux analyser av ikke-tilhenger HSPCs, og gir optimalisert injeksjon protokoller (konsentrasjon og tid) for narkotika målretting oksidativt fosforylering og glycolytic trasé. Denne metoden gjør at prediksjon av metabolsk status og helsen til HSPCs under blod utvikling og sykdommer.

Vår utvinning metoden tillot oss å høste opp til ~ 80 000 LSK HSPCs per mus. Levedyktigheten og antall LSK celler ble forbedret med vår metode, fordi vi: (1) kombinert benmarg fra øvre og nedre lemmer, hofte bein, brystbenet, ribbe bur, og ryggraden, (2) unngås ved hjelp av rød cellelyse buffer som ville ha økt celle-død og klumper, (3) brukt tettheten gradient medium separasjon av mono-kjerne celler, og (4) unngås ved hjelp av pre-kjølt buffer som ville ha forårsaket tap av celler-av-interesse i klumper....

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Blodkreft stammen stamceller (HSPCs) overgang fra en Quiescent tilstand til en differensiering tilstand på grunn av deres metabolske plastisitet under bloddannelse. Her presenterer vi en optimalisert metode for måling av mitokondrie åndedrett og Glykolysen av HSPCs.

Analyse av blodkreft stem stamfar celle metabolisme

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Metabolske endringer i hematopoetiske stamceller og stamceller tillater dem å gå fra sin quiescent tilstand til en differensieringstilstand for å opprettholde kravene til bloddannelse. Endring i metabolsk plastisitet av hematopoetiske stamceller og stamceller fører til hematologiske lidelser. Vår protokoll vil bidra til å måle metabolsk regulering og helsen til hematopoetiske stamceller og stamceller under blodutvikling og sykdommer.Analyse av mitokondriegjenspirasjon og glykose av hematopoetiske stamceller er vanskelig da de er skjøre og sjeldne populasjoner. Vår optimaliserte protokoll tillater isolering av en høyere mengde hematopoetiske stamme- og stamceller fra murine benmarg, forbedrer levedyktigheten under inkubasjon, letter ekstracellulær fluksanalyse av ikke-tilhenger hspCer, og gir optimaliserte injeksjonsparametere for legemiddelmålretting av oksidativ fosforylering samt glykolytiske veier. For å starte denne prosedyren, fyll brønnene på nytteplaten og kamrene rundt brønnene med sterilt vann.Senk sensorkassetten ned i nytteplaten og pass på at sensorene er helt dekket av vann. Plasser deretter sylinderampullen nedsenket i nytteplaten i en ikke-CO2-inkubator ved 37 grader Celsius for å inkubere over natten. I et biosikkerhetsskap i klasse II legger du til 40 mikroliter av kommersielt tilgjengelige 0,1 % PLL-løsning på hver brønn av analyseplaten.Dekk analyseplaten med lokket som følger med i settet, og inkuber den lukkede platen ved romtemperatur under panseret i en time. Etter dette, bruk en steril vakuumbasert aspirator for å fjerne overflødig oppløsning og luft tørke platen under panseret. For å høste mononuklert murine benmargsceller, tilsett fem milliliter tetthetsgradient medium til et 15 milliliter konisk rør.Tilsett sakte fem milliliter av benmargscellesuspensjonen, og pass på at cellene forblir som et lag over tetthetsgradientmediet. Sentrifuge ved 500 ganger g og ved romtemperatur i 30 minutter, og sørg for at sentrifugen er ved lavest mulig akselerasjon. Høst det midterste grensesnittet av mononukleerte celler inn i et friskt 15 milliliter rør.Vask deretter cellene med fem milliliter 1X PBS som inneholder 2%FBS. Sentrifuge på 500 ganger g og på fire grader Celsius i fem minutter. Fjern de overnaturante og gjenoppuss cellene i 300 mikroliter på 1X PBS som inneholder 2%FBS.Deretter aliquot 10 mikroliter av celle suspensjon for ustained eller en-farget kontroll i en FACS tube. For å høste LSK HSPCer fra mononukleerte murine benmargsceller, tilsett 15 mikroliter biotin antistoffcocktail til 300 mikroliter mononuklert benmargsceller. For å høste LSK HSPCer fra mononukleerte murine benmargsceller, tilsett 15 mikroliter biotin antistoffcocktail til 300 mikroliter mononuklert benmargsceller.Legg rørene i en isbøtte plassert på en shaker i kjøleskap for å inkubere ved fire grader Celsius med agitasjon i 30 minutter. Tilsett deretter 10 milliliter forhåndskjølt 1X PBS som inneholder 2% FBS til cellene. Sentrifuge på 500 ganger g og på fire grader Celsius i fem minutter.Kast den overnaturlige og resuspend cellepellet i 400 mikroliter på 1X PBS som inneholder 2%FBS. Virvle kort anti-biotin mikroperler før bruk. Tilsett 80 mikroliter av mikroperlene til hver prøve og bland godt.Inkuber i ytterligere 20 minutter ved fire grader Celsius med agitasjon. Etter dette legger du til 10 milliliter forhåndskjølt PBS som inneholder 2% FBS til cellene. Sentrifuger røret på 500 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter.Kast den overnaturlige og resuspend cellepellet i en milliliter PBS som inneholder 2% FBS. Oppbevar cellefjæringen ved fire grader Celsius mens du setter opp den magnetiske separasjonsenheten. Plasser kolonnen i et magnetfelt for den magnetiske assisterte cellesorteringsseparatoren ved fire grader Celsius.Forbered kolonnen for magnetisk separasjon ved å skylle den med tre milliliter 1X PBS som inneholder 2% FBS under tyngdekraften flyt ved fire grader Celsius. Legg til cellesuspensjonen i den før våte kolonnen ved fire grader Celsius. La alle cellene passere gjennom kolonnen ved fire grader Celsius og samle avløpsvannet i et 15 milliliter konisk rør.Deretter vasker du kolonnen med tre milliliter 1X PBS og 2% FBS ved fire grader Celsius. Gjenta denne vasken tre ganger. Samle strømmen gjennom og hold den på fire grader Celsius.Sentrifuger det koniske røret som inneholder strømmen gjennom på 500 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kast de supernatante og gjenoppusse cellene i 0,5 milliliter 1X PBS med 2% FBS og overfør suspensjonen til et FACS-rør. Tilsett deretter 24 mikroliter av LSK-antistoffcocktailen til hver 10 millioner celler.Dekk røret med folie og inkuber i mørket ved fire grader Celsius med agitasjon i en time. Etter dette legger du til tre milliliter 1X PBS med 2% FBS til FACS-røret. Sentrifuge på 500 ganger g og på fire grader Celsius i fem minutter.Kast de overnaturante og resuspend antistoff-merkede cellene i en milliliter på 1X PBS som inneholder 2%FBS. Like før sortering, tilsett en mikroliter på ett milligram per milliliter propidiumjodid til cellefjæringen og bruk en 40 mikrometersil for å filtrere innholdet i FACS-røret. Først sentrifuger de oppsamlede LSK-cellene ved 500 ganger g og ved romtemperatur i fem minutter.Kast de overnaturante og gjenoppusst cellene i komplette medier til en endelig konsentrasjon på minst 70 000 celler per 40 mikroliter. Frø 40 mikroliter av denne cellesuspensjonen i brønnene på en PLL belagt åtte-brønns plate som sørger for å la alle hjørnebrønnene stå tomme. Sentrifuger platen ved 450 ganger g og ved romtemperatur i ett minutt.Bruk et invertert mikroskop for å sikre at cellene er festet til bunnen av brønnene. Etter dette legger du til 135 mikroliter komplette medier til cellene i hver brønn som bringer det endelige volumet av hver brønn til 175 mikroliter. Tilsett 175 mikroliter med komplette medier i de to hjørnene av platen som blanke.Inkuber cellene i en ikke CO2 inkubator ved 37 grader Celsius i to timer. Deretter setter du opp et program for analysatoren for å legge til narkotika til hver brønn av platen som beskrevet i tabell to og tabell tre av tekstprotokollen. For mitokondriestresstesten, hent sensorkassetten i nytteplaten fra inkubatoren slik at hver brønn har en endelig konsentrasjon av to mikromolar oligomycin, 1,5 mikromolar FCCP og 0,5 mikromolar av enten rotenon og anti-mycin A etter behov.Fjern lokket fra sensorkassetten og plasser det på instrumentbrettet. Start kalibreringsprosessen som tar 20 minutter. Når kalibreringen er fullført, fjerner du nytteplaten og erstatter den med analyseplaten som inneholder LSK-cellene.Trykk fortsett for å starte det forrige innstilte programmet. Når programmet er fullført, henter du dataene og analyserer dem. I denne studien er en maksimal mengde levedyktige murine LSK HSPCer isolert og deres glykose og mitokondriemetabolisme måles med en ekstracellulær fluksaysator.Selv om ekstracellulær fluksanalyse tradisjonelt brukes til følgeceller, gjør denne metoden LSK HSPCer-tilhenger til PLL-belagte brønner som muliggjør måling av ekstracellulær fluks og dermed metabolsk helse av LSK HSPCer. For å måle mitokondriegjenspirasjon gjennom oksygenforbruket og glykose gjennom ekstracellulær forsuringshastighet i basale og stressforhold injiseres legemidler som forstyrrer glykose og mitokondriegjenspirasjon sekvensielt. Som forventet er basalnivået av den ekstracellulære forsuringsraten høyere for LSK HSPCer dyrket i glukose og pyruvatpositive medier sammenlignet med de som er dyrket i negative medier.Injeksjonen med glukose endret ikke den ekstracellulære forsuringsraten for cellene dyrket i det positive mediet, men det økte glykose av celler i negative medier. Basalnivået av disse cellene forble imidlertid fortsatt lavere i den positive gruppen. Injeksjonen med oligomycin aktiverte glykose på sitt maksimale nivå i den positive gruppen, men påvirket ikke den negative gruppen.Injeksjonen med glukoseanalogen ved 2-DG returnerte den ekstracellulære forsuringshastigheten til ikke-glykolytiske nivåer. For mitokondriestresstesten hyperpolariserte injeksjonen av oligomycin mitokondriemembranen som forhindrer mer protonpumping gjennom ETC-kompleksene og dermed reduserer frekvensen av mitokondrierespirasjon. Injeksjonen av FCCP presser oksygenforbruket til det maksimale når celler prøver å gjenopprette mitokondriemembranpotensialet.Injeksjonen med to andre elektron transportkjedehemmere forårsaker mitokondrie respirasjon å helt stoppe og dermed oksygenforbruket tilbake til sitt minimumsnivå. Unngå bruk av rødcellelysbuffer for mononukleær celleisolering. Vi anbefaler Ficoll gradient separasjon for å hindre klumpdannelse og redusere tap av LSK.Ved hjelp av vår optimaliserte metode kan vi måle mitokondrieånding og glykose av sjeldne og skjøre hematopoetiske stamceller og studier av metabolske signaler regulerer normal og ondartet hematopoiesis.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Avledning av Cardiac stamceller fra embryonale stamceller

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkte Induction of Human Neural stamceller fra perifert blod Hematopoietiske stamceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiere Differensiering i udødeligmultipotente Otic stamceller

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Immunomagnetisk Separasjon av Fat Depot spesifikke Sca1<sup&gt; høy</sup&gt; adipose-avledet stamceller (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Konkurransedyktige transplantasjoner skal vurdere stamcelle Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet differensiering av Primitive og Definitive blodkreft Progenitors fra menneskelige Pluripotent stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Elektrofysiologisk analyse av humane pluripotente stamceller-avledede kardiomyocytter (hPSC-CMer) ved bruk av flere elektrodearrayer (MEA)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

Påvisning av rester Donor Erythroid Progenitor celler etter blodkreft stamcelletransplantasjon for pasienter med Hemoglobinopathies

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Utvikling av In Vitro analysen å Quantitate blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) i utvikle sebrafisk embryo

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...