Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Detta arbete stöds delvis av finansieringsstödet från National Institutes of Health (HL131645, CA016058), St. Baldrick ' s Foundation och Pelotonia Foundation.

Detta protokoll godkändes av rikstäckande barnsjukhuset djuromsorg och användning kommitté (IACUC).
Anmärkning: Protokollet beskrivs i kronologisk ordning som sträcker sig över perioden på två dagar. Använd färska reagens enligt beskrivningen i nedanstående protokoll.
1. beredning av reagenser på dagen före analysen
<ol><li>
Återfukta sensor patronen.
	<ol>
<li>Inkubera 5 mL av kalibranten (tabell över mate...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

Här visar vi isolering av en maximal mängd ren och livskraftig murint LSK HSPCs befolkning samt mätning av deras glykolys och mitokondriell andning med en extracellulär Flux Analyzer. Protokollet övervinner särskilt följande tekniska frågor för användning av LSK HSPCs: i) den låga frekvensen av LSK HSPCs i murin benmärg14, II) låg basal metabolisk aktivitet av LSK hspcs26, III) bräckligheten av LSK hspcs27, och IV) att LSK hspcs inte ha...

Eftersom livslängden på de flesta mogna blodkroppar är kort, homeostas av blod förlitar sig på självförnyelse och differentiering av en långlivat men sällsynt population av hematopoietiska stamceller (HSPCs)1. HSPCs är quiescent, men de är snabba att förgöra och genomgå differentiering vid stimulering för att upprätthålla kraven i blodsystemet. Eftersom varje HSPC cellulära tillstånd kräver en unik bioenergetisk efterfrågan, de metabola förändringarna är viktiga drivkrafter för HSPC öde beslut. Därför, förlusten av metabolisk plasticitet, genom att förändra balansen mellan quiescence, självförnyelse, och differentiering av HSPCs, leder ofta till myelo-eller Lympho-proliferativa sjukdomar. Tillsammans är förståelsen av metabolisk reglering av HSPC utveckling avgörande för att avslöja mekanismerna bakom hematologiska maligniteter2,3,4,5.
Mitokondriell andning och glykolys generera ATP att driva intracellulära reaktioner och producera de byggstenar som behövs för makromolekyl syntes. Eftersom hspcs har låg mitokondriell massa jämfört med differentierade celler6 och de upprätthåller vilo i hypoxisk benmärgs nischer, hspcs främst förlita sig på glykolys. Aktivering av hspcs ökar deras mitokondriella metabolism som leder till förlust av vilo och deras efterföljande inträde i cellcykeln. Sådan metabolisk plasticitet av hspcs gör det möjligt att upprätthålla HSPC pool hela vuxenlivet6,7,8,9,10,11,12. Därför är det viktigt att undersöka deras metaboliska aktiviteter, såsom syre förbruknings graden (OCR, index för oxidativ fosforylering) och den extracellulära försurnings graden (ECAR; index för glykolys) för att analysera aktiveringen av HSPC och hälsostatusen. Både OCR och ECAR kan mätas samtidigt, i realtid, med hjälp av en extracellulär Flux Analyzer. Den aktuella metoden kräver dock ett stort antal celler och är optimerad för anhängare av celler13. Eftersom HSPCs inte kan isoleras i stora mängder från möss14, kräver sortering för att få en ren population, är icke-anhängare celler15, och kan inte odlas över natten utan att undvika differentiering16, har det varit svårt att mäta OCR och ECAR av hspcs. Här ger vi en uppsättning tydliga, steg-för-steg-instruktioner för att följa video-baserade tutorials om hur man mäter metabolisk andning och glykolys av några tusen murina benmärg-LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hspcs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

Hematopoietiska Stem progenitorceller (HSPCs) har distinkta metabolisk plasticitet, som tillåter dem att övergå från deras quiescent tillstånd till en differentiering tillstånd att upprätthålla kraven på blodbildningen. Emellertid, det har varit svårt att analysera den metabola status (mitokondriell andning och glykolys) av HSPCs på grund av deras begränsade antal och brist på optimerade protokoll för icke-anhängare, bräckliga HSPCs. Här ger vi en uppsättning tydliga, steg-för-steg-instruktioner för att mäta metabolisk andning (syreförbrukning hastighet; OCR) och glykolys (extracellulär syrnings hastighet; ECAR) av murina benmärg-LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hspcs. Detta protokoll ger en högre mängd LSK HSPCs från murina benmärg, förbättrar livskraften hos HSPCs under inkubering, underlättar extracellulära Flux analyser av icke-anhängare HSPCs, och ger optimerade injektion protokoll (koncentration och tid) för läkemedel riktade mot oxidativ fosforylering och glykolytiska vägar. Denna metod möjliggör förutsägelse av metabolisk status och hälsa HSPCs under blod utveckling och sjukdomar.

Vår extraktionsmetod tillät oss att skörda upp till ~ 80 000 LSK HSPCs per mus. Livskraften och antalet LSK-celler förbättrades med vår metod, eftersom vi: (1) kombinerad benmärg från övre och nedre extremiteter, höft ben, bröstbenet, bröstkorg och ryggrad, (2) undvikas med hjälp av röd cellsbuffert som skulle ha ökat celldöd och klumpar, (3) använde densitetsgradienten medium separation av mono-nucleated celler, och (4) undvikas med hjälp av pre-kyld buffert som skulle ha orsakat förlusten av celler-a...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietiska Stem progenitorceller (HSPCs) övergång från en quiescent tillstånd till en differentiering stat på grund av deras metaboliska plasticitet under blodbildningen. Här presenterar vi en optimerad metod för att mäta mitokondriell andning och glykolys av HSPCs.

Analys av hematopoietisk stamcells metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Metaboliska förändringar i hematopoietiska stam och stamceller tillåter dem att övergå från deras quiescent staten till en differentiering tillstånd att upprätthålla krav på blodbildning. Förändring i metabolisk plasticitet av hematopoietic stam och stamceller leder till hematologic störningar. Vårt protokoll kommer att bidra till att mäta den metaboliska regleringen och hälsan hos hematopoetiska stamceller och stamceller under blodutveckling och sjukdomar.Analys av mitokondriell respiration och glykolys av hematopoietic stamceller och stamceller är svårt eftersom de är bräckliga och sällsynta befolkningen. Vår optimerade protokoll tillåter isolering av en högre mängd hematopoietic stam och stamceller från murin benmärg, förbättrar deras livskraft under inkubation, underlättar extracellulära flux analys av icke-anhängare HSPCs, och ge optimerade injektionsparametrar för läkemedel inriktning oxidativ fosforylering samt glykolytiska vägar. För att börja detta förfarande, fyll brunnarna i bruksplåten och kamrarna runt brunnarna med sterilt vatten.Dränk sensorns patron i bruksplåten och se till att sensorerna är helt täckta av vatten. Placera sedan patronen nedsänkt i bruksplattan i en icke CO2-inkubator vid 37 grader Celsius för att inkubera över natten. I ett biosäkerhetsskåp av klass II, tillsätt 40 mikroliter av kommersiellt tillgänglig 0,1%PLL-lösning till varje brunn av analysplattan.Täck fastsägningsplattan med det lock som medföljer i satsen och inkubera den stängda plattan vid rumstemperatur under huven i en timme. Efter detta, använd en steril vakuumbaserad aspirator för att avlägsna överskottslösningen och lufttorka plattan under huven. För att skörda mononukleated murine benmärgsceller, tillsätt fem milliliter densitet gradient medium till en 15 milliliter koniska röret.Tillsätt långsamt fem milliliter av benmärgscellsfjädringen och se till att cellerna förblir som ett lager ovanför densitetsgradientmediet. Centrifugera vid 500 gånger g och vid rumstemperatur i 30 minuter se till att centrifugen är på lägsta möjliga acceleration. Skörda mittengränssnittet av mononucleerade celler i ett färskt 15 milliliter rör.Tvätta sedan cellerna med fem milliliter 1X PBS innehållande 2%FBS. Centrifug vid 500 gånger g och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Ta bort supernatanten och resuspend cellerna i 300 mikroliter av 1X PBS som innehåller 2%FBS.Därefter alikvoter 10 mikroliter av cellen suspension för ouppslitna eller enfärgad kontroll i en FACS-rör. För att skörda LSK HSPCs från mononucleated murine benmärgsceller, tillsätt 15 mikroliter av biotin antikropp cocktail till 300 mikroliter av mononucleated benmärgsceller. För att skörda LSK HSPCs från mononucleated murine benmärgsceller, tillsätt 15 mikroliter av biotin antikropp cocktail till 300 mikroliter av mononucleated benmärgsceller.Placera rören i en ishink placerad på en shaker i ett kylskåp för att inkubera i fyra grader Celsius med agitation i 30 minuter. Tillsätt sedan 10 milliliter färdigkyld 1X PBS innehållande 2%FBS till cellerna. Centrifug vid 500 gånger g och vid fyra grader Celsius i fem minuter.Kassera supernatanten och resuspend cellpelleten i 400 mikroliter av 1X PBS innehållande 2%FBS. Kort virvel anti-biotin mikropärlor före användning. Tillsätt 80 mikroliter av mikropärlorna till varje prov och blanda väl.Inkubera i ytterligare 20 minuter vid fyra grader Celsius med agitation. Efter detta, tillsätt 10 milliliter pre-kyld PBS som innehåller 2%FBS till cellerna. Centrifugera röret vid 500 gånger g och vid fyra grader Celsius i fem minuter.Kassera supernatanten och resuspend cellpelleten i en milliliter av PBS som innehåller 2%FBS. Förvara cellfjädringen vid fyra grader Celsius medan du ställer in den magnetiska separationsenheten. Placera kolonnen i ett magnetfält för den magnetiska assisterad cellsorteringsavskiljaren vid fyra grader Celsius.Förbered kolonnen för magnetisk separation genom att skölja den med tre milliliter på 1X PBS innehållande 2%FBS under gravitationsflöde vid fyra grader Celsius. Lägg till cellupphängningen i den förvåta kolonnen vid fyra grader Celsius. Låt alla celler att passera genom kolonnen vid fyra grader Celsius och samla utflödet i en 15 milliliter koniska röret.Därefter tvätta kolumnen med tre milliliter av 1X PBS och 2%FBS vid fyra grader Celsius. Upprepa denna tvätt tre gånger. Samla flödet genom och hålla den på fyra grader Celsius.Centrifugera det koniska röret som innehåller flödet genom vid 500 gånger g och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Kassera supernatanten och resuspend cellerna i 0,5 milliliter av 1X PBS med 2%FBS och överför suspensionen till ett FACS-rör. Tillsätt sedan 24 mikroliter av LSK antikroppscocktail till varje 10 miljoner celler.Täck röret med folie och inkubera i mörker vid fyra grader Celsius med agitation i en timme. Efter detta, tillsätt tre milliliter 1X PBS med 2%FBS till FACS-röret. Centrifug vid 500 gånger g och vid fyra grader Celsius i fem minuter.Kassera supernatanten och resuspend de antikroppsmärkta cellerna i en milliliter av 1X PBS innehållande 2%FBS. Strax före sortering, tillsätt en mikroliter av ett milligram per milliliter propidium iodid till cellen suspension och använda en 40 mikrometer sil för att filtrera innehållet i FACS röret. Först centrifugera de insamlade LSK-cellerna vid 500 gånger g och i rumstemperatur i fem minuter.Kassera supernatanten och resuspend cellerna i färdigt massmedia till en finalkoncentration av åtminstone 70, 000 celler per 40 microliters. Frö 40 mikroliter av denna cell suspension i brunnarna i en PLL belagda åtta-väl plåt se till att lämna alla hörn brunnar tomma. Centrifugera plattan vid 450 gånger g och vid rumstemperatur i en minut.Använd ett inverterat mikroskop för att säkerställa att cellerna är fästa vid brunnarnas botten. Efter detta, lägga till 135 mikroliter av kompletta medier till cellerna i varje brunn föra den slutliga volymen av varje brunn till 175 mikroliter. Lägg till 175 mikroliter av kompletta media till de två hörnen av plattan som ämnen.Inkubera cellerna i en icke CO2 inkubator vid 37 grader Celsius i två timmar. Sedan ställa in ett program för analysatorn att lägga till läkemedel till varje brunn av plattan som beskrivs i tabell två och tabell tre av textprotokollet. För mitokondriellt stresstest, hämta sensorn patronen i bruksplåten från inkubatorn så att varje brunn har en slutlig koncentration av två mikromolar oligomycin, 1,5 mikromolar FCCP, och 0,5 mikromolar av antingen rotenon och anti-mycin A som behövs.Ta bort locket från sensorkassetten och placera det på instrumentfacket. Börja kalibreringsprocessen som kommer att ta 20 minuter. När kalibreringen är klar, ta bort bruksplåten och ersätta den med analysplattan som innehåller LSK-cellerna.Tryck på fortsätt för att starta det tidigare inställda programmet. När programmet är klart hämtar du data och analyserar dem. I denna studie, en maximal mängd livskraftiga murine LSK HSPCs är isolerade och deras glykolys och mitokondriell metabolism mäts med en extracellulär flux analysator.Även om extracellulär fluxanalys traditionellt används för anhängare celler, gör denna metod LSK HSPCs anhängare till PLL belagda brunnar som möjliggör mätning av den extracellulära flussen och därmed metabolisk hälsa av LSK HSPCs. För att mäta den mitokondriella respirationen genom syreförbrukningshastigheten och glykolysen genom den extracellulära försurningsgraden vid basala och stresstillstånd, injiceras läkemedel som stör glykolys och mitokondriell respiration sekventiellt. Som väntat är den basala nivån för den extracellulära försurningsgraden högre för LSK HSPCs odlade i glukos och pyruvat positiva medier jämfört med dem odlade i negativa medier.Injektionen med glukos ändrade inte den extracellulära försurningsgraden för de celler som odlades i de positiva medierna, men det ökade glykolysen av celler i negativa medier. Den basala nivån för dessa celler var dock fortfarande lägre i den positiva gruppen. Injektionen med oligomycin aktiverade glykolysen vid dess högsta nivå i den positiva gruppen, men påverkade inte den negativa gruppen.Injektionen med glukosanangel vid 2-DG returnerade den extracellulära försurningsgraden till icke-glykolytiska nivåer. För mitokondriellt stresstest, injektion av oligometycin hyperpolarized mitokondriellt membran förhindra mer proton pumpa genom ETC-komplex och därmed minska hastigheten av mitokondriell respiration. Injektionen av FCCP driver syreförbrukningen till det maximala som celler försöker återhämta mitokondriellt membran potential.Injektionen med två andra elektrontransportkedjehämmare gör att mitokondriell respiration helt upphör och därmed återgick syreförbrukningshastigheten till sin miniminivå. Vänligen undvik användning av rödcellslysbuffert för den mononukleära cellisolering. Vi rekommenderar lutningsseparationen Ficoll för att förhindra klumpbildning och minska förlusten av LSK.Med hjälp av vår optimerade metod kan vi mäta mitokondriell respiration och glykolys av sällsynta och ömtåliga hematopoietic stam och stamceller och studie av metaboliska ledtrådar reglera normala och maligna hematopoiesis.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Härledning av Cardiac progenitorceller från embryonala stamceller

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkt Induktion av humana neurala stamceller från perifert blod hematopoetiska progenitorceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiera Differentiering i Immortaliserade multi Otic stamceller

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Immunomagnetiska separation av fett Depot specifika Sca1<sup&gt; hög</sup&gt; Fetthärledda stamceller (ASC: er)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Konkurrenskraftiga Transplantat att utvärdera hematopoetisk stamcellstransplantation Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Elektrofysiologisk analys av humana Pluripotenta stamceller-härledda kardiomyocyter (hPSC-CM) med användning av Multi-Electrode Arrays (MEA)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

Identifiering av kvarvarande givare erytroid stamceller efter hematopoetisk stamcellstransplantation för patienter med Hemoglobinopathies

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Utveckling av ett In Vitro -test att kvantifiera hematopoetiska stamceller och stamceller celler (HSPCs) utveckla zebrafiskar embryon

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...