Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Эта работа частично поддерживается при финансовой поддержке Национальных институтов здравоохранения (HL131645, CA016058), Фонда Святого Болдрика и Фонда Пелотонии.

Этот протокол был одобрен Общенациональным комитетом по уходу за животными и использованию детей (IACUC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описан в хронологическом порядке, который охватывает в течение двух дней. Используйте свежие реагенты, как описано в протоколе ниже.
<p c...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

Здесь мы демонстрируем изоляцию максимального количества чистого и жизнеспособного мурина популяции LSK HSPCs, а также измерение их гликолиза и митохондриального дыхания с помощью внеклеточного анализатора потока. В частности, протокол преодолевает следующие технические вопросы для ис?...

Так как продолжительность жизни большинства зрелых кровяных клеток коротка, гомеостаз крови опирается на самообновление и дифференциацию долгоживущей, но редкой популяции гематопоиетических стволовых клеток (HSPCs)1. HSPCs тихие, но они быстро размножаются и проходят дифференциацию при стимуляции для поддержания требований системы крови. Поскольку каждое клеточное состояние HSPC требует уникального биоэнергетического спроса, метаболические изменения являются ключевыми факторами решений судьбы HSPC. Таким образом, потеря метаболической пластичности, изменяя равновесие между quiescence, самообновления, и дифференциации HSPCs, часто приводит к миело- или лимфо-пролиферативных расстройств. Вместе понимание метаболической регуляции развития HSPC имеет решающее значение для выявления механизмов, лежащих в основе гематологических злокачественных новообразований2,3,4,5.
Митохондриальное дыхание и гликолиз генерируют АТФ для выработки внутриклеточных реакций и создания строительных блоков, необходимых для синтеза макромолекул. Так как HSPCs имеют низкую митохондриальную массу по сравнению с дифференцированными клетками6, и они поддерживают quiescence в гипоксических нишах костного мозга, HSPCs в первую очередь полагаются на гликолиза. Активация HSPCs повышает их митохондриальный метаболизм, что приводит к потере покоя и их последующего вступления в клеточный цикл. Такая метаболическая пластичность HSPCs позволяет обслуживание бассейна HSPC на протяжениивсейвзрослой жизни6,7,8,9,10,11,12. Поэтому крайне важно исследовать их метаболическую активность, такую как уровень потребления кислорода (OCR; индекс окислительного фосфорилирования) и внеклеточный уровень подкисления (ECAR; индекс гликолиза) для анализа активации HSPC и состояния здоровья. И OCR, и ECAR могут быть измерены одновременно, в режиме реального времени, с помощью внеклеточного анализатора потока. Тем не менее, текущий метод требует большого количества клеток и оптимизирован для клеток адептов13. Так как HSPCs не могут быть изолированы в больших количествах от мышей14, требуют сортировки для получения чистой популяции, являются неприсоединения клетки15, и не могут быть культивированы в одночасье, избегая дифференциации16, было трудно измерить OCR и ECAR HSPCs. Здесь мы предоставляем набор четких, пошаговых инструкций для сопровождения видео-уроки о том, как измерить метаболическое дыхание и гликолиз несколько тысяч морин костного мозга-LineagenegSca1иc-Kit (LSK) HSPCs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

Гематопоиэтисические стволовые клетки-прародители (HSPCs) имеют различные метаболические пластичности, что позволяет им перейти от их тихих состояние дифференциации государства для поддержания требований формирования крови. Тем не менее, было трудно проанализировать метаболический статус (митохондриальное дыхание и гликолиз) HSPCs из-за их ограниченного числа и отсутствие оптимизированных протоколов для неприсоединения, хрупкие HSPCs. Здесь мы предоставляем набор четких, пошаговых инструкций по измерению метаболического дыхания (коэффициент потребления кислорода; OCR) и гликолиз (внеклеточный уровень подкисления; ECAR) из морин костного мозга-ЛинияnegSca1иc-Kit (LSK) HSPCs. Этот протокол обеспечивает большее количество LSK HSPCs из морин костного мозга, улучшает жизнеспособность HSPCs во время инкубации, облегчает внеклеточный анализ потока неприсоединения HSPCs, и обеспечивает оптимизированные протоколы инъекций (концентрация и время) для препаратов, направленных на окислительный фосфорилирование и гликолитические пути. Этот метод позволяет прогнозировать метаболическое состояние и здоровье ГСпК при развитии крови и заболеваниях.

Наш метод извлечения позволил нам собрать до 80 000 LSK HSPCs на мышь. Жизнеспособность и количество lSK клеток были улучшены с нашим методом, потому что мы: (1) комбинированный костный мозг из верхних и нижних конечностей, тазобедренных костей, грудины, грудной клетки и позвоночника, (2) избежать ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Гематопоиэтисические стволовые клетки-прародители (HSPCs) переходят от состояния покоя к состоянию дифференциации из-за их метаболической пластичности во время формирования крови. Здесь мы представляем оптимизированный метод измерения митохондриального дыхания и гликолиза ГСПК.

Анализ гематопоиетического метаболизма стволовых прародителей клеток

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Метаболические изменения в гематопоэтических стволовых клетках и клетках-прародителях позволяют им перейти от их тихие состояния к состоянию дифференциации для поддержания требований к образованию крови. Изменение метаболической пластичности гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников приводит к гематологическим расстройствам. Наш протокол поможет измерить метаболическую регуляции и здоровье гематопоэтических стволовых и прародителя клеток во время развития крови и заболеваний.Анализ митохондриального дыхания и гликолиза гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников затруднен, так как они являются хрупкой и редкой популяцией. Наш оптимизированный протокол позволяет изоляции большего количества гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников из муринового костного мозга, улучшает их жизнеспособность во время инкубации, облегчает внеклеточный анализ потока непритязательных ГСП, а также обеспечивает оптимизированные параметры инъекций для препарата, ориентированного на окислительное фосфорилирование, а также гликолитические пути. Для начала этой процедуры заполните колодцы коммунальной плиты и камеры вокруг колодцев стерильной водой.Погрузите сенсорный картридж в утилиту пластины убедившись, что датчики полностью покрыты водой. Затем поместите картридж, погруженный в утилиту пластины в не CO2 инкубатор при 37 градусов по Цельсию, чтобы инкубировать на ночь. В шкафе биобезопасности класса II добавьте 40 микролитров коммерчески доступного решения 0,1%PLL к каждой пластине анализа.Обложка анализ пластины с крышкой, представленной в комплекте и инкубировать закрытую пластину при комнатной температуре под капотом в течение одного часа. После этого используйте стерильный вакуумный аспиратор, чтобы удалить избыток раствора и высушить пластину под капотом. Для сбора мононуклеированных клеток костного мозга мурина добавьте пять миллилитров градиентной среды плотности в 15 миллилитров конической трубки.Медленно добавьте пять миллилитров подвески клеток костного мозга, убедившись, что клетки остаются в качестве слоя выше градиентной среды плотности. Центрифуга при 500 г и при комнатной температуре в течение 30 минут убедившись, что центрифуга находится на самом низком возможном ускорении. Урожай среднего интерфейса мононуклеированных клеток в свежую 15 миллилитровую трубку.Затем мыть клетки с пятью миллилитров 1X PBS, содержащих 2%FBS. Центрифуга при 500 градусах г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно посовелите клетки в 300 микролитров 1X PBS, содержащих 2%FBS.Далее, aliquot 10 микролитров подвески ячейки для неокрашенных или одноцветного управления в трубке FACS. Для сбора LSK HSPCs из мононуклеированных клеток костного мозга мурина добавьте 15 микролитров биотинового коктейля антител к 300 микролитров мононуклеированных клеток костного мозга. Для сбора LSK HSPCs из мононуклеированных клеток костного мозга мурина добавьте 15 микролитров биотинового коктейля антител к 300 микролитров мононуклеированных клеток костного мозга.Поместите трубки в ведро со льдом, расположенные на шейкере в холодильнике, чтобы инкубировать при четырех градусах Цельсия с волнением в течение 30 минут. Затем добавьте 10 миллилитров предварительно охлажденного 1X PBS, содержащего 2%FBS в клетки. Центрифуга при 500 градусах г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте клеточные гранулы в 400 микролитров 1X PBS, содержащих 2%FBS. Кратко вихрь анти-биотин микробусы перед использованием. Добавьте 80 микролитров микробусов к каждому образцу и хорошо перемешайте.Инкубировать в течение еще 20 минут при четырех градусах по Цельсию с возбуждением. После этого добавьте в клетки 10 миллилитров предварительно охлажденного PBS, содержащего 2%FBS. Центрифуга трубки в 500 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.Отбросьте супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в один миллилитр PBS, содержащий 2%FBS. Храните подвеску клетки при четырех градусах Цельсия при настройке магнитного блока разделения. Поместите столбец в магнитное поле для магнитной помощи сепаратора сортировки клеток при четырех градусах цельсия.Подготовь колонку к магнитному разделению, опоясыв ее тремя миллилитровами 1X PBS, содержащими 2%FBS под гравитационным потоком при четырех градусах Цельсия. Добавьте подвеску клетки к предварительно влажной колонке при четырех градусах по Цельсию. Разрешить всем клеткам пройти через колонку при четырех градусах по Цельсию и собирать сточные воды в 15 миллилитров конической трубки.Далее, мыть колонку с тремя миллилитров 1X PBS и 2%FBS при четырех градусах по Цельсию. Повторите эту стирку три раза. Соберите поток через и держать его на четыре градуса по Цельсию.Центрифуга конической трубки, содержащей поток через 500 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и переполнив клетки в 0,5 миллилитров 1X PBS с 2%FBS и перенесите подвеску в трубку FACS. Затем добавьте 24 микролитров коктейля LSK антител к каждому 10 миллионам клеток.Обложка трубки с фольгой и инкубировать в темноте при четырех градусах по Цельсию с волнением в течение одного часа. После этого добавьте три миллилитров 1X PBS с 2%FBS в трубку FACS. Центрифуга при 500 градусах г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.Отбросьте супернатант и будем повторно помещенными антителами клетками в одном миллилитре 1X PBS, содержащем 2%FBS. Перед сортировкой добавьте один микролитр по миллиграмму на миллилитр йодида пропидия в клеточную подвеску и используйте 40-микрометровый ситечко для фильтрации содержимого трубки FACS. Во-первых, центрифуга собранных клеток LSK в 500 раз г и при комнатной температуре в течение пяти минут.Отбросьте супернатант и повторно наполнив клетки полными средствами массовой информации до конечной концентрации не менее 70 000 клеток на 40 микролитров. Семя 40 микролитров этой ячейки подвески в колодцы PLL покрытием восемь хорошо пластины убедившись, чтобы оставить все угловые колодцы пустыми. Центрифуга пластины в 450 раз г и при комнатной температуре в течение одной минуты.Используйте перевернутый микроскоп, чтобы обеспечить клетки прикреплены к нижней части колодцев. После этого добавьте 135 микролитров полного мультимедиа к клеткам в каждой хорошо доведя окончательный объем каждой колодец до 175 микролитров. Добавьте 175 микролитров полного мультимедиа в два угла пластины в качестве заготовок.Инкубировать клетки в инкубаторе без CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. Затем найте программу для анализатора, чтобы добавить наркотики в каждый колодец пластины, как указано в таблице два и таблице три текстового протокола. Для митохондриального стресс-теста, получить картридж датчика в утилите пластины из инкубатора так, что каждая хорошо имеет окончательную концентрацию двух микромоляных олигомицина, 1,5 микромолара FCCP, и 0,5 микромолара либо ротенон и антимицин А по мере необходимости.Снимите крышку с сенсорного картриджа и поместите ее на поднос с инструментами. Начните процесс калибровки, который займет 20 минут. Когда калибровка завершена, удалите утилиту пластины и заменить его с анализом пластины, содержащей клетки LSK.Пресса продолжает начинать ранее установленную программу. Когда программа будет завершена, получить данные и проанализировать его. В этом исследовании, максимальное количество жизнеспособных murine LSK HSPCs изолированы и их гликолиз и митохондриальный метаболизм измеряется с внеклеточного анализатора потока.Хотя внеклеточный анализ потока традиционно используется для адептов клеток, этот метод делает LSK HSPCs приверженцем PLL покрытием скважин, что позволяет для измерения внеклеточного потока и, следовательно, метаболического здоровья LSK HSPCs. Для измерения митохондриального дыхания через скорость потребления кислорода и гликолиза через внеклеточную скорость подкисления в базальных и стрессовых условиях, препараты, которые мешают гликолизу и митохондриальному дыханию вводятся последовательно. Как и ожидалось, базальный уровень внеклеточного подкисления выше для LSK HSPCs, культурированных в глюкозе и пирувате положительных медиа по сравнению с теми, которые культурированы в негативных средствах массовой информации.Инъекция с глюкозой не меняла экстраклеточной скорости подкисления клеток, культурных в положительных средствах массовой информации, но она увеличила гликолиз клеток в отрицательных средствах массовой информации. Тем не менее, базальный уровень этих клеток по-прежнему остается ниже в положительной группе. Инъекция олигомицином активировала гликолиз на максимальном уровне в положительной группе, но не повлияла на отрицательную группу.Инъекция с аналогом глюкозы при 2-DG вернула уровень внеклеточного подкисления до негликолитических уровней. Для митохондриального стресс-теста инъекция олигомицина гиперполяризировала митохондриальную мембрану, предотвращая больше протонной перекачки через комплексы ETC и тем самым снижая скорость митохондриального дыхания. Инъекция FCCP толкает скорость потребления кислорода до максимума, как клетки пытаются восстановить митохондриальный мембранный потенциал.Инъекция с двумя другими ингибиторами транспортной цепи электронов приводит к полной остановке митохондриального дыхания, и таким образом уровень потребления кислорода вернулся к минимальному уровню. Пожалуйста, избегайте использования буфера лиза красных клеток для изоляции моноядерных клеток. Мы рекомендуем разделение градиента Ficoll, чтобы предотвратить образование сгустка и уменьшить потерю LSK.Используя наш оптимизированный метод, мы можем измерить митохондриальное дыхание и гликолиз редких и хрупких гематопоэтических стволовых и прародителя клеток и изучение метаболических сигналов регулировать нормальный и злокачественный гематопоэз.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Вывод сердца клеток-предшественников из эмбриональных стволовых клеток

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Прямая индукция человеческих нервных стволовых клеток из периферической крови гемопоэтических клеток-предшественников

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Инициирование дифференциация в увековечена МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ ушные клетки-предшественники

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Иммуномагнитного Разделение жировое депо-специфической СЦА1<sup&gt; высокая</sup&gt; Полученные из жировой ткани стволовые клетки (ИСС)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Конкурентные трансплантатов для оценки гемопоэтических стволовых клеток Фитнес

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Направлено дифференциация примитивные и окончательного гемопоэтических прародителей от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Электрофизиологический анализ кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC-CMs) с использованием многоэлектродных массивов (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

Определение остаточного доноров эритроидных клеток-предшественников после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с Hemoglobinopathies

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Разработка в Vitro Assay чтобы Quantitate гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) в развитии эмбрионов у рыбок данио

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...