Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Este trabalho é, em parte, apoiado pelo apoio financeiro dos Institutos Nacionais de Saúde (HL131645, CA016058), da Fundação St. Baldrick e da Fundação Pelotonia.

Este protocolo foi aprovado pelo Nationwide Children's Hospital Animal Care and Use Committee (IACUC).
Nota: O protocolo é descrito em ordem cronológica que se estende ao longo do período de dois dias. Use novos reagentes, conforme descrito no protocolo abaixo.
1. Preparação de reagentes no dia anterior ao ensaio
<ol><li>
Hidrate o cartucho do sensor.
	<ol>
<li>Incubar 5 mL do calibrante(Tabela de Materiais)e...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

Aqui, demonstramos o isolamento de uma quantidade máxima de população de HSPCs lspcs de urina pura e viável, bem como a medição de sua glicolíse e respiração mitocondrial com um analisador de fluxo extracelular. Especificamente, o protocolo supera as seguintes questões técnicas para o uso de LSK HSPCs : i) a baixa frequência de LSK HSPCs na medula óssea de urina14, ii) baixa atividade metabólica basal de LSK HSPCs26, iii) a fragilidade dos LSK HSPCs<sup class=...

Uma vez que a vida útil da maioria dos glóbulos maduros é curta, a homeostase do sangue depende da auto-renovação e diferenciação de uma população de longa duração, mas rara de células-tronco hematopoiéticas (HSPCs)1. HSPCs são quiescentes, mas eles são rápidos a proliferar e sofrer diferenciação após a estimulação para sustentar as demandas do sistema sanguíneo. Como cada estado celular HSPC requer uma demanda bioenergética única, as mudanças metabólicas são os principais impulsionadores das decisões de destino HSPC. Portanto, a perda da plasticidade metabólica, alterando o equilíbrio entre quiescência, autorenovação e diferenciação de HSPCs, muitas vezes leva a distúrbios mielo ou linfoproliferativos. Juntos, a compreensão da regulação metabólica do desenvolvimento do HSPC é fundamental para descobrir mecanismos subjacentes malignidades hematológicas2,3,4,5.
A respiração mitocondrial e a glicolíse geram ATP para conduzir reações intracelulares e produzir os blocos de construção necessários para a síntese de macromoléculas. Como os HSPCs têm baixa massa mitocondrial em comparação com células diferenciadas6 e sustentam quiescência em nichos de medula óssea hipóxico, os HSPCs dependem principalmente de glicolíse. A ativação de HSPCs aumenta seu metabolismo mitocondrial que leva à perda de quiescência e sua subsequente entrada no ciclo celular. Tal plasticidade metabólica dos HSPCs permite a manutenção dapiscina HSPC ao longo da vida adulta6,7,8,9,10,11,12. Portanto, é fundamental investigar suas atividades metabólicas, como a taxa de consumo de oxigênio (OCR; índice de fosforilação oxidativa) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR; índice de glicolyse) para analisar a ativação do HSPC e o estado de saúde. Tanto o OCR quanto o ECAR podem ser medidos simultaneamente, em tempo real, usando um analisador de fluxo extracelular. No entanto, o método atual requer um grande número de células e é otimizado para células aderentes13. Uma vez que os HSPCs não podem ser isolados em grandes quantidades de camundongos14,exigem a classificação para obter uma população pura, são células não aderentes15,e não podem ser cultivadas durante a noite sem evitar a diferenciação16, tem sido difícil medir o OCR e o ECAR de HSPCs. Aqui, fornecemos um conjunto de instruções claras e passo a passo para acompanhar tutoriais baseados em vídeo sobre como medir a respiração metabólica e a glicolíse de poucos milhares de HSPCs de medula óssea de urinasca1+c-Kit+ (LSK).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) têm plasticidade metabólica distinta, o que lhes permite fazer a transição de seu estado quiescente para um estado de diferenciação para sustentar as demandas da formação sanguínea. No entanto, tem sido difícil analisar o estado metabólico (respiração mitocondrial e glicolíse) dos HSPCs devido aos seus números limitados e à falta de protocolos otimizados para HSPCs frágeis não aderentes. Aqui, fornecemos um conjunto de instruções claras e passo a passo para medir a respiração metabólica (taxa de consumo de oxigênio; OCR) e glicolyse (taxa de acidificação extracelular; ECAR) de murine osso medula-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Este protocolo fornece uma maior quantidade de HSPCs LSK da medula óssea da urina, melhora a viabilidade dos HSPCs durante a incubação, facilita análises de fluxo extracelular de HSPCs não aderentes e fornece protocolos de injeção otimizados (concentração e tempo) para medicamentos que visam a fosforilação oxidativa e vias glicolíticas. Este método permite a previsão do estado metabólico e da saúde dos HSPCs durante o desenvolvimento do sangue e doenças.

Nosso método de extração nos permitiu colher até ~ 80.000 HSPCs LSK por mouse. A viabilidade e o número de células LSK foram melhorados com o nosso método, porque nós: (1) medula óssea combinada dos membros superiores e inferiores, ossos do quadril, esterno, caixa torácica e coluna vertebral(2) evitado o uso de tampão de lyse de células vermelhas que teria aumentado a morte celular e aaglomeração, (3) usou a separação média de gradiente de densidade de células mononucleadas, e (4) evitou o uso de tampã...

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Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) transitam de um estado quiescente para um estado de diferenciação devido à sua plasticidade metabólica durante a formação sanguínea. Aqui, apresentamos um método otimizado para medir a respiração mitocondrial e a glicolíse dos HSPCs.

Análise do metabolismo hematopoiético da pilha do progenitor da haste

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Mudanças metabólicas nas células hematopoiéticas e progenitoras permitem que elas transitem de seu estado quiescente para um estado de diferenciação para sustentar demandas de formação sanguínea. A alteração na plasticidade metabólica das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras leva a distúrbios hematológicos. Nosso protocolo ajudará a medir a regulação metabólica e a saúde das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras durante o desenvolvimento sanguíneo e doenças.A análise da respiração mitocondrial e da glicolise das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras é difícil, pois são frágeis e raras populações. Nosso protocolo otimizado permite o isolamento de uma maior quantidade de células hematopoiéticas de haste e progenitor da medula óssea murina, melhora sua viabilidade durante a incubação, facilita a análise de fluxo extracelular de HSPCs não aderentes e fornece parâmetros de injeção otimizados para a segmentação de fábulas oxidativas, bem como vias glicólticas. Para iniciar este procedimento, encha os poços da placa de utilidade e as câmaras ao redor dos poços com água estéril.Submergir o cartucho do sensor na placa de utilidade, certificando-se de que os sensores estão completamente cobertos por água. Em seguida, coloque o cartucho submerso na placa de utilidade em uma incubadora não CO2 a 37 graus Celsius para incubar durante a noite. Em um gabinete de biossegurança classe II, adicione 40 microliters de solução 0,1%PLL disponível comercialmente para cada poço da placa de ensaio.Cubra a placa de ensaio com a tampa fornecida no kit e incubar a placa fechada em temperatura ambiente sob o capô por uma hora. Depois disso, use um aspirador à base de vácuo estéril para remover a solução em excesso e secar a placa sob o capô. Para colher células mononucleadas de medula óssea de murina, adicione cinco mililitros de gradiente de densidade médio a um tubo cônico de 15 mililitros.Adicione lentamente cinco mililitros da suspensão da célula de medula óssea certificando-se de que as células permaneçam como uma camada acima do meio gradiente de densidade. Centrifugar a 500 vezes g e à temperatura ambiente por 30 minutos certificando-se de que a centrífuga está na menor aceleração possível. Colher a interface média das células mononucleadas em um tubo fresco de 15 mililitros.Em seguida, lave as células com cinco mililitros de 1X PBS contendo 2% de FBS. Centrifugar a 500 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos. Remova o supernascer e resuspenja as células em 300 microliters de 1X PBS contendo 2% de FBS.Em seguida, alíquota de 10 microliters da suspensão celular para controle não detido ou de cor única em um tubo FACS. Para colher LSK HSPCs de células mononucleadas de medula óssea murina, adicione 15 microliters de coquetel de anticorpos biotina a 300 microliters de células mononucleadas de medula óssea. Para colher LSK HSPCs de células mononucleadas de medula óssea murina, adicione 15 microliters de coquetel de anticorpos biotina a 300 microliters de células mononucleadas de medula óssea.Coloque os tubos em um balde de gelo posicionado sobre um shaker em uma geladeira para incubar a quatro graus Celsius com agitação por 30 minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS 1X pré-refrigerado contendo 2% de FBS às células. Centrifugar a 500 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos.Descarte o supernascer e resuspenque a pelota celular em 400 microliters de 1X PBS contendo 2% de FBS. Brevemente vórtice das microesferas anti-biotina antes do uso. Adicione 80 microliters das microesferas a cada amostra e misture bem.Incubar por mais 20 minutos a quatro graus Celsius com agitação. Depois disso, adicione 10 mililitros de PBS pré-refrigerados contendo 2% de FBS às células. Centrifugar o tubo a 500 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos.Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular em um mililitro de PBS contendo 2%FBS. Armazene a suspensão da célula a quatro graus Celsius durante a configuração da unidade de separação magnética. Coloque a coluna em um campo magnético para o separador de células assistidas magnéticas a quatro graus Celsius.Prepare a coluna para a separação magnética enxaguando-a com três mililitros de 1X PBS contendo 2% de FBS sob fluxo gravitacional a quatro graus Celsius. Adicione a suspensão da célula à coluna pré-úmida a quatro graus Celsius. Deixe que todas as células passem pela coluna a quatro graus Celsius e coletem o efluente em um tubo cônico de 15 mililitros.Em seguida, lave a coluna com três mililitros de 1X PBS e 2%FBS a quatro graus Celsius. Repita esta lavagem três vezes. Pegue o fluxo e mantenha-o a quatro graus Celsius.Centrifugar o tubo cônico contendo o fluxo através de 500 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernascimento e resuspenque as células em 0,5 mililitros de 1X PBS com 2%FBS e transfira a suspensão para um tubo FACS. Em seguida, adicione 24 microliters do coquetel de anticorpos LSK a cada 10 milhões de células.Cubra o tubo com papel alumínio e incubar no escuro a quatro graus Celsius com agitação por uma hora. Depois disso, adicione três mililitros de 1X PBS com 2% de FBS ao tubo FACS. Centrifugar a 500 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos.Descarte o supernascimento e resuspenque as células rotuladas por anticorpos em um mililitro de 1X PBS contendo 2% de FBS. Pouco antes da triagem, adicione um microliter de um miligrama por iodeto de propídio mililitro à suspensão da célula e use um coador de 40 micrômetros para filtrar o conteúdo do tubo FACS. Primeiro, centrifugar as células LSK coletadas a 500 vezes g e à temperatura ambiente por cinco minutos.Descarte o supernascer e resuspenque as células em mídia completa para uma concentração final de pelo menos 70.000 células por 40 microliters. Sementes 40 microliters desta suspensão celular nos poços de uma placa pll revestida de oito poços certificando-se de deixar todos os poços de canto vazios. Centrifugar a placa a 450 vezes g e à temperatura ambiente por um minuto.Use um microscópio invertido para garantir que as células estejam presas à parte inferior dos poços. Depois disso, adicione 135 microliters de mídia completa às células em cada poço, trazendo o volume final de cada poço para 175 microliters. Adicione 175 microliters de mídia completa aos dois cantos da placa como espaços em branco.Incubar as células em uma incubadora não co2 a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, configure um programa para que o analisador adicione drogas a cada poço da placa conforme descrito na tabela dois e na tabela três do protocolo de texto. Para o teste de estresse mitocondrial, recupere o cartucho de sensor na placa de utilidade da incubadora de tal forma que cada poço tenha uma concentração final de duas oligomicina micromolar, 1,5 micromolar FCCP e 0,5 micromolar de rotenona e anti-mícina A conforme necessário.Retire a tampa do cartucho do sensor e coloque-a na bandeja do instrumento. Inicie o processo de calibração que levará 20 minutos. Quando a calibração estiver completa, remova a placa de utilidade e substitua-a pela placa de ensaio contendo as células LSK.A imprensa continua a iniciar o programa previamente definido. Quando o programa estiver concluído, recupere os dados e analise-os. Neste estudo, uma quantidade máxima de HSPCs murine lsk viável são isoladas e seu metabolismo glicólise e mitocondrial é medido com um analisador de fluxo extracelular.Embora a análise de fluxo extracelular seja tradicionalmente usada para células aderentes, este método torna os HSPCs LSK aderentes aos poços revestidos de PLL que permitem a medição do fluxo extracelular e, portanto, a saúde metabólica dos HSPCs LSK. A fim de medir a respiração mitocondrial através da taxa de consumo de oxigênio e glicolise através da taxa de acidificação extracelular em condições basais e de estresse, drogas que interferem com a glicolise e respiração mitocondrial são injetadas sequencialmente. Como esperado, o nível basal da taxa de acidificação extracelular é maior para HSPCs LSK cultivados em mídia positiva de glicose e piruvato em comparação com aqueles cultivados em mídia negativa.A injeção com glicose não alterou a taxa de acidificação extracelular para as células cultivadas na mídia positiva, mas aumentou a glicólise das células em mídia negativa. No entanto, o nível basal dessas células ainda permaneceu menor no grupo positivo. A injeção com oligomicina ativou a glicolise em seu nível máximo no grupo positivo, mas não afetou o grupo negativo.A injeção com o analógico de glicose em 2-DG devolveu a taxa de acidificação extracelular a níveis não glicolíticos. Para o teste de estresse mitocondrial, a injeção de oligomicina hiperpolarizou a membrana mitocondrial impedindo mais bombeamento de prótons através dos complexos etc e, assim, reduzindo a taxa de respiração mitocondrial. A injeção de FCCP eleva a taxa de consumo de oxigênio ao máximo à medida que as células tentam recuperar o potencial da membrana mitocondrial.A injeção com dois outros inibidores da cadeia de transporte de elétrons faz com que a respiração mitocondrial pare completamente e, assim, a taxa de consumo de oxigênio reverteu para seu nível mínimo. Evite o uso de tampão de lise celular vermelha para o isolamento da célula mononuclear. Recomendamos a separação de gradiente ficoll para evitar a formação de aglomerados e reduzir a perda de LSK.Usando nosso método otimizado, podemos medir a respiração mitocondrial e a glicolise de células-tronco e progenitoras raras e frágeis e o estudo de sinais metabólicos regulam hematopoiese normal e maligna.

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Derivação de Cardiac células progenitoras de células estaminais embrionárias

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Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Análise eletrofisiológica de cardiomiócitos humanos derivados de células-tronco pluripotentes (hPSC-CMs) usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs)

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Deteção de doador Residual eritroide progenitoras após transplante de células-tronco hematopoéticas para pacientes com hemoglobinopatias

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Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

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Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

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