Name: analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL131645, CA016058), St. Baldrick Vakfı ve Pelotonia Vakfı'nın finansman desteği ile desteklenmiştir.

Bu protokol Nationwide Çocuk Hastanesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Protokol, iki günlük bir süreye yayılan kronolojik sırada açıklanmıştır. Aşağıdaki protokolde açıklandığı gibi taze reaktifler kullanın.
1. Tsanın Dan Önceki Gün Reaktiflerin Hazırlanması
<ol><li>
Sensör kartuşu nemlendirin.
	<ol>
<li>Bir gecede CO2 37 °C'li olmayan bir kuluç...

<ol>
	<li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origin,+development,+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells.">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li><li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hematopoietic+stem+cell+diet.">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li><li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+change:+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells.">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li><li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell.">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125 (2016).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function.">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li><li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+Mitochondria,+Metabolism,+and+Stem+Cell+Fate.">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li><li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate.">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901 (2015).</li><li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche.">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li><li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells.">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li><li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells.">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche.">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li><li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i.">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li><li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression.">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li><li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis:+therapeutic+targets+at+last.">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li><li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility:+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies.">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li><li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation.">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li><li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism:+Culprits+or+Bystanders.">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li><li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation.">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical &amp; Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li><li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose.">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems.">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3.">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li><li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads.">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li></ol>

Burada, maksimum miktarda saf ve uygun murine LSK HSPC popülasyonunun izolasyonunu ve glikoliz ve mitokondriyal solunumölçümlerini hücre dışı akı analizörü ile gösteriyoruz. Özellikle, protokol LSK HSPCs kullanımı için aşağıdaki teknik sorunları aşar : i) mürin kemik iliği LSK HSPCs düşük frekanslı14, ii) LSK HSPCs düşük bazal metabolik aktivite26, iii) LSK HSPCs27kırılganlığı , ve iv) LSK HSPCs eksikliği<sup class...

En olgun kan hücrelerinin ömrü kısa olduğundan, kan homeostazı kendini yenileme ve hematopoetik kök hücrelerin uzun ömürlü ama nadir popülasyonun farklılaşması dayanır (HSPCs)1. HSPCs quiescent, ancak çoğalmak için hızlı ve kan sisteminin taleplerini sürdürmek için uyarılma üzerine farklılaşma uğrar. Her HSPC hücresel devlet benzersiz bir biyoenerjik talep gerektirir gibi, metabolik değişiklikler HSPC kader kararlarının önemli sürücüleri vardır. Bu nedenle, metabolik plastisite kaybı, quiescence arasındaki dengeyi değiştirerek, kendini yenileme, ve HSPCs farklılaşması, genellikle miyelo yol açar- veya lenfo-proliferatif bozukluklar. Birlikte, HSPC gelişiminin metabolik regülasyon anlayışı hematolojik maligniteler2,3,4,5altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir.
Mitokondriyal solunum ve glikoliz hücre içi reaksiyonları yönlendirmek ve makromolekül sentezi için gerekli yapı taşlarını üretmek için ATP üretir. HSPC'ler farklılaşmışhücreler6 ile karşılaştırıldığında düşük mitokondriyal kütleye sahip olduğundan ve hipoksik kemik iliği nişlerinde quiescence sürdürmek, HSPCs öncelikle glikoliz güveniyor. HSPCs aktivasyonu quiescence kaybı ve hücre döngüsüne sonraki giriş yol açan onların mitokondriyal metabolizmageliştirir. HSPCs bu tür metabolik plastisite yetişkinyaşam6,7,8,9,10,11,12boyunca HSPC havuzunun bakım sağlar. Bu nedenle, HSPC aktivasyonunu ve sağlık durumunu analiz etmek için oksijen tüketim hızı (OCR; oksidatif fosforilasyon indeksi) ve hücre dışı asitleşme oranı (ECAR; glikoliz indeksi) gibi metabolik aktivitelerinin araştırılması önemlidir. Hem OCR hem de ECAR, hücre dışı akı analizörü kullanılarak gerçek zamanlı olarak aynı anda ölçülebilir. Ancak, geçerli yöntem çok sayıda hücre gerektirir ve yapışık hücreler için optimize edilir13. HSPCs fareler den büyük miktarlarda izole edilemez olduğundan14, saf bir popülasyon elde etmek için sıralama gerektiren, non-yapışık hücreler15, ve farklılaşma kaçınarak olmadan bir gecede kültürolamaz16, OCR ve HSPCs ECAR ölçmek zor olmuştur. Burada, metabolik solunum ve birkaç bin murin kemik iliği-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs glikoliz ölçmek için nasıl video tabanlı öğreticiler eşlik etmek için net, adım adım talimatlar bir dizi sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Used for LSK attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used for cell filtration after bone crushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553086</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553019</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553029</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001-HI</td>
			<td>Used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10831</td>
			<td>Used for ficoll gradient separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Used for Lin- separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-14-100UG</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>Used for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td>Used for LSK seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin eFluor 450 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>Used for LSK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Used for cartridge equilibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Used for the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103017100</td>
			<td>Drugs for glycolysis stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103010100</td>
			<td>Drugs for mitochondrial stress test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFp Sensor Cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Used for glycolysis and mitochondrial stress test</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of hematopoietic stem progenitor cell metabolism

Hematopoetik kök ata hücreleri (HSPCs) farklı metabolik plastisite var, hangi onları kan oluşumu taleplerini sürdürmek için bir farklılaşma durumuna quiescent devlet geçiş sağlar. Ancak, sınırlı sayıda ve non-adherent, kırılgan HSPCs için optimize protokollerin eksikliği nedeniyle HSPCs metabolik durumunu (mitokondriyal solunum ve glikoliz) analiz etmek zor olmuştur. Burada, metabolik solunumu (oksijen tüketim oranı) ölçmek için bir dizi açık, adım adım talimatlar salıyoruz; OCR) ve glikoli (ekstrasellüler asitleşme hızı; ECAR) murine kemik iliği-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Bu protokol, murin kemik iliğinden daha yüksek miktarda LSK HSPC sağlar, kuluçka sırasında HSPC'lerin canlılığını artırır, non-yapışık HSPC'lerin hücre dışı akı analizlerini kolaylaştırır ve oksidatif fosforilasyon ve glikolitik yolları hedefleyen ilaçlar için optimize edilmiş enjeksiyon protokolleri (konsantrasyon ve zaman) sağlar. Bu yöntem, kan gelişimi ve hastalıkları sırasında hspcs metabolik durum ve sağlık tahmin sağlar.

Çıkarma yöntemimiz fare başına ~80.000 LSK HSPC'ye kadar hasat yapmamızı sağladı. LSK hücrelerinin canlılığı ve sayıları yöntemimizle geliştirildi, çünkü biz: (1) üst ve alt ekstremitelerden kemik iliği, kalça kemikleri, sternum, göğüs kafesi ve omurga, (2) hücre ölümü ve kümelenmeyi artıracak kırmızı hücre lisis tamponu kullanmaktan kaçındı, (3) mono-çekirdekli hücrelerin yoğunluk gradyan orta ayırma kullanılan ve (4) kümelerde ilgi hücrelerinin kaybına neden olurdu önced...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism at JoVE.com

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoetik kök ata hücreleri (HSPCs) kan oluşumu sırasında metabolik plastisite nedeniyle bir farklılaşma durumuna quiescent devlet geçiş. Burada, HSPC'lerin mitokondriyal solunumunu ve glikolizini ölçmek için optimize edilmiş bir yöntem salıyoruz.

Hematopoetik Kök Atasının Hücre Metabolizmasının Analizi

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Hematopoetik kök ve ata hücrelerindeki metabolik değişiklikler, kan oluşumu taleplerini sürdürmek için, kuskan hallerinden farklılaşma durumuna geçiş yapmalarını sağlar. Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin metabolik plastisitesinde değişiklik hematolojik bozukluklara yol açar. Protokolümüz kan gelişimi ve hastalıkları sırasında metabolik regülasyon ve hematopoetik kök ve ata hücrelerinin sağlığının ölçülmeye yardımcı olacaktır.Kırılgan ve nadir popülasyonoldukları için hematopoetik kök ve ata hücrelerinin mitokondriyal solunum ve glikoliz analizi zordur. Optimize edilmiş protokolümüz, daha yüksek miktarda hematopoetik kök ve ata hücrelerinin rüri kemik iliğinden izolasyonuna olanak sağlar, kuluçka sırasında canlılıklarını artırır, non-yapışık HSPC'lerin hücre dışı akı analizini kolaylaştırır ve oksidatif fosforilasyonun yanı sıra glikolitik yolları hedefleyen ilaç için optimize edilmiş enjeksiyon parametreleri sağlar. Bu prosedüre başlamak için, yardımcı plaka nın kuyularını ve kuyuların etrafındaki odaları steril suyla doldurun.Sensör kartuşu, sensörlerin tamamen suyla kaplı olduğundan emin olmak için yardımcı plakaya batırın. Daha sonra kartuşun yardımcı plakaya batırılmış bir co2 kuluçka makinesine 37 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın. Sınıf II biyogüvenlik kabininde, her bir asayplakasına 40 mikrolitre ticari olarak kullanılabilir %0,1 PLL çözeltisi ekleyin.Kitte verilen kapakla teşp plakayı kapatın ve kapalı plakayı kaputun altında oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, aşırı çözeltikaldırmak ve hava kaputun altında plaka kuru kaldırmak için steril bir vakum tabanlı aspiratör kullanın. Mononükleli murin kemik iliği hücrelerini hasat etmek için, 15 mililitrelik konik tüpe beş mililitre yoğunluk gradyan orta ekleyin.Yavaş yavaş hücrelerin yoğunluk gradyan orta üzerinde bir tabaka olarak kalmasını sağlamak için kemik iliği hücre süspansiyon beş mililitre ekleyin. Santrifüj 500 kez g ve oda sıcaklığında 30 dakika santrifüj mümkün olan en düşük ivme olduğundan emin olun. Taze bir 15 mililitrelik tüp içine mononükleli hücrelerin orta arayüzü Hasat.Daha sonra hücreleri %2 FBS içeren 1X PBS'lik beş mililitre ile yıkayın. 500 kez g ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj. Süpernatant çıkarın ve% 2 FBS içeren 1X PBS 300 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.Daha sonra, bir FACS tüpünde lekesiz veya tek renkli kontrol için hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresi. Mononükleli mürin kemik iliği hücrelerinden LSK HSPC'leri toplamak için, 300 mikrolitre mononükleli kemik iliği hücresine 15 mikrolitre biyotin antikor kokteyli ekleyin. Mononükleli mürin kemik iliği hücrelerinden LSK HSPC'leri toplamak için, 300 mikrolitre mononükleli kemik iliği hücresine 15 mikrolitre biyotin antikor kokteyli ekleyin.Tüpleri buzdolabında bir çalkalayıcının üzerine yerleştirilmiş bir buz kovasına yerleştirin ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra hücrelere %2 FBS içeren önceden soğutulmuş 1X PBS 10 mililitre ekleyin. 500 kez g ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj.Supernatant atın ve hücre pelet in 400 mikrolitre 1X PBS içeren 2% FBS. Kısaca kullanmadan önce anti-biotin mikroboncuklar girdap. Her numuneye 80 mikrolitre mikroboncuk ekleyin ve iyice karıştırın.Ajitasyon ile dört santigrat derecede ek bir 20 dakika kuluçka. Bundan sonra, hücrelere% 2 FBS içeren önceden soğutulmuş PBS 10 mililitre ekleyin. Tüpü 500 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.Supernatant atın ve% 2 FBS içeren PBS bir mililitre hücre pelet resuspend. Manyetik ayırma ünitesini kurarken hücre süspansiyonuna 4 santigrat derecede saklayın. Dört santigrat derecede manyetik destekli hücre sıralama ayırıcı için bir manyetik alana sütun yerleştirin.Dört santigrat derece yerçekimi akışı altında% 2 FBS içeren 1X PBS üç mililitre ile durulayarak manyetik ayırma için sütun hazırlayın. Hücre süspansiyonuna Dört santigrat derecede ıslak ön sütuna ekleyin. Tüm hücrelerin dört santigrat derece sütun geçmesine izin ve 15 mililitrekonik tüp içinde atık toplamak.Daha sonra, dört santigrat derece 1X PBS ve% 2 FBS üç mililitre ile sütun yıkayın. Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. Akışı toplayın ve dört santigrat derecede tutun.500 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca akışı içeren konik tüp santrifüj. Supernatant atın ve 1X PBS 0.5 mililitre içinde hücreleri yeniden askıya 2% FBS ve bir FACS tüpü için süspansiyon aktarın. Sonra her 10 milyon hücre ye 24 mikrolitre LSK antikor kokteylekleyin.Bir saat boyunca ajitasyon ile dört derece santigrat karanlıkta folyo ve kuluçka ile tüp kapağı. Bundan sonra, FACS tüpüne %2 FBS ile üç mililitre 1X PBS ekleyin. 500 kez g ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj.Supernatant atın ve% 2 FBS içeren 1X PBS bir mililitre antikor etiketli hücreleri yeniden askıya. Sıralamadan hemen önce, hücre süspansiyonuna mililitre propidium iyodür başına bir miligram lık bir mikrolitre ekleyin ve FACS tüpünün içeriğini filtrelemek için 40 mikrometrelik bir süzgeç kullanın. İlk olarak, toplanan LSK hücrelerini 500 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj edin.Supernatant atın ve 40 mikrolitre başına en az 70,000 hücre son konsantrasyona tam ortamda hücreleri yeniden askıya. Bir PLL kaplı sekiz kuyu plaka kuyuları içine bu hücre süspansiyon Tohum 40 mikrolitre tüm köşe kuyuları boş bırakmak için emin olun. 450 kez g ve oda sıcaklığında bir dakika için plaka santrifüj.Hücrelerin kuyuların dibine bağlı olduğundan emin olmak için ters bir mikroskop kullanın. Bundan sonra, her kuyudaki hücrelere 135 mikrolitre tam ortam ekleyerek her kuyunun son hacmini 175 mikrolitreye çıkarın. Plakanın iki köşesine boşluk olarak 175 mikrolitre tam ortam ekleyin.Hücreleri CO2 olmayan bir kuluçka makinesinde 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, metin protokolünün tablo iki ve tablo üç tablosunda belirtildiği gibi plakanın her kuyusuna ilaç eklemek için analizör için bir program ayarlayın. Mitokondriyal stres testi için, her iyi iki mikromolar oligomisin, 1,5 mikromolar FCCP ve 0.5 mikromolar ya rotenon ve anti-mycin A son konsantrasyonu var gibi inkübatör yarar plakasında sensör kartuşunu almak gerektiği gibi.Kapağı sensör kartuşundan çıkarın ve alet tepsisinin üzerine yerleştirin. 20 dakika sürecek kalibrasyon işlemine başlayın. Kalibrasyon tamamlandığında, yardımcı plakayı çıkarın ve LSK hücrelerini içeren bir asayme plakası ile değiştirin.Daha önce ayarlanmış programı başlatmaya devam edin. Program tamamlandığında, verileri alın ve analiz edin. Bu çalışmada, maksimum miktarda canlı murine LSK HSPC izole edilmiş ve glikoli ve mitokondriyal metabolizması hücre dışı akı analizörü ile ölçüldü.Ekstrasellüler akı analizi geleneksel olarak yapışık hücreler için kullanılmasına rağmen, bu yöntem LSK HSPC'leri hücre dışı akının ölçümü ve böylece LSK HSPC'lerin metabolik sağlığına olanak tanıyan PLL kaplı kuyulara yapışık hale getirir. Bazal ve stres koşullarında hücre dışı asitleşme hızı ile oksijen tüketim hızı ve glikoliz yoluyla mitokondriyal solunumu ölçmek için glikoliz ve mitokondriyal solunumu engelleyen ilaçlar sırayla enjekte edilir. Beklendiği gibi, ekstrasellüler asitleşme oranıbazal düzeyi lsk HSPCs glikoz kültürlü ve negatif ortamda kültürlü olanlara göre pozitif medya pirüvat için daha yüksektir.Glikoz enjeksiyonu pozitif ortamda kültürlenen hücreler için ekstrasellüler asitleşme oranını değiştirmedi, ancak negatif ortamda hücrelerin glikoliz artırdı. Ancak, bu hücrelerin bazal düzeyi hala pozitif grupta daha düşük kaldı. Oligomisin enjeksiyonu glikoliz pozitif grupta maksimum düzeyde aktive, ancak negatif grubu etkilemedi.2-DG'de glukoz analogu ile enjeksiyon ekstrasellüler asitleşme oranını glikolitik olmayan düzeylere geri döndürmüş. Mitokondriyal stres testi için, oligomisin enjeksiyonu mitokondriyal membranı hiperpolarize ederek ETC kompleksleri arasında daha fazla proton pompalanmasını önler ve böylece mitokondriyal solunum oranını azaltır. HÜCRELER mitokondriyal membran potansiyelini kurtarmaya çalışırken FCCP enjeksiyonu oksijen tüketim hızını maksimuma çıkarır.Diğer iki elektron taşıma zinciri inhibitörlü enjeksiyon, mitokondriyal solunumun tamamen durmasına ve böylece oksijen tüketim hızının minimum seviyeye geri döndürülmesini sağlar. Mononükleer hücre izolasyonu için kırmızı hücre lisis tamponu kullanmaktan kaçının. Küme oluşumunu önlemek ve LSK kaybını azaltmak için Ficoll gradyan ayrımını öneriyoruz.Optimize edilmiş metodumuzu kullanarak, nadir ve kırılgan hematopoetik kök ve progenitor hücrelerin mitokondriyal solunum ve glikoliz ölçebilir ve metabolik ipuçlarının incelenmesi normal ve malign hematopoemi düzenler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Ölümsüzleştirdi Multipotent Otic Progenitor Hücrelerde Farklılaşma başlatılıyor

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma<sup&gt; yüksek</sup&gt; Yağ türetilmiş Kök Hücreler (TSK)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Rekabetçi Nakli Hematopoetik Kök Hücre Fitness değerlendirin

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu Hemoglobinopati olan hastalar için sonra kalan donör Erythroid progenitör hücre algılama

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Zebra balığı embriyo geliştirilmesinde bir Vitro tahlil hematopoetik kök ve yaratıcı Quantitate gelişimi (HSPCs) hücreleri

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...